外源γ-氨基丁酸對(duì)鮮切南瓜品質(zhì)和γ-氨基丁酸代謝的影響

梁靜宜，郭 凡，趙 科，王鴻飛，許 鳳

（寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江寧波 315800）

-氨基丁酸作為一種自由態(tài)的四碳非蛋白氨基酸，廣泛分布在自然界的原核生物和真核生物中，是哺乳動(dòng)物中樞系統(tǒng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與腦循環(huán)，具有降低神經(jīng)元細(xì)胞活性、防止動(dòng)脈硬化、改善肝功能和降低血壓等作用。在植物體內(nèi)合成GABA 有兩條代謝途徑，主要由谷氨酸在GAD 的催化下生成GABA，由GABA-T 催化GABA 進(jìn)入三羧酸循環(huán)中，這條代謝途徑被稱為GABA 支路。GABA 在多胺降解途徑中通過(guò)二胺氧化酶（Diamine oxidase，DAO）和多胺氧化酶（Polyamine oxidase，PAO）兩種關(guān)鍵酶催化多胺（腐胺（Putrescine，Put）、精胺（Spermine，Spm）、亞精胺（Spermidine，Spd））后，再由4-氨基丁醛脫氫酶（Aminoaldehyde decarboxylase，AMADH）將其氧化生成GABA 留在植物體內(nèi)。

研究發(fā)現(xiàn)，GABA 參與植物C/N 營(yíng)養(yǎng)平衡、植物微生物相互作用、抵御蟲害、響應(yīng)生物和非生物脅迫以及作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子調(diào)控傳導(dǎo)等活動(dòng)。當(dāng)生物體在處于鈉鹽、低氧、機(jī)械損傷等脅迫條件下時(shí)，會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，富集大量GABA 來(lái)提高自身的抗逆性，從而更好地適應(yīng)環(huán)境。機(jī)械損傷下獼猴桃和胡蘿卜體內(nèi)會(huì)迅速合成大量的GABA，響應(yīng)非生物脅迫。近年大量關(guān)于GABA 外源應(yīng)用的研究指出，GABA 用于水果或蔬菜的采后處理，可以有效緩解生物或非生物脅迫的影響。

南瓜富含多種氨基酸和維生素，具有預(yù)防糖尿病、溶解結(jié)石以及催化分解致癌物質(zhì)等作用，且價(jià)格低廉，已然成為食品界的新寵。近年來(lái)，由于快餐和方便食品行業(yè)的迅速發(fā)展，鮮切產(chǎn)品吸引了大量消費(fèi)者的關(guān)注。鮮切南瓜因其營(yíng)養(yǎng)高，味道好和便利性更是受到消費(fèi)者的廣泛青睞。然而，南瓜受到由加工處理（如去皮、修剪和切割）導(dǎo)致的組織分解引起的損傷，難免會(huì)發(fā)生表皮微生物侵染、營(yíng)養(yǎng)損失、質(zhì)地軟化和顏色變化等情況，降低鮮切產(chǎn)品的潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，需要研究一種方法來(lái)抑制鮮切南瓜品質(zhì)變化，同時(shí)保證產(chǎn)品健康安全。以往對(duì)GABA 的研究主要集中在代謝層面上，然而，GABA 對(duì)鮮切南瓜品質(zhì)的影響與否尚不清楚。本文通過(guò)外源GABA 和GABA 合成抑制劑（3-巰基丙酸，3-MP）處理研究其對(duì)鮮切南瓜中GABA 代謝和品質(zhì)的影響。主要測(cè)定不同處理下鮮切南瓜中谷氨酸、GABA 和多胺含量，GAD、GABA-T、PAO、DAO、AMADH 活性以及相關(guān)基因表達(dá)水平和品質(zhì)指標(biāo)，以解決鮮切南瓜貯藏期間品質(zhì)變化的相關(guān)問(wèn)題，為鮮切南瓜GABA 富集工藝轉(zhuǎn)化提供重要的理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)選用新鮮南瓜（貝貝南瓜）為供試材料，購(gòu)買于京東商場(chǎng)，挑選大小均勻，表面無(wú)病蟲害和機(jī)械損傷；GABA 標(biāo)準(zhǔn)品（98%）、甲醇（色譜純）Sigma-Aldrich 公司；3-巰基丙酸（3-Mercaptopropionic acid，3-MP）、谷氨酸脫氫酶（1 U/mL）分析級(jí)，麥克林；氯化鑭、-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（-NAD+）分析級(jí)，阿拉?。籘ris-HCl 溶液 分析級(jí)，上海生工；腐胺、精胺、亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品 分析純（T≥98%），上海源葉生物科技有限公司；植物總RNA 提取試劑盒 成都福際生物技術(shù)有限公司；RNA isolater Total RNA Extraction Reagent HiScript? Ⅱ QRT SuperMix for qPCR（+Gdna Wiper）試劑盒、ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix 試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)藥分析純。

