乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)的研究進展

左夢楠，劉 偉 ，全 琦，張菊華,

（1.湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南長沙 410000；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長沙 410000；3.果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點實驗室，湖南長沙 410000；4.湖南省果蔬加工與質(zhì)量安全國際科技創(chuàng)新合作基地，湖南長沙 410000）

乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。乳酸菌可分為乳桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、雙歧桿菌屬和片球菌屬5 個屬。乳酸菌發(fā)酵不僅能提高食品的營養(yǎng)價值，改善食品風(fēng)味，還能提高食品的保藏性和附加值。乳酸菌發(fā)酵劑廣泛用于食品深加工，生產(chǎn)酸奶、肉類、面包、泡菜等。絕大部分乳酸菌都是人體內(nèi)必不可少的、可為宿主帶來健康益處、具有重要生理功能的益生菌群，如調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善營養(yǎng)物質(zhì)的消化、加強新陳代謝，增強免疫作用并表現(xiàn)出抗癌和抗病毒等作用。近年來，由于人們越來越重視乳酸菌的功能特性及其對人體健康的有益作用，乳酸菌在醫(yī)藥、食品、生物技術(shù)等領(lǐng)域均得到了廣泛的應(yīng)用。

高活性直投式乳酸菌發(fā)酵劑具有發(fā)酵活力強、體積小、便攜、使用方便等特點，可直接用于發(fā)酵制品的生產(chǎn)，省去擴大培養(yǎng)的復(fù)雜操作過程，從而簡化產(chǎn)品生產(chǎn)工藝，有利于保持產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定，防止菌種退化和污染。乳酸菌高密度培養(yǎng)是高活性發(fā)酵劑制備的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其顯著性特點是能夠以較低的發(fā)酵體積和較短的發(fā)酵周期，獲得較高的目標菌體密度，在發(fā)酵設(shè)備和體積不變的情況下，高密度發(fā)酵可以提高批次發(fā)酵結(jié)束時的產(chǎn)品得出量。本文從影響乳酸菌高密度培養(yǎng)的營養(yǎng)物質(zhì)、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法等重要因素進行了歸納總結(jié)，以期為乳酸菌的高密度培養(yǎng)和直投式發(fā)酵劑的制備提供理論依據(jù)。

1 乳酸菌高密度培養(yǎng)的營養(yǎng)消耗模式

乳酸菌對生長條件要求挑剔，同種物質(zhì)對不同乳酸菌的增殖效果不一樣。影響乳酸菌高密度培養(yǎng)的營養(yǎng)物質(zhì)需求可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因子等。對乳酸菌營養(yǎng)成分的消耗模式進行分析，可為乳酸菌的高密度培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1.1 碳源

碳源作為微生物生長過程中的重要營養(yǎng)物質(zhì)，為乳酸菌的生長提供能量，提高物質(zhì)向細胞的運輸速度，加快細胞合成和新陳代謝，促進乳酸菌的快速增殖。乳酸菌生長所需要的碳源一般是糖類及其復(fù)合物，葡萄糖是最常見的碳源類物質(zhì)，乳酸菌主要通過糖酵解途徑、Leloir 途徑、磷酸戊糖途徑及磷酸乙酮醇酶途徑等對糖類進行分解代謝，不同糖類對乳酸菌的代謝途徑影響不一，不論以何種糖類物質(zhì)為碳源，一般都通過轉(zhuǎn)化為葡萄糖或葡萄糖6-P 進行反應(yīng)，碳水化合物代謝和糖酵解變化過程如圖1 所示。

圖1 碳水化合物代謝和糖酵解變化示意圖[16]Fig.1 Schematic diagram of changes in carbohydrate metabolism and glycolysis[16]

