中心組合設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)化連翹中連翹苷的提取工藝

岑少婷，李植桐

（1.佛山市三水區(qū)婦幼保健院，廣東佛山 528100；2.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院），廣東廣州 510095）

連翹是清熱解毒類(lèi)中藥方劑中的常用藥味，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱等作用，研究表明連翹提取物、流浸膏等單味藥制劑對(duì)對(duì)感冒發(fā)熱、丹毒、營(yíng)衛(wèi)不調(diào)等癥也有較好的療效，且經(jīng)提取制備單方制劑后便于攜帶、服用，療效更佳[1-3]。但與此同時(shí)，由于各醫(yī)療機(jī)構(gòu)和制藥企業(yè)儀器設(shè)備、人員、工藝水平等因素的影響，所制備的連翹提取物療效和穩(wěn)定性相差較大，因此有必要對(duì)該藥味的提取工藝中的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)。

中心組合設(shè)計(jì)效應(yīng)面法基于軟件計(jì)算和預(yù)測(cè)，可以根據(jù)用戶所給參數(shù)及范圍進(jìn)行多參數(shù)/指標(biāo)優(yōu)化考察，相比傳統(tǒng)的單因素設(shè)計(jì)等方面，能夠最大限度減少試驗(yàn)次數(shù)，獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果[4-5]。因此，筆者擬使用Design Expert 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并根據(jù)所得各關(guān)鍵參數(shù)制備樣品，參考文獻(xiàn)方法測(cè)定連翹提取液中連翹苷的含量[6-7]，再導(dǎo)入上述軟件中預(yù)測(cè)最優(yōu)結(jié)果。

1 儀器與材料

Waters 2695高效液相色譜儀，配制為PDA檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器、四元高壓泵和柱溫箱，購(gòu)自美國(guó)Waters公司；98-2-C型數(shù)顯電熱套，購(gòu)自廣東佛衡儀器有限公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，購(gòu)自江蘇國(guó)華電器有限公司；ME104T/02 電子分析天平，購(gòu)自瑞士Mettler-Toledo 公司；連翹苷對(duì)照品（批號(hào)：110821-201816）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；連翹苷藥材購(gòu)自華潤(rùn)三九藥業(yè)股份有限公司；樣品制備用乙醇為分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；供試品制備和含量測(cè)定用乙醇、乙腈、冰醋酸為色譜純，購(gòu)自德國(guó)Merck公司；實(shí)驗(yàn)用水購(gòu)自Watsons公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)計(jì) 本研究確定的考察乙醇含量、提取時(shí)間、溶劑量三個(gè)參數(shù)，考察指標(biāo)為連翹苷含量。將各考察參數(shù)輸入Design Expert 軟件中，乙醇含量范圍設(shè)定為20%～100%，提取時(shí)間范圍設(shè)定為20～90min，溶劑量范圍設(shè)定為10～40 倍（溶劑體積/藥材量，藥材量固定為2g），系統(tǒng)給出的各實(shí)驗(yàn)組參數(shù)見(jiàn)表1。根據(jù)所給參數(shù)進(jìn)行加熱回流提取，所得提取液放冷后備用。

表1 CCD各組參數(shù)及測(cè)定結(jié)果

2.2 對(duì)照品溶液制備 取連翹苷對(duì)照品粉末，精密稱(chēng)取約5mg 置于5mL 量瓶中，加色譜純乙醇溶解并定容至刻度，得濃度為1mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液制備 取各實(shí)驗(yàn)組樣品，在水浴鍋上濃縮至≤20mL，所得溶液轉(zhuǎn)移至25mL 量瓶中，加色譜純乙醇稀釋并定容至刻度，即得連翹苷標(biāo)準(zhǔn)提取液；分別精密吸取上述提取液1mL，轉(zhuǎn)移至10mL 量瓶中，加色譜純乙醇稀釋并定容至刻度，所得溶液濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.4 樣品含量測(cè)定 使用Waters Xbridge 色譜柱（25cm 柱長(zhǎng)，0.46cm 內(nèi)徑，5μm 粒徑），乙腈（A）-0.4%冰醋酸（B）為流動(dòng)相，梯度程序?yàn)椋?～15min，15%-15%A；15～20min，15%-90%A；20～25min，90%-15%A；25～30min，15%-15%A；流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)330nm，柱溫25℃，進(jìn)樣體積10μL；記錄所得HPLC圖譜，見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品（100μg/mL）和供試品HPLC圖譜

2.5 含量測(cè)定方法驗(yàn)證

2.5.1 線性和范圍 取連翹苷對(duì)照品溶液，分別精密吸取不同體積，轉(zhuǎn)移至多個(gè)5mL 量瓶中，加色譜純乙醇稀釋并定容，制得濃度分別為10、20、50、100、200、500μg/mL 的對(duì)照品溶液，注入HPLC 中，按“2.4”項(xiàng)下所述方法分析測(cè)定，記錄各樣品中連翹苷的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、濃度為橫坐標(biāo)（x），導(dǎo)入Excel 軟件進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得回歸方程為y=14532x-1776.1（r2=0.9996）。結(jié)果顯示：方法線性良好，能夠在10～500μg/mL 濃度范圍內(nèi)準(zhǔn)確測(cè)定連翹苷的含量。