AFX-2001-U 超純水機(jī) 上海純浦實(shí)業(yè)有限公司；SYNAPT G2 超高效液相色譜儀 美國(guó)Water 公司；UV-3200 型紫外分光光度計(jì) 上海普美達(dá)；Mastercycler nexus PCR 儀 Eppendorf 中國(guó)有限公司；A40426 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；CR-400 型色差儀 柯尼卡美能達(dá)辦公系統(tǒng)（中國(guó)）有限公司；PAL-1 型數(shù)顯糖度計(jì) 日本愛(ài)宕ATAGO 公司；JXDC-200 型氮吹儀 拓赫機(jī)電科技（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理 南瓜在0.02%（v/v）的次氯酸鈉溶液中浸泡2 min 進(jìn)行消毒，將其削皮去瓤后，切成長(zhǎng)約5 cm，寬0.2 cm，高0.5 cm 左右的絲狀，并分別浸泡在80 mmol/L GABA 和80 mmol/L 3-MP 溶液中作為處理組（經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到最佳處理濃度），以浸泡在蒸餾水中的南瓜絲作為對(duì)照組。浸泡10 min 后取出用濾紙擦去表面多余的液體并放置在塑料透明鮮切盒內(nèi)，并置于4 ℃，相對(duì)濕度90%培養(yǎng)箱中貯藏，分別于0、3、6、9 h 取樣，用液氮快速冷凍，并置于-80 ℃冰箱中備用。在本實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)處理至少使用12 個(gè)南瓜。

1.2.2 品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定 菌落總數(shù)測(cè)定參考食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定（GB 4789.2-2016），白度使用色差儀測(cè)定，隨機(jī)選取若干點(diǎn)測(cè)定樣品的顏色參數(shù)，得到白色系中的L值，白度值（White index,WI）的計(jì)算公式為：WI=100-[（100-）++]；可溶性固形物含量的測(cè)定采用郭丹等的方法，取10 g 的樣品與20 mL 的蒸餾水使用勻漿機(jī)混勻，取200 μL 的溶液放置在糖度計(jì)上測(cè)定，記錄數(shù)值；-胡蘿卜素含量的測(cè)定參考食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中胡蘿卜素的測(cè)定（GB/T 5009.83-2003）。

1.2.3 谷氨酸與GABA 含量的測(cè)定 谷氨酸含量的測(cè)定是在Al-Quraan 等的方法上稍作修改，將冷凍樣品用冰浴在3 mL 氯化鑭（0.05 mol/L）中進(jìn)行提取。在0.5 mL 提取物中加入0.2 mL 的0.1 mmol/L Tris-HCl，0.1 mL 的7.5 mmol/L-NAD和1 U/mL谷氨酸脫氫酶后充分震蕩混合，然后將混合液30 ℃水浴孵育60 min，讀取波長(zhǎng)為340 nm 時(shí)的吸光度。結(jié)果用mmol·kg來(lái)表示。計(jì)算公式如下：