不同乳酸菌的糖類促生長作用也不一樣。在增殖過程中，提高脫脂乳培養(yǎng)基中的乳糖濃度可以顯著提高的細胞密度。單糖和雙糖對BBE 09-18 的促生長效果優(yōu)于淀粉等多糖，所研究的碳源中使用麥芽糖培養(yǎng)的效果最好，活菌數(shù)可達1.88×10CFU/mL，其次是-乳糖，活菌數(shù)可達1.83×10CFU/mL。乳酸桿菌屬對單糖和雙糖的代謝親和能力具有相似性，可將單糖和雙糖同發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乳酸?；旌咸桥囵B(yǎng)物可作為乳酸菌增殖的優(yōu)良底物，研究在2 g/L 的半乳糖和10 g/L 的阿拉伯糖混合物中生長具有最大的活性。益生元也具有作為碳源底物的潛力，在食品工業(yè)上低聚果糖可促進乳酸菌和雙歧桿菌的生長。與商業(yè)Raftilose（R）P95 相比，乳酸菌在果寡糖（FOS）混合物中的細胞密度更高,有些菌株在產(chǎn)生的FOS 混合物中生長的速度甚至比在所有其他碳源中都要快。乳果糖衍生寡糖也可作為乳桿菌屬、鏈球菌屬和雙歧桿菌屬促生長的碳源類物質(zhì)，其促增殖效果還與糖苷鍵結(jié)構(gòu)、乳酸菌酶活性有關(guān)。任何食品工業(yè)的成功通常都集中在碳底物的成本上，碳源的優(yōu)化是降低經(jīng)濟成本的關(guān)鍵。

1.2 氮源

乳酸菌不能合成一些生長必須的氨基酸等物質(zhì)，從而嚴格限制了乳酸菌的高密度生長。尤其營養(yǎng)缺陷型的乳酸菌菌株，只有在具有可用氮源的適宜環(huán)境中才能高效生長和增殖。實驗室高密度培養(yǎng)過程中一般添加游離氨基酸，或者已降解的蛋白質(zhì)或肽類作為生長過程的氮源，進行能量代謝、ATP 轉(zhuǎn)運等，乳酸菌利用氨基酸和蛋白質(zhì)的機理如圖2。如在培養(yǎng)基中添加大豆蛋白和乳清蛋白水解物可促進乳酸菌的生長，多肽和寡肽也可作為植物乳桿菌的有效氮源。大量研究表明促進乳酸菌生長效果最顯著的氮源類物質(zhì)為酵母膏，相比其它的氮源，它所達到的細胞密度最高，雖然單獨添加的氮源類水解物增殖效果不如酵母膏表現(xiàn)突出，然而與酵母膏聯(lián)合使用可使細胞數(shù)量提升1.0～1.5 個數(shù)量級。所以進行乳酸菌高密度培養(yǎng)培養(yǎng)成分優(yōu)化，一般會采用復(fù)合氮源的方法進行優(yōu)化研究。

圖2 乳酸菌利用氨基酸和蛋白質(zhì)的機理圖[18]Fig.2 Diagram of the mechanism of lactic acid bacteria using amino acids and protein[18]

氮源類物質(zhì)是乳酸菌生長過程中的關(guān)鍵成分，實驗室常用的氮源類物質(zhì)生長效果良好，但工業(yè)化應(yīng)用的成本往往十分昂貴。尋找經(jīng)濟高效的氮源類替代物是工業(yè)化應(yīng)用面臨的難題。目前常采用其它較為經(jīng)濟的氮源與培養(yǎng)過程中的昂貴氮源混合優(yōu)化，通過減少酵母膏等昂貴類氮源的使用來降低成本。Hom 等發(fā)現(xiàn)鱈魚內(nèi)臟水解物（蛋白胨）是一種很有前途的氮源類經(jīng)濟生長介質(zhì)，其與酵母提取物以1:1 的比例混合替代可提高植物乳桿菌10%的生物量，降低工業(yè)生產(chǎn)成本。玉米漿含有高含量的氨基酸和多肽以及大量的復(fù)合維生素，是一種極好的低成本氮源，可顯著增強乳酸桿菌的生長。

