N端去糖基化修飾對三陰型乳腺癌中PD-L1蛋白表達的影響

馬怡君，周彩婷，韓 微，王 磊，陳 勇，黃天宇

三陰型乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)是一種特殊類型的乳腺癌，目前，臨床上免疫治療為其優(yōu)勢治療[1]。免疫治療的開展以及對其治療療效的評估均需通過免疫組化檢測程序性死亡配體1(programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1)在癌細(xì)胞中的表達[2]，但臨床實踐發(fā)現(xiàn)PD-L1在TNBC組織中的表達不佳，導(dǎo)致部分TNBC患者無法從免疫治療中獲益。臨床最新研究發(fā)現(xiàn)[3]，將肺惡性腫瘤組織進行去糖基化后再行PD-L1的免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞陽性比例和免疫組化評分均升高且與免疫治療的療效呈正相關(guān)。因此，本實驗將TNBC組織進行去糖基化處理后行PD-L1的免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)其表達高于未處理的腫瘤組織，即在一定程度上減少了假陰性率，使得更多的TNBC患者受益，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集2019～2021年揚州大學(xué)附屬醫(yī)院存檔的67例TNBC原發(fā)灶腫瘤組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織。其中免疫組化明確ER、PR、HER-2均陰性的判讀標(biāo)準(zhǔn)：PR、ER陰性是指其免疫組化標(biāo)記>10%腫瘤細(xì)胞陽性且Ki-67增殖指數(shù)﹤14%；HER-2陰性是指其免疫組化結(jié)果判讀為(0)或(1+)[4]。原發(fā)灶腫瘤組織中有30例腫瘤直徑≤2 cm，37例>2 cm；腫瘤分化程度：21例高分化，25例中分化，21例低分化；臨床分期：13例Ⅰ期，31例Ⅱ期，23例Ⅲ期；35例為浸潤性小葉癌，32例為浸潤性導(dǎo)管癌；其中45例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，22例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；其中21例發(fā)生前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移(即淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織直徑>0.2 mm且≤2 mm[5])，24例發(fā)生宏轉(zhuǎn)移(即淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織直徑>2 mm[5])；22例轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)直徑≤1 cm，23例直徑>1 cm；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤分化程度：24例為中分化，21例為低分化；臨床分期：24例為Ⅱ期，21例為Ⅲ期；22例為浸潤性小葉癌，23例為浸潤性導(dǎo)管癌。

1.2 方法67例TNBC原發(fā)灶腫瘤組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定及梯度乙醇(75%～95%)脫水，組織包埋成蠟塊后連續(xù)5 μm厚切片。免疫組化染色采用EnVision兩步法，一抗PD-L1為兔單克隆抗體(上海艾博抗公司)。組織去糖基化處理步驟：首先將白片在40 ℃溫箱中孵育過夜，然后在60 ℃溫箱中孵育1 h后依次進行二甲苯脫蠟、乙醇脫水和蒸餾水水化，之后應(yīng)用熱變性方法，用PBS將切片洗滌3次后，在95 ℃下用1倍糖蛋白變性緩沖液孵育5 min，再用PBS洗滌3次，然后將5%重組肽-N糖苷酶F(PNGase F)(P0708，新英格蘭生物實驗室)溶解于糖基化緩沖液中，將切片在37 ℃下用此溶液洗滌1 h，后續(xù)步驟同上述常規(guī)免疫組化法。最后將行常規(guī)免疫組化染色者為常規(guī)組，去糖基化處理后行免疫組化染色者為去糖基化組，鏡下觀察PD-L1在兩組腫瘤組織中的表達。

1.3 判讀標(biāo)準(zhǔn)PD-L1陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：(1)癌細(xì)胞胞膜和(或)胞質(zhì)染色呈明顯的黃棕色，且細(xì)胞著色率≥5%；(2)腫瘤間質(zhì)為陽性時，也可判定為PD-L1陽性。PD-L1陰性判定標(biāo)準(zhǔn)：(1)癌細(xì)胞著色率不超過5%；(2)癌細(xì)胞不著色。計算細(xì)胞著色率的方法：在(400×)鏡下計數(shù)3個視野的染色細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值，并計算均值[6]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.00軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，例數(shù)采用百分率(%)表示，利用χ2檢驗進行數(shù)據(jù)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)組與去糖基化組中PD-L1的表達67例TNBC原發(fā)灶腫瘤組織PD-L1免疫組化染色結(jié)果顯示，常規(guī)組23例陰性(圖1A)，44例陽性，其中20例呈弱陽性，24例呈強陽性；去糖基化處理后23例陰性病例中10例陽性(圖1B)，20例弱陽性病例中12例強陽性；45例TNBC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織PD-L1免疫組化染色結(jié)果顯示，常規(guī)組17例陰性(圖1C)，28例陽性，其中17例弱陽性，11例強陽性；去糖基化處理后17例陰性病例中7例陽性(圖1D)，17例弱陽性(圖1E)病例中10例強陽性(圖1F)。