GABA 含量的測(cè)定參照Hu 等的方法，在氯化鑭溶液中加入0.5 g 樣品進(jìn)行萃取，在室溫下震蕩15 min后12000×g 離心5 min。取2 mL 上清液加入1 mol/L氫氧化鉀溶液，振蕩5 min 后12000×g 離心5 min。取0.4 mL 上清液依次加入800 μL 1 mmol/L 硼酸鹽緩沖液（pH9.0）、1 mL 體積分?jǐn)?shù)為6%的苯酚和0.5 mL 5%的次氯酸鈉，混合均勻后沸水浴10 min，拿出后立即冰浴5 min。加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，混勻后采用紫外分光光度法，在645 nm 處測(cè)定吸光度。結(jié)果用mmol·10 gFW 來(lái)表示。計(jì)算公式如下：

1.2.4 谷氨酸脫羧酶與GABA 轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定GAD 活性的測(cè)定參考Bartyzel 等的方法并稍加修改，稱取1.0 g 南瓜樣品，在冰浴條件下通過(guò)含有-巰基乙醇、PLP、EDTA 和甘油的磷酸鉀緩沖液研磨獲得勻漿。最大轉(zhuǎn)速離心10 min 后，取0.5 mL 粗酶液加入含有10 g/L 谷氨酸緩沖液，40 ℃下水浴2 h后通過(guò)沸水浴5 min 終止反應(yīng)。用等量蒸餾水對(duì)照，在645 nm 下比色，測(cè)吸光度。每分鐘生成1 μmol的GABA 為GAD 活性為一個(gè)酶活力單位。

GABA-T 活性的測(cè)定參照Deewatthanawong等的方法并加以修改，取0.5 g 南瓜果肉，加入Tris-HCl 提取緩沖液研磨，離心獲得上清液即為酶液。取0.5 mL 酶液與緩沖液混合均勻后，放置30 ℃水浴中孵育1 h，加入磺基水楊酸后，再在25 ℃下孵育20 min 終止反應(yīng)。在340 nm 處讀取吸光值，每30 s 記錄1 次，記錄5 min。以1 min 內(nèi)OD降低0.01 為一個(gè)酶活力單位（U），活性表示為U·g。

1.2.5 多胺的測(cè)定 參照宋春波等所述的方法，將南瓜樣品在冰浴中加入3 mL 5%預(yù)冷的高氯酸進(jìn)行均質(zhì)研磨，12000×g 離心收集上清液。取2 mL 的上清液與2 mL 的NaOH（2 mol/L）和10 μL 的苯甲酰氯混合在37 ℃下孵育1 h，然后加入飽和NaCl溶液和乙醚，充分振蕩混合均勻。通過(guò)2000×g 低速離心后，將1 mL 有機(jī)溶劑相轉(zhuǎn)移至新管中，并用氮吹儀吹干。待乙醚蒸發(fā)后，加入500 μL 甲醇，充分震蕩得到待測(cè)定的多胺樣品。通過(guò)配備反相Sun Fire C色譜柱（150 mm×3.9 mm，4 μm）的高效液相色譜（HPLC）分析苯甲?；蟮亩喟罚V條件：柱溫30 ℃；流動(dòng)相為甲醇和水（比例為64:36，v/v）；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；流速0.7 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

將Put、Spd 和Spm 3 種多胺分別配成1 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，然后將這3 種標(biāo)準(zhǔn)貯備液分別苯甲酰化。將衍生化的母液稀釋形成不同濃度的多胺標(biāo)準(zhǔn)液（1、5、12.5、25、50 mmol/L）進(jìn)樣，根據(jù)標(biāo)品進(jìn)樣量制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后以峰面積計(jì)算多胺的含量。以鮮樣中的mg/kg 來(lái)表示。

1.2.6 胺氧化酶活性測(cè)定 參照Gao 等的方法測(cè)定DAO 和PAO 活性。取1 g 南瓜樣品與磷酸鉀緩沖液（pH6.5）冰浴研磨后，將樣品在4 ℃下12000×g離心，收集上清液。取0.5 mL 上清液加入磷酸鈉緩沖液（含有0.2 mL 顯色液，250 U/mL 辣根過(guò)氧化物酶溶液）。通過(guò)分別添加20 mmol/L 腐胺溶液以及精胺和亞精胺混合溶液，啟動(dòng)反應(yīng)來(lái)進(jìn)行DAO 和PAO 測(cè)定，在555 nm 處測(cè)定吸光值。每30 s 記錄1 次，記錄5 min。以1 min 內(nèi)OD降低0.01 為一個(gè)酶活力單位（U），活性表示為U·g。

