熱補(bǔ)針法對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎寒證模型兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT3、SOD2、CAT表達(dá)的影響

袁博，張楓帆，張星華，姚小強(qiáng)，井維堯，杜小正

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵犯小關(guān)節(jié)為主的免疫系統(tǒng)疾病，常呈對(duì)稱侵襲，主要涉及關(guān)節(jié)滑膜、關(guān)節(jié)軟骨損傷，并伴有皮膚、血管和內(nèi)臟器官損害。數(shù)據(jù)顯示，全球約1%人口患RA，發(fā)病率高，疾病后期出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形、功能喪失，嚴(yán)重?fù)p害患者的身心健康與生存質(zhì)量。RA發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究顯示，氧化應(yīng)激在RA發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，沉默信息調(diào)節(jié)因子3（SIRT3）通過介導(dǎo)活性氧（ROS）清除參與RA發(fā)病。SIRT3與超氧化物歧化酶（SOD）2和過氧化氫酶（CAT）等ROS清除酶的活性及表達(dá)關(guān)系密切，調(diào)控SIRT3的表達(dá)能調(diào)節(jié)ROS清除酶的活性，從而發(fā)揮抗氧化作用。熱補(bǔ)針法是鄭魁山教授臨床治療RA的經(jīng)驗(yàn)法，具有補(bǔ)益正氣、溫陽散寒作用，由“燒山火”“進(jìn)火法”簡化改良而成，臨床治療陽虛致寒痹證療效較好。課題組前期研究表明，熱補(bǔ)針法對(duì)RA模型兔具有相對(duì)特異性干預(yù)作用?；诖?，本研究以RA寒證模型兔為研究對(duì)象，觀察熱補(bǔ)針法對(duì)兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT3、SOD2、CAT表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其干預(yù)RA的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

30只健康普通級(jí)雄性新西蘭兔，2～3月齡，體質(zhì)量（2.5±0.5）kg，購于蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（甘）2013-0002。飼養(yǎng)于溫度（20±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%環(huán)境，室內(nèi)采光、通風(fēng)均良好，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 主要試劑與儀器

DEPC水（貨號(hào)7732-185，德國Sigma公司），弗氏完全佐劑（FCA，貨號(hào)F5881，德國Sigma公司），卵蛋白干粉（貨號(hào)A5253-250G，德Sigma公司），TRIeasyTotal RNA Extraction Reagent（貨 號(hào)T0817211，上海翌圣生物），HifairⅡ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（貨號(hào)T081721，上海翌圣生物），HieffqPCR SYBR Green Master Mix（貨號(hào)10606ES60，上海翌圣生物）。華成牌一次性針灸針（0.22 mm×25 mm，北京珞亞山川醫(yī)療器械有限公司），熱刺痛儀（型號(hào)PL-200，成都泰盟軟件有限公司），彩色超聲診斷儀（型號(hào)8～12 MHz，德國百盛公司），超微量分光光度計(jì)（型號(hào)NanoDrop One，美國Thermo公司），實(shí)時(shí)定量PCR儀（型號(hào)StepOne Plus，美國Agilent公司）。

1.3 造模及分組

30只兔采用隨機(jī)數(shù)字表法選取6只作為正常組，剩余24只采用卵蛋白誘導(dǎo)聯(lián)合低溫冷凍法復(fù)制RA寒證模型。實(shí)驗(yàn)前3 d，剪去肩胛區(qū)兔毛，于肩背部均勻選取6個(gè)點(diǎn)，2%碘酒、75%酒精消毒，每點(diǎn)注射0.2 mL乳化劑（4 mg/mL卵蛋白溶液與等量FCA混合，充分震蕩）。14 d后以相同方式、相同劑量重復(fù)皮下注射1次。6 d后清理兔雙側(cè)后腿膝關(guān)節(jié)體毛，用2%碘酒、75%酒精消毒，定位膝關(guān)節(jié)腔，注入20 mg/mL卵蛋白生理鹽水溶液0.4 mL，24 h內(nèi)膝關(guān)節(jié)即出現(xiàn)紅腫觸痛。造模后第2日，2%碘酒、75%酒精消毒后腿膝關(guān)節(jié)，四周予冷凍處理，采用冰袋圍置冷凍1.5 h、45℃溫水復(fù)溫5 min，每日1次，共14 d。造模兔出現(xiàn)精神萎靡，身體蜷縮，膝關(guān)節(jié)腫脹、局部青紫、周徑明顯變大、皮溫不高，兩后肢匍匐跛行，觸之有躲避行為，表示成功建立RA寒證模型。將24只成模兔隨機(jī)分為模型組、平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針法組，每組6只。

1.4 干預(yù)