ABCDEF

2.2 常規(guī)組與去糖基化組PD-L1表達與TNBC原發(fā)灶腫瘤組織臨床病理特征的關(guān)系67例TNBC原發(fā)灶腫瘤組織PD-L1免疫組化染色結(jié)果顯示，PD-L1在常規(guī)組與去糖基化組中的表達與腫瘤直徑、分化程度、病理類型、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性(P>0.05)，腫瘤組織去糖基化處理后，PD-L1在各臨床分組中的陽性率均有所提高，增加5.7%～19.1%不等(表1)。

表1 常規(guī)組與去糖基化組PD-L1表達與TNBC臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 常規(guī)組與去糖基化組PD-L1表達與TNBC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織臨床病理特征的關(guān)系45例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織PD-L1免疫組化染色顯示，PD-L1在常規(guī)組和去糖基化組中的表達與淋巴結(jié)直徑、腫瘤分化程度、轉(zhuǎn)移灶分類、臨床分期、病理類型、分化程度均無相關(guān)性(P>0.05)，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織經(jīng)去糖基化處理后，PD-L1在各臨床分組中的陽性率均有所提高，增加幅度13.7%～21.7%不等(表2)。

表2 常規(guī)組與去糖基化組PD-L1表達與TNBC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

3 討論

TNBC是一種PR、ER和HER-2免疫組化檢測均為陰性的乳腺癌[7]。目前乳腺癌術(shù)后臨床通常以靶向治療和內(nèi)分泌治療作為主要治療方式[8]，但由于TNBC細(xì)胞不僅分化差而且基因也不夠穩(wěn)定，導(dǎo)致患者術(shù)后不能采用上述兩種臨床常用治療方式，并且TNBC比其他類型的乳腺癌更易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[9]，所以臨床迫切需要新的治療方式。有研究發(fā)現(xiàn)，TNBC在激活免疫系統(tǒng)方面具有優(yōu)勢，這與其擁有較高的異質(zhì)性和可以選擇突變的基因位點相關(guān)，因此也擁有更好的抗原性，從而使免疫治療成為目前TNBC臨床術(shù)后的優(yōu)勢治療。

現(xiàn)階段有研究發(fā)現(xiàn)，對PD-L1陽性的TNBC患者進行免疫治療后，獲得較為滿意的臨床效果[10]?，F(xiàn)臨床多采用阿特麗珠單抗(atezolizumab)及帕博麗珠單抗(pembrolizumab)進行免疫治療[11]，其中有研究表明[12]，PD-L1陽性TNBC患者如果能在早期使用帕博利珠單抗，可明顯提高藥物的反應(yīng)率。并且在TNBC中PD-L1表達與其不良預(yù)后密切相關(guān)[13]。因此，越早實施免疫治療越有利于患者預(yù)后。我們需要解決的是PD-L1在TNBC組織中的表達呈假陰性或不穩(wěn)定性，讓更多的患者滿足免疫治療條件，盡早開展治療。

最近有實驗首先提取乳腺癌中的相關(guān)細(xì)胞(BT549細(xì)胞、MB231細(xì)胞以及A431細(xì)胞)，然后將多種糖基化相關(guān)抑制劑作用于上述細(xì)胞，最后證實PD-L1的糖基化修飾是N端糖基化[14]。N端糖基化作為一種生物合成分泌，是在高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進行的[15]，一旦其發(fā)生失調(diào)，其蛋白質(zhì)將立即被轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中降解[16]。腫瘤組織中PD-L1表達不佳[17]的原因是其能夠影響PD-L1蛋白結(jié)合抗PD-L1抗體。但有研究將肺癌的腫瘤細(xì)胞進行肽-N-糖苷酶F(PNGase F)去糖基化處理后[3]，發(fā)現(xiàn)其腫瘤細(xì)胞中的PD-L1表達信號明顯增強，而且其PD-L1的表達水平與包括帕博麗珠單抗和阿特麗珠單抗在內(nèi)的免疫治療療效呈明顯正相關(guān)性。

本實驗發(fā)現(xiàn)，對進行去糖基化處理的TNBC原發(fā)灶腫瘤組織及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織進行PD-L1免疫組化染色，原發(fā)灶腫瘤組織中PD-L1的陽性率由65.6%提高至80.5%，強陽性率由35.8%提高至53.7%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織中PD-L1的陽性率由66.2%提高至77.8%，強陽性率由24.4%提高至46.6%，這表明經(jīng)去糖基化處理后，PD-L1的免疫組化陽性率不僅在原發(fā)灶腫瘤組織中明顯增強，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織中也明顯增強。這也說明將組織進行去糖基化處理后再進行免疫組化染色的方式不僅適用于原發(fā)腫瘤組織，也適用于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織。雖然差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但有部分PD-L1陰性的TNBC患者確實能夠通過這種方式滿足免疫治療的條件而獲益。

綜上，本實驗對TNBC腫瘤組織進行去糖基化處理后，不僅可以提高TNBC組織中PD-L1的表達，讓更多的TNBC患者符合免疫治療條件，而且可以更好地預(yù)測免疫治療的臨床療效。這無疑給更多的TNBC患者帶來更多臨床治療的可能性。所以，對TNBC患者進行PD-L1免疫組化檢查前，應(yīng)推廣使用去糖基化處理腫瘤組織的方法，以提高PD-L1的陽性率。后期我們將繼續(xù)擴大樣本量或者改良去糖基化方法來進一步完善臨床研究。