AMADH 活性測(cè)定參照?ebela 等的方法稍作修改，取1 g 南瓜樣品，加入100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（2 mmol/L 二硫蘇糖醇，乙二胺四乙酸，10%蔗糖），12000×g 高速離心30 min，收集1 mL 酶液加入1 mL Tris-HCl 反應(yīng)液和4-氨基丁醛溶液用以啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃條件下孵育10 min 后，在340 nm 處測(cè)定吸光值。每1 min 記錄1 次，記錄10 min。以1 min內(nèi)OD降低0.01 為一個(gè)酶活力單位（U），活性表示為U·g。

熒光定量使用Vazyme ChamQ TM Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒，采用2法來(lái)計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參基因采用（XM_023077371.1），5'-AAACCTTACCAGCCCTTGAC-3'（正 向）和5'-CGCTCGTTATAGGACTTGACC-3'（反向）（XM_023082806.1）為5'-CCGTCGAAGGCCGATATCAA-3'（正向）和5'-AGCTCATCTGCTCTCACTTCAC-3'（反向），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)，使用SPSS18.0（SPSS，Chicago，IL，USA）統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s Range Test（＜0.05）分析數(shù)據(jù)之間的差異性，數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。使用不同的字母表示同一貯藏時(shí)間處理方式之間存在顯著性差異，并用Origin 10.0 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源GABA 和3-MP 對(duì)鮮切南瓜品質(zhì)的影響

在鮮切果蔬加工工藝中，切割過(guò)程容易導(dǎo)致呼吸強(qiáng)度增加，鮮切表面更容易受到微生物感染，保質(zhì)期縮短，因此菌落總數(shù)是用來(lái)評(píng)價(jià)果蔬安全性和貨架期的重要指標(biāo)。由圖1A 可知，在貯藏過(guò)程中，對(duì)照組和處理組中菌落總數(shù)無(wú)顯著差異（＞0.05）。在貯藏9 h 后，南瓜中的菌落總數(shù)均未超過(guò)10CFU·g，說(shuō)明南瓜符合可食用和商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。白度作為衡量鮮切南瓜貯藏期間新鮮程度的重要指標(biāo)之一。如圖1B 所示，鮮切和外源處理組WI 值均無(wú)明顯變化。另外，研究發(fā)現(xiàn)南瓜果實(shí)中含有豐富的-胡蘿卜素，使南瓜富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并呈現(xiàn)豐富鮮艷的顏色。胡蘿卜素的含量差異也會(huì)導(dǎo)致果肉發(fā)生顏色變化。由圖1D 可知，三組南瓜樣品中的-胡蘿卜素含量不存在顯著性差異（＞0.05）。根據(jù)WI 和-胡蘿卜素的數(shù)據(jù)趨勢(shì)可知，外源GABA 不會(huì)影響果肉的色澤，從而影響消費(fèi)者的購(gòu)買欲?？扇苄怨绦挝锸怯绊懝麑?shí)風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)的主要成分。對(duì)照組和GABA 處理組的可溶性固形物含量在貯藏期間沒(méi)有顯著變化（＞0.05），而抑制劑組的含量顯著低于對(duì)照組（＜0.05）。該結(jié)果表明GABA 處理能較好地維持南瓜果實(shí)中可溶性固形物含量。綜上所述，外源GABA 條件下，鮮切南瓜在貯藏期內(nèi)的品質(zhì)并未受到影響，且符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 外源GABA 和3-MP 處理對(duì)鮮切南瓜中菌落總數(shù)、白度、可溶性固形物和β-胡蘿卜素含量的影響Fig.1 Effect of exogenous GABA and 3-MP treatments on the total number of colonies,whiteness,soluble solids and βcarotene content in fresh-cut pumpkins