2.5.2 精密度考察 取最優(yōu)提取條件制備的供試品溶液（簡(jiǎn)稱(chēng)供試品溶液），注入HPLC 中，按“2.4”項(xiàng)下所述方法分析測(cè)定，連續(xù)重復(fù)6次，記錄各樣品中連翹苷的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果顯示：RSD為0.84%，表明方法精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性考察 將供試品溶液放置在HPLC自動(dòng)進(jìn)樣器中，分別在0、2、4、6、8、12h 按“2.4”項(xiàng)下所述方法分析測(cè)定，記錄各樣品中連翹苷的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果顯示：RSD為0.62%，表明方法所制備樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性考察 平行配制6 份供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下所述方法分析測(cè)定，記錄各樣品中連翹苷的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果顯示：RSD 為0.65%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn) 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)提取液0.5mL，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，按表2所列藥量添加連翹苷對(duì)照品溶液，混合后加色譜純乙醇稀釋并定容至刻度，所得溶液濾過(guò)，即得供試品溶液。吸取上述供試品溶液，注入HPLC 中，按“2.4”項(xiàng)下所述方法分析測(cè)定，記錄各樣品中連翹苷的峰面積，計(jì)算含量、回收率和回收率的RSD。結(jié)果顯示：平均回收率為99.12%，RSD為3.13%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.6 樣品測(cè)定和數(shù)據(jù)分析 取“2.1”項(xiàng)下各組樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，所得溶液注入HPLC中，按“2.4”項(xiàng)下所述方法分析測(cè)定，記錄各樣品中連翹苷的峰面積，計(jì)算含量。所得結(jié)果導(dǎo)入Design Expert 中，計(jì)算并預(yù)測(cè)最優(yōu)提取參數(shù)。結(jié)果顯示：乙醇含量60%、提取時(shí)間60min、溶劑量為藥材量30 倍時(shí)為最優(yōu)，為0.6152mg/mL，與軟件預(yù)測(cè)結(jié)果（圖2）相符。

圖2 中心組合設(shè)計(jì)效應(yīng)面預(yù)測(cè)結(jié)果（n=20）

3 討論

含量測(cè)定結(jié)果顯示，中心點(diǎn)各組所得樣品連翹苷含量最高。產(chǎn)生上述結(jié)果，可能是由于：（1）乙醇含量增加時(shí)，提取效率上升，但該參數(shù)超過(guò)中心點(diǎn)后，由于黏度、極性的變化，導(dǎo)致連翹苷溶解度下降；此外含水量較高時(shí)，加熱回流會(huì)導(dǎo)致連翹苷水解，也會(huì)一定程度降低得率；（2）隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，連翹苷提取量上升，但由于水解的存在，導(dǎo)致過(guò)度延長(zhǎng)提取時(shí)間時(shí)，連翹苷水解量增加，進(jìn)而影響產(chǎn)量；（3）增加液料比（溶劑-藥材比）可以使藥材得到充分提取，但其結(jié)果受藥材中連翹苷總量的影響，因此產(chǎn)量不會(huì)隨溶劑量的增加而無(wú)限增加。綜合考慮上述因素，最終選擇了中心點(diǎn)作為最優(yōu)提取參數(shù)。

研究表明，使用不同極性溶劑對(duì)連翹進(jìn)行提取時(shí)，所得提取物的抗炎活性存在較大差異；同時(shí)，該藥材水提物雖然提取率較高，且對(duì)小鼠足節(jié)腫脹模型具有一定抗炎效果，但與模型組相比并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[8]。上述結(jié)果表明，在優(yōu)化提取效率時(shí)，考察指標(biāo)的選擇尤為關(guān)鍵。另有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，連翹提取物與揮發(fā)油協(xié)同作用，均能夠顯著降低體內(nèi)發(fā)熱相關(guān)炎癥因子（PEG2、ⅠL-1β、ⅠL-6、TNF-α 等）水平，進(jìn)而發(fā)揮解熱抗炎功效。結(jié)合連翹苷的藥理活性及文獻(xiàn)報(bào)道的連翹抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)可知，連翹醇提物對(duì)發(fā)熱型炎癥的抵抗效果較好[10-11]，且醇提物相較乙酸乙酯、正丁醇等有機(jī)溶劑毒性低，溶劑殘留導(dǎo)致的健康風(fēng)險(xiǎn)更加可控，因此本文選擇使用乙醇作為提取溶劑的有機(jī)相，具有較好的科學(xué)性、合理性。