1.3 無機鹽

乳酸菌高密度培養(yǎng)過程補充無機鹽主要是作為緩沖物質(zhì)，調(diào)節(jié)菌體生長過程中的pH 變化，維持乳酸菌生長的適宜pH 環(huán)境，延長發(fā)酵劑的活性。乳酸菌培養(yǎng)基中常用的緩沖鹽體系有磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉/檸檬酸、磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉/磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀/氫氧化鈉、磷酸氫二鉀/乙酸鈉/檸檬酸鈉等。緩沖鹽中的無機離子還能以陽離子、陰離子的形式被乳酸菌吸收進行生物合成、酶活性激活和運輸轉(zhuǎn)運、也在一定程度上為乳酸菌的生長補充了微量元素。比如Cl、NO、SO、PO、Na、K、NH、Ca、Mg等是生物體大量所需的，而其它如Mn、Zn只需少量或微量。

無機鹽中某些離子的類型和濃度對乳酸菌的生長和活性影響也不相同。細胞能量酶的轉(zhuǎn)運結(jié)合可能需要依賴某些多價陽離子如Mg、Ca和Mn等，Mg、Mn可顯著促進格氏乳桿菌的最大比生長率，而Zn、Cu對其生長具有抑制作用。當鹽濃度超過0.04 mmol/L 時，IMAU95219的菌體密度隨緩沖鹽體系的濃度增加而降低。Dupree 等通過研究發(fā)現(xiàn)合適的鹽濃度不僅不會抑制乳酸菌等有益微生物的生長，反而還會刺激它們的生長。植物乳桿菌經(jīng)乳酸和乳酸鈉鹽溶液亞致死水平誘導(dǎo)處理后，與細胞膜轉(zhuǎn)運、氨基酸代謝、核苷酸代謝和細胞生長相關(guān)的基因表達顯著上調(diào)，其活菌存活率顯著提高。無機鹽還可作為菌體細胞成分的構(gòu)成、酶的激活劑或抑制劑。研究還表明免疫生物菌株在緩沖鹽中顯示出很高的內(nèi)在耐熱性，增強了菌株在應(yīng)激條件下的保護能力。

緩沖鹽對乳酸菌的生長具有重要作用，不同微生物生長所需無機鹽的種類也是不一樣的。乳酸片球菌受磷酸氫二鉀的作用生長效果顯著增強，IMAU95219 的最適生長緩沖鹽體系為磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸鈉，格氏乳桿菌的最適緩沖鹽體系組成為磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉。

1.4 生長因子

生長因子是一類能夠調(diào)節(jié)微生物生長，但乳酸菌自身難以合成的一類結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同的物質(zhì)。常用作生長因子的物質(zhì)有三種，分別是氨基酸、核苷酸和維生素類物質(zhì)（見圖3）。其中對乳酸菌生長效果影響較顯著的當屬氨基酸類和維生素類物質(zhì)。乳酸菌中的氨基酸分解代謝在氧化還原力或代謝能量的產(chǎn)生、細胞內(nèi)pH 的控制以及抗應(yīng)激方面發(fā)揮著重要作用。研究表明精氨酸可以促進嗜熱鏈球菌T1C2的生長，在KLDS 1.0738的高細胞密度生長過程中，氨基酸消費量最高的是谷氨酸（1.62 mmol/L）和甘氨酸（1.53 mmol/L），其次是天冬氨酸（1.15 mmol/L）和丙氨酸（0.85 mmol/L），它們參與保護KLDS 1.0738免受低pH 環(huán)境的損害。Yao 等在以脫脂乳為乳酸菌培養(yǎng)基質(zhì)的高密度培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)V、V和生物素在希臘乳桿菌生長過程中具有不可或缺的作用，這可能是因為維生素與脂肪酸的合成、糖代謝主要酶的表達有關(guān)。許多乳酸菌是嘌呤和嘧啶類營養(yǎng)缺陷菌，這些乳酸菌可能對脫氧核苷有額外的需求，乳球菌隨嘌呤含量的增加，可增強對多種脅迫的抗性，提高生長能力。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)果蔬汁可作為益生菌增殖的良好載體物質(zhì)，在微生物發(fā)酵過程中，將其作為外源增殖因子加入到乳酸菌培養(yǎng)基中確實會提高乳酸菌的生長能力和活性。這可能是因為果蔬汁的成分較復(fù)雜，含有纖維、礦物質(zhì)和維生素等，比單一的化學(xué)合成成分營養(yǎng)元素的種類更加多元，符合乳酸菌的生長要求，例如番茄汁、胡蘿卜汁等作為外源因子可明顯促進菌株的增殖。