正常組、模型組不予干預(yù)，只做與各針刺組相同的抓取、固定；各針刺組將兔固定，2%碘酒、75%酒精消毒，毫針90°（深度8～12 mm）直刺雙側(cè)“足三里”。平補(bǔ)平瀉組：予平補(bǔ)平瀉法針刺。針刺得氣后，前后均勻捻轉(zhuǎn)針體，防止單向捻轉(zhuǎn)，指力均勻適中，角度控制在180°～360°，頻率60～90 r/min。捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組：予捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法針刺。針刺得氣后，小幅度前后捻轉(zhuǎn)針體，角度控制在180°～360°，頻率60～90 r/min，拇指向前轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)用力重，指力沉重向下，拇指向后還原轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)用力輕。熱補(bǔ)針法組：予熱補(bǔ)針法針刺。針刺得氣后，左手加重壓力，右手拇指向前連續(xù)捻按5次，針下沉緊后針尖拉著有感應(yīng)的部位，連續(xù)重插輕提5次，拇指再向前連續(xù)捻按5次。各針刺組行針1 min，留針30 min，每日1次，連續(xù)7 d。各針刺組手法操作均統(tǒng)一培訓(xùn)，并由同一人完成。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 一般觀察

觀察兔精神狀態(tài)、飲食飲水、反應(yīng)能力、活動(dòng)情況及關(guān)節(jié)腫脹情況等。

1.5.2 痛閾檢測

針刺結(jié)束后，采用PL-200熱刺痛儀刺激兔膝關(guān)節(jié)測痛點(diǎn)，從刺激開始到兔出現(xiàn)掙扎躲避所用時(shí)間即為痛閾，共測量3次，取平均值。

1.5.3 彩超觀察

使用線陣探頭為8～12 MHz的彩色多普勒超聲診斷儀檢查兔膝關(guān)節(jié)，針對(duì)膝關(guān)節(jié)腔附近多角度采集圖像，觀察膝關(guān)節(jié)腔積液、滑膜厚度及血流信號(hào)。

1.5.4 HE染色

采用空氣栓塞法處死兔，完整剝離膝關(guān)節(jié)滑膜組織，置于10%福爾馬林溶液中固定，從固定液中取出滑膜組織（厚約0.5 cm），石蠟包埋，切片（約5 μm），常規(guī)HE染色。鏡下觀察滑膜被覆細(xì)胞、炎性細(xì)胞、滑膜基質(zhì)等情況。

1.5.5 RT-PCR檢測

提取膝關(guān)節(jié)滑膜組織總RNA，室溫放置10 min，根據(jù)沉淀量加入適量DEPC水，超微量分光光度計(jì)測定RNA濃度及純度，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件：25℃、5 min，42℃、30 min，85℃、5 min，85℃、5 min，1個(gè)循環(huán)；95℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性10 s，60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；60～95℃緩慢加溫。建立熔解曲線。根據(jù)目的基因與內(nèi)參基因Ct值，并用內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，依據(jù)2法對(duì)mRNA表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。SIRT3、SOD2、CAT及內(nèi)參rab-actb引物由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)合成（見表1）。

表1 各基因PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

正常組兔精神狀態(tài)良好，模型組兔精神萎靡，體毛雜亂，膝關(guān)節(jié)腫脹，觸之掙扎躲避，活動(dòng)量減少，飲食減少，各針刺組兔精神狀態(tài)較模型有所好轉(zhuǎn)，飲食增加，關(guān)節(jié)腫脹度減輕，熱補(bǔ)針法組改善更明顯。

2.2 熱補(bǔ)針法對(duì)模型兔關(guān)節(jié)痛閾的影響

與正常組比較，模型組兔痛閾明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，各針刺組兔痛閾明顯升高（＜0.05）；與平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組比較，熱補(bǔ)針法組兔痛閾明顯升高（＜0.05）。見圖1。

圖1 各組兔膝關(guān)節(jié)痛閾比較（±s，每組6只）

2.3 熱補(bǔ)針法對(duì)模型兔膝關(guān)節(jié)彩超結(jié)果的影響

正常組兔膝關(guān)節(jié)滑膜厚度無異常，滑膜內(nèi)未見異常血流信號(hào)，無積液；模型組兔膝關(guān)節(jié)滑膜增厚明顯，滑膜內(nèi)呈網(wǎng)狀及樹枝狀血流信號(hào)，有大量積液，范圍廣泛，可見關(guān)節(jié)腫脹；平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組兔膝關(guān)節(jié)滑膜略增厚，滑膜內(nèi)血流信號(hào)呈點(diǎn)狀或點(diǎn)線狀，積液減少，關(guān)節(jié)腫脹減輕；熱補(bǔ)針法組兔膝關(guān)節(jié)滑膜增厚不明顯，滑膜內(nèi)有少量點(diǎn)狀血流信號(hào)，微量積液或無積液。見圖2。

