基于含量測定和化學(xué)計(jì)量法的地骨皮多指標(biāo)成分分析

王亞飛，楊平榮，，楊耘，宋平順，倪琳

1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，國家食藥監(jiān)局中藥材中藥飲片質(zhì)量重點(diǎn)控制實(shí)驗(yàn)室，甘肅省中藏藥檢驗(yàn)檢測技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅省中藥品質(zhì)與安全評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省婦幼保健院藥學(xué)部，甘肅 蘭州 730000

地骨皮為茄科植物枸杞Mill.或?qū)幭蔫坭絃.的干燥根皮，主產(chǎn)于山西、河北、河南、甘肅、寧夏及華北等地，味甘、性寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，有涼血除蒸、清肺降火功效，主要用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、肺熱咳嗽、咯血及內(nèi)熱消渴等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，地骨皮具有降低血糖、降血壓、解熱鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等作用。地骨皮的主要成分包括黃酮、有機(jī)酸、多肽類、甾醇、香豆素和揮發(fā)油，然而地骨皮的有效成分尚不明確，2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）未規(guī)定含量測定項(xiàng)。

地骨皮甲素和地骨皮乙素為精胺生物堿，具有糾正免疫紊亂、降血壓、保護(hù)NMDA誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元損傷等作用。阿魏酸、咖啡酰丁二胺、N-反式阿魏酰酪胺、綠原酸和肉桂酸等為酚酰胺類和酚酸類化合物。酚酰胺類和酚酸類化合物具有降血壓、抗炎、抗氧化和保護(hù)小膠質(zhì)細(xì)胞等藥理活性。東莨菪亭為香豆素類化合物，香豆素類化合物具有廣泛的藥理活性，如抗炎、退熱、鎮(zhèn)靜等。本研究采用HPLC對(duì)不同產(chǎn)地的42批地骨皮進(jìn)行研究，建立地骨皮中8種化學(xué)成分含量測定的方法，并采用主成分分析、聚類分析和偏最小二乘判別分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行分析，為地骨皮的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（美國Waters公司，型號(hào)ACQUITYARC），電子天平（德國賽多利斯公司，型號(hào)QUINTIX224-1CN、secura125-1cn），Synergi 4u Hydro-RP80A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

地骨皮甲素（批號(hào)W01N9Z73848），上海源葉生物科技有限公司，含量≥98%；地骨皮乙素（批號(hào)P25F11F108939），上海源葉生物科技有限公司，含量≥98%；咖啡酰丁二胺（批號(hào)DST200512-015），成都德思特生物技術(shù)有限公司，含量≥98%；綠原酸（批號(hào)110753-201817），中國食品藥品檢定研究院，含量以96.8%計(jì)；東莨菪亭（批號(hào)BP1275），成都瑞芬思生物科技有限公司，純度＞98%；阿魏酸（批號(hào)110773-201915），中國食品藥品檢定研究院，含量以99.4%計(jì)；N-反式阿魏酰酪胺（批號(hào)WK920033108），四川省維克奇生物科技有限公司，含量≥98%；肉桂酸（批號(hào)110786-201604），中國食品藥品檢定研究院，含量以98.8%計(jì)。乙腈（批號(hào)JA106730），美國supelco公司，色譜純；三氟乙酸（批號(hào)G2023076），阿拉丁試劑（上海）有限公司，色譜純；超純水（批號(hào)SC10613102200012），屈臣氏。

地骨皮樣品共42批，本實(shí)驗(yàn)室于2019－2021年采集，經(jīng)甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院馬瀟主任鑒定為茄科植物枸杞Mill.或?qū)幭蔫坭絃.的干燥根皮，產(chǎn)地信息見表1。

表1 42批地骨皮樣品產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備

分別取咖啡酰丁二胺、綠原酸、地骨皮乙素、地骨皮甲素、東莨菪亭、阿魏酸、肉桂酸和N-反式阿魏酰酪胺對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇配制成每1 mL含咖啡酰丁二胺0.51 mg、綠原酸6.97 mg、地骨皮乙素10.68 mg、地骨皮甲素2.03 mg、東莨菪亭0.03 mg、阿魏酸0.03 mg、肉桂酸0.01 mg、N-反式阿魏酰酪胺0.01 mg的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液制備