圖3 乳酸菌培養(yǎng)的促生長因子Fig.3 Growth-promoting factors of lactic acid bacteria culture

1.5 其它營養(yǎng)成分

吐溫類物質(zhì)常被用作乳酸菌生長培養(yǎng)基的添加劑，其所含的油酸部分可以影響細胞膜的組成和特性，從而可以促進乳酸菌的生長，保護細胞免受酸性、營養(yǎng)消耗等不利環(huán)境的影響。研究發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸是大多數(shù)乳酸菌生長的必需因子，可代替吐溫類物質(zhì)促進乳酸菌的生長，其主要是在細胞質(zhì)膜上發(fā)揮作用，通過顯著降低脂肪酸生物合成所需的能量來刺激生長，研究表明脂肪酸可以增加低溫下干酪乳桿菌在干酪提取物中的細胞密度。

2 乳酸菌高密度培養(yǎng)基選擇

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

對高密度培養(yǎng)來說，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇至關(guān)重要，它必須適合乳酸菌的生長，并且能夠得到大量高活力的菌體。乳酸菌對生長條件的要求很挑剔，不同種類的乳酸菌生長需求不同，所需要的營養(yǎng)成分及比例也不盡相同，而且乳酸菌在不同生長時期的物質(zhì)消耗也不相同，這就決定了乳酸菌在培養(yǎng)過程中的復(fù)雜性。如表1 所示，列舉了關(guān)于不同種類的乳酸菌培養(yǎng)基，一般以化學(xué)合成成分的培養(yǎng)基為主，依據(jù)MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對其所含碳源、氮源、無機鹽等進行種類和比例優(yōu)化，同時獲得較高的細胞密度，大多在10～10CFU/mL。例如以蔗糖、海藻糖、乳糖等糖類物質(zhì)代替培養(yǎng)基中的葡萄糖，以成本較低的大豆蛋白粉代替昂貴的氮源類物質(zhì)，減少培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本。

表1 常見乳酸菌的高密度培養(yǎng)基Table 1 High-density medium for common lactic acid bacteria

2.2 改良副產(chǎn)物培養(yǎng)基

商業(yè)微生物培養(yǎng)基因為其使用的成分往往很昂貴，因此在乳酸菌高密度培養(yǎng)生產(chǎn)中的應(yīng)用成本是十分巨大的。由于乳酸菌通常用于各種行業(yè)，特別是作為益生菌，尋求更便宜的替代介質(zhì)是很有必要的。大量研究表明果蔬加工副產(chǎn)物可在乳酸菌培養(yǎng)過程中起到補充碳源、氮源等營養(yǎng)物質(zhì)的作用，能夠顯著支持乳酸菌的生長。隨著乳酸菌市場的應(yīng)用日益增大，選擇經(jīng)濟高效的新型發(fā)酵培養(yǎng)基成為未來不斷追求的目標。利用食品廢棄物或工、農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品等作為乳酸菌高密度生產(chǎn)的培養(yǎng)介質(zhì)，是一種很有前途、對環(huán)境友好的乳酸菌高密度培養(yǎng)方法。