圖2 各組兔膝關(guān)節(jié)彩超表現(xiàn)

2.4 熱補(bǔ)針法對(duì)模型兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)的影響

正常組兔膝關(guān)節(jié)滑膜被覆細(xì)胞排列整齊，滑膜基質(zhì)未見異常，無炎性細(xì)胞浸潤；模型組兔膝關(guān)節(jié)滑膜被覆細(xì)胞腫大明顯、排列紊亂，滑膜基質(zhì)重度增生，炎性細(xì)胞重度浸潤；各針刺組兔膝關(guān)節(jié)滑膜被覆細(xì)胞情況、滑膜基質(zhì)狀態(tài)、炎性細(xì)胞浸潤均有改善，熱補(bǔ)針法組效果最明顯。見圖3。

圖3 各組兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)（HE染色，×100）

2.5 熱補(bǔ)針法對(duì)模型兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織沉默信息調(diào)節(jié)因子3、超氧化物歧化酶2和過氧化氫酶mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT3、SOD2、CAT mRNA表達(dá)明顯升高（＜0.05）；與模型組比較，平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組和熱補(bǔ)針法組兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT3、SOD2、CAT mRNA表達(dá)明顯降低（＜0.05）；與平補(bǔ)平瀉組、捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法組比較，熱補(bǔ)針法組兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT3、SOD2、CAT mRNA表達(dá)明顯降低（＜0.05）。見表2。

表2 各組兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT3、SOD2、CAT mRNA表達(dá)比較（±s）

3 討論

RA主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫痛，慢性疼痛影響患者生活質(zhì)量，是臨床治療亟需解決的問題。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各針刺組痛閾較模型組明顯升高（＜0.05），證實(shí)針刺具有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，其中熱補(bǔ)針法組痛閾升高更明顯（＜0.05），提示熱補(bǔ)針法鎮(zhèn)痛作用具有相對(duì)特異性，與課題組前期研究結(jié)果一致。

彩色多普勒超聲及病理形態(tài)觀察對(duì)RA早期診斷和檢測意義重大。在RA發(fā)病中，滑膜厚度與異常血流信號(hào)關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)彩超觀察結(jié)果顯示，各針刺組滑膜厚度、積液、異常血流信號(hào)、滑膜被覆細(xì)胞情況、滑膜基質(zhì)狀態(tài)、炎癥細(xì)胞浸潤均明顯改善，熱補(bǔ)針法組改善更明顯，證實(shí)熱補(bǔ)針法可減輕RA兔膝關(guān)節(jié)滑膜厚度，改善異常血流信號(hào)及炎性細(xì)胞浸潤，發(fā)揮其相對(duì)特異性抗炎作用。

針灸治療RA療效顯著。平補(bǔ)平瀉是臨床應(yīng)用最普遍的手法，捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法具有溫補(bǔ)之功，符合針灸臨床虛證用針刺補(bǔ)法的規(guī)律，因此選擇二者作對(duì)照研究。熱補(bǔ)針法功效與RA寒證病因病機(jī)特點(diǎn)相吻合。課題組前期研究顯示，熱補(bǔ)針法對(duì)RA模型兔具有治療作用，可相對(duì)特異性發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用及調(diào)節(jié)能量代謝障礙。此外，針刺通過提高抗氧化酶活性，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。熱補(bǔ)針法能提高RA患者血漿谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶水平，降低丙二醛水平，提示熱補(bǔ)針法具有抗氧化應(yīng)激作用。SIRT3是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙?；?，主要通過提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)線粒體內(nèi)ROS清除作用，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。研究顯示，SIRT3能通過其去乙?；钚宰饔糜诓±磉^程的關(guān)鍵靶點(diǎn)和蛋白，對(duì)細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)生影響，調(diào)節(jié)氧化代謝。SODs是抗氧化系統(tǒng)中最重要也是最原始的抗氧化酶，當(dāng)SIRT3過表達(dá)時(shí)可上調(diào)SOD2和CAT表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各針刺組兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT3、SOD2、CAT mRNA表達(dá)均明顯降低（0.05），熱補(bǔ)針法組降低更明顯（＜0.05），SIRT3、CAT、SOD2 mRNA水平變化反映RA模型兔體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，證實(shí)熱補(bǔ)針法可增強(qiáng)RA模型兔抗氧化能力，改善機(jī)體氧化應(yīng)激水平。

綜上所述，熱補(bǔ)針法能改善RA寒證模型兔一般狀況，提高痛閾，減輕膝關(guān)節(jié)滑膜厚度，改善異常血流信號(hào)及炎性細(xì)胞浸潤，下調(diào)膝關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT3、SOD2、CAT表達(dá)，提示熱補(bǔ)針法干預(yù)RA的相對(duì)特異性與調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。