取樣品粉末（過3號(hào)篩）約1.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇50 mL，加熱回流1 h，過濾后將濾液蒸干，殘留物用甲醇溶解，定容至2 mL，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.3 色譜條件

采用Synergi 4u Hydro-RP80A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.5%三氟乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～3 min，10%A；3～20 min，10%～11%A；20～30 min，11%～12%A；30～50 min，12%～14%A；50～60 min，14%～16%A；60～70 min，16%～18%A；70～80 min，18%～10%A），柱 溫30℃，流速1.0 mL/min，檢測波長278 nm。理論塔板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。色譜圖見圖1。

圖1 地骨皮中8種成分HPLC圖

2.1.4 線性關(guān)系考察

精密取各對(duì)照品適量，加甲醇溶解，配制成每1 mL含咖啡酰丁二胺3.01 mg、綠原酸35.88 mg、地骨皮乙素20.15 mg、地骨皮甲素4.12 mg、東莨菪亭0.15 mg、阿魏酸0.13 mg、肉桂酸0.04 mg、N-反式阿魏酰酪胺0.04 mg的混合對(duì)照品貯備液，分別精密吸取上述混合對(duì)照品貯備液，用甲醇稀釋成1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶50的混合對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以各對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，8種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表2，表明各成分在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 8種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.1.5 精密度試驗(yàn)

分別吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測得咖啡酰丁二胺、綠原酸、地骨皮乙素、地骨皮甲素、東莨菪亭、阿魏酸、肉桂酸和N-反式阿魏酰酪胺峰面積RSD分別為0.78%、0.45%、0.67%、1.43%、0.97%、0.49%、1.78%、2.01%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取地骨皮藥材粉末，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，測得咖啡酰丁二胺、綠原酸、地骨皮乙素、地骨皮甲素、東莨菪亭、阿魏酸、肉桂酸和N-反式阿魏酰酪胺含量的RSD分別為1.36%、1.75%、0.35%、0.78%、1.23%、1.66%、1.29%、1.37%，表明該方法重復(fù)性好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于制備后0、2、4、8、12 h進(jìn)樣10 μL，測得咖啡酰丁二胺、綠原酸、地骨皮乙素、地骨皮甲素、東莨菪亭、阿魏酸、肉桂酸和N-反式阿魏酰酪胺峰面積的RSD分別為1.28%、1.05%、1.92%、1.73%、0.29%、1.34%，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取各成分含量已知的樣品（22號(hào)）粉末18份，每份約0.75 g（分別含咖啡酰丁二胺0.79 mg、綠原酸8.48 mg、地骨皮乙素13.47 mg、地骨皮甲素3.00 mg、東莨菪亭0.035 mg、阿魏酸0.031 mg、肉桂酸0.006 mg和N-反式阿魏酰酪胺0.002 mg），分為3組，分別加入各成分含量已知的高（120%）、中（100%）、低（80%）濃度混合對(duì)照品溶液1 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 8種成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.1.9 樣品含量測定

取不同產(chǎn)地樣品粉末（過3號(hào)篩）各約1.5 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，分別記錄8種成分的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算各成分含量，結(jié)果見表4?？梢钥闯?，地骨皮樣品中8種成分的含量跨度均較大，故采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)不同產(chǎn)地地骨皮樣品中8種成分含量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表4 地骨皮樣品中8種成分含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）

2.2 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.2.1 聚類分析

運(yùn)用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)不同產(chǎn)地地骨皮8種成分含量進(jìn)行聚類分析。以平方歐氏距離計(jì)算，連接方法為平均聯(lián)接，不同產(chǎn)地地骨皮中8種成分含量的系統(tǒng)聚類分析結(jié)果見圖2。可以看出，不同產(chǎn)地的地骨皮可以被較好地分開。當(dāng)類間距離為12～25時(shí)，樣品可分為兩類：一類為甘肅、寧夏、河北樣品，一類為安徽、湖北樣品。當(dāng)類間距離為5時(shí)，樣品可分為4類：一類為甘肅樣品，一類為安徽樣品，一類為湖北樣品，最后一類包含甘肅、寧夏和河北樣品；當(dāng)類間距離為2時(shí)，該類樣品可獨(dú)立分為甘肅、寧夏、河北樣品。除6號(hào)和36號(hào)樣品外，其余40批樣品的聚類結(jié)果均與產(chǎn)地具有良好相關(guān)性。