2.2.1 農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物 利用低成本的營養(yǎng)物質(zhì)將大規(guī)模降低生產(chǎn)成本。常見的農(nóng)用副產(chǎn)物有乳清、乳清滲透物、淀粉類廢棄物、玉米漿木質(zhì)纖維素材料等。Katarzyna 等以小麥、玉米、大麥和黑麥粉為主要成分，設(shè)計了一種半固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)果表明所選菌株的細胞產(chǎn)量比在MRS 培養(yǎng)基中高。張艷麗研究了五種農(nóng)副產(chǎn)品棉粕、豆粕、麩皮、次粉、葵花盤粉作為營養(yǎng)因子對植物乳桿菌生長情況的影響，結(jié)果表明棉粕和豆粕可顯著促進植物乳桿菌生長，使用淀粉類農(nóng)作物廢棄物也是一種良好的降低益生菌生長所必需的碳源營養(yǎng)成本的解決方案，例如玉米面可作為益生菌LOCK 0860 生長培養(yǎng)基的基本介質(zhì)，而且在后續(xù)噴霧干燥過程中與菊粉混合作用可使細胞活力提升4 倍以上，具有很大的經(jīng)濟效益。Thakur 等在模擬GIT 條件下，用竹筍和馬鈴薯皮提取物作為發(fā)酵底物，探究乳酸菌的體外益生作用，結(jié)果表明不僅降低了碳底物的成本，而且通過將環(huán)境廢棄物轉(zhuǎn)化為合適的生物質(zhì)，減少了預(yù)期發(fā)酵目標的成本。

2.2.2 工業(yè)副產(chǎn)物 食品工業(yè)副產(chǎn)物如大豆渣、糖蜜、工業(yè)廢水、果汁廢棄物等含有基本的營養(yǎng)物質(zhì)，可作為乳酸菌增殖的培養(yǎng)介質(zhì)，這些廢棄物的處理涉及重大的經(jīng)濟和環(huán)境管理成本，減少環(huán)境中污染物的必要性和最大限度地提高原材料回報的必要性鼓勵了人們尋求利用食品工業(yè)廢料作為培養(yǎng)基基礎(chǔ)的新方法。Coghetto 等首次報道了利用大豆液體酸性蛋白渣進行植物乳桿菌生長的研究，這種殘渣含有糖和低分子量的蛋白質(zhì)，常作為工業(yè)廢水排放，將它作為一種替代基質(zhì)生產(chǎn)益生菌，而不需要動物來源的成分，可獲得高生物量的批量生物反應(yīng)器。酒廠乙醇生產(chǎn)廢水與糖蜜兩者副產(chǎn)物結(jié)合可作為一種低成本的培養(yǎng)基，且其產(chǎn)量和生物量密度與傳統(tǒng)工業(yè)培養(yǎng)基相當，這也是首次嘗試尋找用于生產(chǎn)植物乳桿菌生物質(zhì)的低成本培養(yǎng)基的方法。在對生物質(zhì)工業(yè)副產(chǎn)物的研究過程中，發(fā)現(xiàn)糖蜜是一種很好的培養(yǎng)材料，Papizadeh 等利用工業(yè)副產(chǎn)物甘蔗糖蜜研制了一種高產(chǎn)RPR 42 的培養(yǎng)基。果汁等產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的果渣也富含多種營養(yǎng)成分，其處理問題一直是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，利用蘋果渣制備生物菌劑可進行乳酸發(fā)酵綜合利用。利用棗汁廢料優(yōu)化設(shè)計的新型培養(yǎng)基可對乳酸乳球菌的生長具有顯著的促進作用。海藻生產(chǎn)生物柴油后的廢棄物也可作為發(fā)酵底物進行乳桿菌增殖。

2.2.3 其它副產(chǎn)物 除農(nóng)業(yè)、工業(yè)副產(chǎn)物外，研究發(fā)現(xiàn)水生雜草水萵苣的汁液可以直接用于制備生長培養(yǎng)基，通過分析表明，它含有豐富的發(fā)酵糖、蛋白質(zhì)和氨基酸，以水萵苣汁為原料制成的培養(yǎng)基，細胞密度比普通培養(yǎng)基高出10%～60%，且對水解物的產(chǎn)糖沒有任何副作用。加工處理副產(chǎn)物的優(yōu)化除了用作乳酸菌生長的培養(yǎng)基外，還可以作為固定化基質(zhì)的形式存在，提高酶催化活性，避免引起競爭抑制問題。總而言之，對副產(chǎn)物的利用發(fā)展有助于最大程度實現(xiàn)生物質(zhì)能的利用，隨著時代的發(fā)展，環(huán)境保護成為越來越重要的話題，利用副產(chǎn)物設(shè)計新型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基將越來越受歡迎。

3 乳酸菌高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化

除培養(yǎng)基的組成外，乳酸菌生長還受到一系列不同條件的影響，如溫度和pH、通氣和攪拌等。對乳酸菌生長營養(yǎng)物質(zhì)和生長條件進行探索優(yōu)化，不僅可以最大程度地提高生物量產(chǎn)量，還可以節(jié)約成本，有利于工業(yè)化應(yīng)用。

3.1 pH 與溫度

研究發(fā)現(xiàn)除碳源、氮源等營養(yǎng)物質(zhì)顯著影響乳酸菌生長外，pH 和溫度是最重要的生長參數(shù)，對乳酸菌的生長溫度和pH 進行優(yōu)化對乳酸菌商業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要。乳酸菌生長的最適pH 范圍為5.5～6.0，能在其他乳酸菌不能生長的酸性環(huán)境中生長繁殖。但乳酸菌在生長過程中會產(chǎn)生乳酸等，導(dǎo)致更低的pH 環(huán)境，對生長不利。實驗室優(yōu)化pH 的方法一般通過將初始pH 調(diào)整到菌體最適生長酸堿度環(huán)境，但工業(yè)化應(yīng)用更加復(fù)雜，可能會涉及到生長過程的酸堿度變化，往往采用恒pH 培養(yǎng)、分批培養(yǎng)等方法保證生長最適pH 范圍。pH 和溫度的影響是緊密相連的，不同pH 條件下對應(yīng)的最適溫度也不一樣，例如在探究乳酸菌調(diào)控餐廚垃圾剩余污泥發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響機制中，發(fā)現(xiàn)pH 越低所需的最適溫度越高，pH 為11 時的最適溫度是20 ℃，pH 為9 和7 時的最適溫度分別是35 和50 ℃。

培養(yǎng)溫度主要通過影響乳酸菌關(guān)鍵酶的活性發(fā)揮作用，在較高的生長溫度下，可觀察到能量代謝途徑受到抑制，例如脂肪酸、核苷酸和氨基酸的生物合成，與氮和碳源吸收相關(guān)的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶（PTS）系統(tǒng)和ATP 結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運蛋白（ABC 轉(zhuǎn)運蛋白）系統(tǒng)上調(diào)。理想的發(fā)酵溫度可以加快發(fā)酵進程，非最佳溫度下滯后期相當長，并且對乳酸菌的酶活性造成不利影響，導(dǎo)致更長的生產(chǎn)時間。除此之外，溫度對乳酸菌生物量如乳酸的生產(chǎn)具有重要影響，DSM 20531T細胞生長在含淀粉的培養(yǎng)基中對溫度具有很強的依賴性。所以在乳酸菌高密度培養(yǎng)條件的優(yōu)化實驗中，溫度的優(yōu)化是很重要的考慮條件，它能夠增強生物活性和產(chǎn)生更高的生物量。