圖2 不同產(chǎn)地地骨皮樣品8種成分含量系統(tǒng)聚類分析

2.2.2 各成分含量散點(diǎn)

運(yùn)用Graphpad Prism 8軟件繪制不同產(chǎn)地地骨皮樣品中8種成分含量的散點(diǎn)圖，結(jié)果見圖3。可直觀看出不同產(chǎn)地地骨皮各成分含量的差異。其中，咖啡酰丁二胺、綠原酸、地骨皮乙素和地骨皮甲素4種成分的含量隨產(chǎn)地的變化較為明顯：甘肅、寧夏和河北的樣品含量相近且較低，安徽的樣品含量高于甘肅、寧夏和河北，湖北的樣品含量最高。東莨菪亭、阿魏酸、肉桂酸和N-反式阿魏酰酪胺4種成分含量的產(chǎn)地差異不明顯，除個(gè)別樣品外，其余含量均較在小范圍內(nèi)波動(dòng)。表明在本試驗(yàn)所測定的8種成分中，前4種成分與產(chǎn)地相關(guān)性較強(qiáng)。

圖3 不同產(chǎn)地地骨皮樣品8種成分含量散點(diǎn)（mg/g）

2.2.3 主成分分析

運(yùn)用SPSS25.0和SIMCA13.0軟件進(jìn)行主成分分析（PCA），結(jié)果見圖4?？梢钥闯?，除寧夏和湖北的樣品有部分重疊之外，其他幾個(gè)產(chǎn)地的地骨皮可較好分開。采用最大方差法對(duì)特征值及因子載荷矩陣進(jìn)行旋轉(zhuǎn)解輸出，結(jié)果見表5、表6。依據(jù)表5的特征值和貢獻(xiàn)率分析，前3個(gè)特征值均大于1，且分別代表了變量總方差的45.329%、17.868%、13.586%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)76.782%，可以代表地骨皮的整體信息，客觀反映了樣品的內(nèi)在質(zhì)量，故選擇前3個(gè)主成分因子進(jìn)行分析。由表6可知，主成分1中咖啡酰丁二胺、綠原酸和地骨皮乙素的貢獻(xiàn)值較大，主成分2中肉桂酸的貢獻(xiàn)值較大，主成分3中阿魏酸的貢獻(xiàn)值較大。

圖4 不同產(chǎn)地地骨皮樣品PCA散點(diǎn)

表5 不同產(chǎn)地地骨皮樣品PCA特征值和貢獻(xiàn)率

表6 不同產(chǎn)地地骨皮樣品PCA旋轉(zhuǎn)變換后的因子載荷矩陣

2.2.4 偏最小二乘判別分析

運(yùn)用SIMCA13.0軟件進(jìn)行偏最小二乘判別分析（PLS-DA），建立監(jiān)督模式識(shí)別方法的PLS-DA模型。模型共提取3個(gè)主成分，X矩陣解釋率RX為0.717，模型穩(wěn)定性參數(shù)RY為0.384，模型預(yù)測能力參數(shù)Q為0.15，表明所建的PLS-DA模型解釋率和預(yù)測率一般。設(shè)置分類Y矩陣變量隨機(jī)排列200次做置換檢驗(yàn)，結(jié)果見圖5。R擬合直線在Y軸的截距為0.0735＜0.3，Q擬合直線在Y軸的截距為-0.211＜0.05，說明所建模型可靠，不存在過度擬合現(xiàn)象。PLS-DA散點(diǎn)見圖6?？梢钥闯觯?2批樣品僅有3批不在95%置信區(qū)間內(nèi)，除寧夏和河北樣品有部分重疊外，其余產(chǎn)地樣品均可明顯區(qū)分。變量重要性投影（VIP）可直觀體現(xiàn)各元素引起樣品差異的權(quán)重大小，元素VIP值＞1表明其對(duì)樣品分類結(jié)果權(quán)重影響率＞50%，即對(duì)分類結(jié)果影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為差異標(biāo)志物。8種成分VIP見圖7。42批地骨皮的差異標(biāo)志成分為綠原酸、地骨皮甲素、咖啡酰丁二胺、地骨皮乙素和東莨菪亭。

圖5 不同產(chǎn)地地骨皮樣品PLS-DA置換檢驗(yàn)

圖6 不同產(chǎn)地地骨皮樣品PLS-DA散點(diǎn)