3.2 通氣與攪拌

對乳酸菌生長的外部因素如攪拌、通氣條件的研究也有助于生產(chǎn)高效能的益生菌制劑。乳酸菌是兼性厭氧型微生物，所以必須考慮氣相環(huán)境對菌株生長的影響，與酸堿度、溫度的影響效果不同，它可能會影響微生物的生長和代謝模式，只有降低環(huán)境中或菌株自身產(chǎn)生的活性氧的威脅，才能提高乳酸菌的存活力。乳酸菌在氮氣等惰性氣體條件下的生理活性、比生長速率、營養(yǎng)物質(zhì)消耗速率和細胞存活率最高，發(fā)酵處于最優(yōu)狀態(tài)，最大活菌數(shù)可高達到1.8×10CFU/mL。研究表明通氣方式也對益生菌的最大活菌數(shù)產(chǎn)生影響，乳桿菌R8 在間歇通氮氣的條件下，菌體的終濃度最高，OD 值達到12 以上，在持續(xù)通氮氣或用氮氣保壓的條件下，菌體終濃度比不通氣時還低。

在乳酸菌液體高密度培養(yǎng)過程中，攪拌的作用是使中和劑與發(fā)酵培養(yǎng)液混合均勻，及時中和高密度培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的酸，減少酸性物質(zhì)的積累對菌體生長的抑制作用，同時增大培養(yǎng)物氣液相的接觸面積。攪拌速率不宜過大，以免對細胞產(chǎn)生較大的剪切力，損傷細胞，影響細胞活性。攪拌和通氣有利于培養(yǎng)基的均勻性、底物的可用性、以及改變細胞代謝產(chǎn)物和生成氧轉(zhuǎn)移的增加，是乳酸菌生物量生產(chǎn)的重要條件，Gutierrez-Sarmiento 等對BAL-03-ITTG 的攪拌條件和曝氣條件等重要生長因素進行研究，發(fā)現(xiàn)在300 r/min 攪拌、0.13 vvm曝氣條件下，乳酸菌的生長及生物量生產(chǎn)比未處理條件下高，首次為植物乳桿菌BAL-03-ITTG 在攪拌罐生物反應(yīng)器中生長提供了有價值的信息。

4 乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)改進

對乳酸菌生長動力學(xué)模型進行分析，根據(jù)抑制因素的不同主要分為底物抑制模型和代謝產(chǎn)物抑制模型。底物濃度不足或過高都會限制細胞生長。同時在乳酸菌高密度培養(yǎng)過程中，會形成大量的乳酸等代謝產(chǎn)物，造成生長環(huán)境pH 降低，阻礙細胞生長。減少這些抑制因素對乳酸菌生長的影響，可實現(xiàn)乳酸菌的高密度培養(yǎng)。如表2 所示，分批培養(yǎng)技術(shù)是最常見的培養(yǎng)技術(shù)，通過調(diào)節(jié)生長的pH 環(huán)境，維持菌株增殖的穩(wěn)態(tài)環(huán)境來促進乳酸菌高密度生長，通過補加新鮮培養(yǎng)基的分批補料培養(yǎng)技術(shù)可同時減少底物和產(chǎn)物抑制的影響。膜培養(yǎng)技術(shù)是在膜條件基礎(chǔ)上，供給新鮮培養(yǎng)基的同時，定期除去發(fā)酵培養(yǎng)的低分子產(chǎn)物，更大程度地減少培養(yǎng)環(huán)境的壓力，延長乳酸菌的生長時間。除此之外，固定化培養(yǎng)技術(shù)將乳酸菌細胞固定在特定的培養(yǎng)基質(zhì)上，使其盡可能地遠離培養(yǎng)環(huán)境帶來的不利影響，為乳酸菌的生長提供一個相對穩(wěn)定的環(huán)境，增強乳酸菌細胞的生長能力。

表2 乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)Table 2 Research methods for high-density cultivation of lactic acid bacteria

5 其它優(yōu)化培養(yǎng)策略

單菌株的代謝途徑和能力可能不夠完善，共同培養(yǎng)、取長補短可以更好地發(fā)揮菌株的益生特性。在連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器（CSTR）和透析膜反應(yīng)器中，混合培養(yǎng)和，研究表明對的生長具有強烈的促進作用，同時也可以將葡萄糖轉(zhuǎn)化為的底物乳酸，生產(chǎn)丙酸鹽和醋酸鹽，實現(xiàn)丙酸較高的生產(chǎn)率。

改善菌株特性也是乳酸菌高密度培養(yǎng)的技術(shù)之一。對菌株進行馴化可以得到高糖耐受型、耐熱型、耐鹽型、耐酸型、耐冷型的乳酸菌菌株。通過基因工程進行重組也可得到耐受型或高產(chǎn)型的菌株。通過分析菌株的基因序列，對啟動子進行優(yōu)化也可以改變?nèi)樗峋奶谴x通路，增強對不同糖類的利用能力。物理手段超聲處理也可以改變細胞的膜通透性，增加營養(yǎng)物質(zhì)的運輸。林楊等采用常壓室溫等離子（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術(shù)，獲得1 株蛋白酶活性穩(wěn)定且高產(chǎn)酸的菌株Y8-6，為進一步開發(fā)相關(guān)優(yōu)質(zhì)乳酸菌資源及其在食品發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

6 總結(jié)與展望

乳酸菌高密度培養(yǎng)的顯著優(yōu)勢在于能夠以較低的發(fā)酵體積和較短的發(fā)酵周期獲得較高的目標菌體密度。乳酸菌高密度培養(yǎng)是當前食品發(fā)酵工業(yè)研究的熱點之一，也是實現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵劑規(guī)?；a(chǎn)與應(yīng)用的重要目標和方向。乳酸菌高密度培養(yǎng)優(yōu)化一般包括以下兩個方面：一是通過培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化為乳酸菌的生長提供最合理的營養(yǎng)要素，在最佳生長條件下獲得細胞最大化；二是通過控制培養(yǎng)方式，使菌株始終處于生長的最佳培養(yǎng)環(huán)境，延長乳酸菌生長的對數(shù)期和穩(wěn)定期，獲得高密度的細胞。

但仍有一些方向需要給予更多的關(guān)注和研究。首先，對高密度培養(yǎng)來說，基礎(chǔ)培養(yǎng)基至關(guān)重要。它必須能獲得大量高活力的菌體、培養(yǎng)后菌體需能夠被分離出來且成本低廉。然而，由于菌體對生長要求具有特異性，部分菌體與培養(yǎng)基的分離也一直影響其是否能更好地被利用。另外，培養(yǎng)基的成本也是工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵，雖然已有研究表明副產(chǎn)物有望作為乳酸菌生長的培養(yǎng)介質(zhì)，然而還沒有研究表明僅利用生物副產(chǎn)物就可實現(xiàn)乳酸菌的高密度培養(yǎng)，所以仍需對乳酸菌高密度培養(yǎng)的生長介質(zhì)和生長條件進行探究。

其次，高密度培養(yǎng)的菌株種類和功能比較單一，不能滿足實際生產(chǎn)和生活需求。已有的辦法是從已知的生長環(huán)境中分離篩選所需要的目標菌株或利用新技術(shù)和新方法增強乳酸菌生物活性和生長能力，以便更加貼合實際發(fā)酵生產(chǎn)的要求，節(jié)省培養(yǎng)成本。但是乳酸菌市場應(yīng)用日益廣大，仍需開發(fā)探索不同種類和功能的乳酸菌。

最后，不同菌株的代謝途徑或酶活性可能有所不同，需要對其產(chǎn)能方式進行探究，以便在高密度培養(yǎng)過程中，更好地優(yōu)化影響生長過程的重要營養(yǎng)因素，延長細胞生長期，獲得高密度的細胞。同時還能通過改變產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，減緩生長環(huán)境對細胞的壓力，提高細胞繁殖活力。