圖7 不同產(chǎn)地地骨皮樣品8種成分VIP

3 討論

本試驗(yàn)比較了不同類型的C18柱對(duì)地骨皮成分的分離效果，普通的C18柱對(duì)地骨皮甲素、地骨皮乙素等成分分離效果較差，飛諾美的C18端基封尾柱對(duì)地骨皮中各成分分離效果較好。此外，本試驗(yàn)采用不同比例的甲醇為提取溶劑在同一提取方法下進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)甲醇提取的樣品中各峰面積相對(duì)較高；比較了不同提取方法（超聲法、熱回流法、冷浸法）下的提取率和色譜峰情況，發(fā)現(xiàn)熱回流法提取的色譜峰基線較平穩(wěn)且峰面積相對(duì)較高；比較了不同波長下各物質(zhì)的吸收峰，發(fā)現(xiàn)在278 nm波長處各物質(zhì)均具有較強(qiáng)的吸收。所以采用上述各項(xiàng)最佳條件作為最終試驗(yàn)條件。

在本試驗(yàn)的提取條件和色譜條件下，咖啡酸和香草酸均有較好的提取率和紫外吸收，但因?yàn)榭Х人岷拖悴菟嵩诖艘合鄺l件下出峰時(shí)間幾乎相同，故試驗(yàn)中將這2種成分刪去。今后可通過優(yōu)化液相條件，將咖啡酸和香草酸作為檢測指標(biāo)。

本研究建立PLS-DA模型對(duì)不同產(chǎn)地地骨皮樣品進(jìn)行分析，模型預(yù)測參數(shù)＜0.5，但依據(jù)散點(diǎn)圖可知，除寧夏和河北兩地樣品有重疊外，甘肅、湖北和安徽的樣品均能被較好地判別，所以該模型仍可在本試驗(yàn)涵蓋范圍內(nèi)被用于未來地骨皮樣品產(chǎn)地的初步判別或依據(jù)產(chǎn)地初步估算地骨皮中多種成分的大致含量。

趙曉玲等測定了不同來源地骨皮中地骨皮甲素、地骨皮乙素以及阿魏酸的含量，但因?yàn)閷?duì)照品濃度以及測定條件等原因，作者將地骨皮甲素和地骨皮乙素作為同一指標(biāo)進(jìn)行了檢測。蘇磊等測定了地骨皮中咖啡酰丁二胺、地骨皮乙素和綠原酸的含量。張華磊等測定了地骨皮中東莨菪內(nèi)酯的含量。本試驗(yàn)在相關(guān)研究基礎(chǔ)上，對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行了探索和優(yōu)化，建立了同時(shí)測定地骨皮中8種化學(xué)成分含量的方法，選取5個(gè)省份的樣品進(jìn)行檢測，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了多種化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，結(jié)果表明對(duì)產(chǎn)地影響較大的主成分為咖啡酰丁二胺、綠原酸、地骨皮乙素、肉桂酸和阿魏酸5種；42批地骨皮樣品依據(jù)產(chǎn)地分類，其差異標(biāo)志成分為綠原酸、地骨皮甲素、咖啡酰丁二胺、地骨皮乙素和東莨菪亭5種。在PCA和PLS-DA中，除寧夏和河北兩地的樣品有部分重疊外，其余產(chǎn)地的地骨皮樣品分類效果均較好。

本試驗(yàn)建立HPLC方法同時(shí)對(duì)地骨皮中8種成分的含量進(jìn)行測定，該方法可用于地骨皮藥材質(zhì)量的全面評(píng)價(jià)。結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析可知不同產(chǎn)地的地骨皮藥材存在較明顯質(zhì)量差異，所以地骨皮藥材的產(chǎn)地溯源是必要的。但本試驗(yàn)收集的地骨皮樣品產(chǎn)地僅有5個(gè)省份，而對(duì)河南、山西等主要產(chǎn)區(qū)未涉及，今后需進(jìn)一步拓寬樣品產(chǎn)地。本試驗(yàn)對(duì)甘肅、安徽和湖北三地的樣品分類效果較好，寧夏和河北樣品存在部分重疊，提示所測定的8種成分并非不同產(chǎn)地樣品的全部差異性數(shù)據(jù)，對(duì)于不能較好區(qū)分產(chǎn)地的樣品，可進(jìn)一步研究其無機(jī)元素含量、紅外光譜等以進(jìn)行區(qū)分。