2.2 外源GABA、3-MP 對(duì)谷氨酸和GABA 含量的影響

谷氨酸作為合成GABA 的前體物質(zhì)，植物體內(nèi)GABA 的富集受到谷氨酸濃度的影響。由圖2A可知，對(duì)照組和外源3-MP 組的谷氨酸含量在貯藏期間不斷下降，而外源GABA 組中的谷氨酸含量則呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，GABA 處理組谷氨酸含量顯著低于對(duì)照組和抑制劑處理組（＜0.05），3-MP 處理后的南瓜絲在整個(gè)貯藏期間都保持著較高的谷氨酸含量。這表明，外源GABA 可以促進(jìn)更多的谷氨酸向GABA 合成和轉(zhuǎn)化。為了進(jìn)一步研究外源GABA 對(duì)內(nèi)源性GABA 的影響，本文測(cè)定了鮮切南瓜中GABA 的含量，由圖2B 所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，GABA 處理鮮切南瓜中GABA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而對(duì)照組中GABA含量整體無(wú)明顯變化，經(jīng)GABA 處理組在6 h 時(shí)的GABA 含量達(dá)到最大值，約7 mmol·10 gFW，且顯著高于對(duì)照組中GABA 含量57%（＜0.05）。而外源3-MP 處理組的GABA 含量顯著低于對(duì)照組（＜0.05），這說(shuō)明3-MP 具有抑制內(nèi)源GABA 合成的作用。與本文結(jié)果相似的是，外源GABA 降低了采后西葫蘆果實(shí)和蘋果中谷氨酸的含量，提高了GABA含量。

圖2 外源GABA 和3-MP 處理對(duì)鮮切南瓜中谷氨酸和GABA 含量的影響Fig.2 Effect of exogenous GABA and 3-MP treatments on glutamate and GABA contents in fresh-cut pumpkins

2.3 外源GABA、3-MP 對(duì)GAD 和GABA-T 活性的影響

GABA 支路中，GAD 是GABA 支路中GABA合成的限速酶。如圖3A 所示，對(duì)照組中的GAD呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，外源GABA 組在貯藏期間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，維持較高的GAD 活性。這表明GABA 處理可以提高南瓜中GAD 的活性，促進(jìn)體內(nèi)谷氨酸轉(zhuǎn)化成GABA。而抑制劑處理后，南瓜中GAD 活性顯著（＜0.05）低于對(duì)照組和GABA 處理組（圖3A）。另外，GABA 的積累不是GAD 的單一作用，GABA-T 能催化GABA和琥珀酸半醛的可逆轉(zhuǎn)化，因此GABA-T 活性的變化對(duì)GABA 的富集也同樣至關(guān)重要。如圖3B 所示，GABA 處理組和對(duì)照組中GABA-T 活性在貯藏期間呈緩慢上升的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，GABA 處理組GABA-T 活性無(wú)顯著變化（＞0.05），而3-MP 處理顯著抑制了GABA-T 活性（＜0.05），維持在較低水平。這種影響趨勢(shì)與GABA 處理對(duì)內(nèi)源GABA含量變化趨勢(shì)基本一致。在研究楊樹(shù)、人參和煙草遭受脅迫時(shí)，都觀察到了類似的結(jié)果。因此，綜合兩個(gè)酶指標(biāo)來(lái)看，GABA 處理能促進(jìn)GAD 和GABA-T 酶活性，激活GABA 支路，從而一定程度上促進(jìn)鮮切南瓜富集大量GABA 以應(yīng)對(duì)脅迫。因此，本文認(rèn)為外源GABA 處理誘導(dǎo)的內(nèi)源性GABA 積累是由GABA-T 和GAD 活性增加所引起的。

圖3 外源GABA 和3-MP 處理對(duì)鮮切南瓜GAD 和GABA-T 活性的影響Fig.3 Effect of exogenous GABA and 3-MP treatments on GAD and GABA-T activities in fresh-cut pumpkins

2.4 外源GABA、3-MP 對(duì)多胺含量的影響

植物響應(yīng)環(huán)境脅迫與多胺的分解代謝有關(guān)，在脅迫條件下，Put、Spd 和Spm 會(huì)氧化生成GABA。如圖4 所示，外源GABA 處理組中腐胺含量在前3 h急速下降，在后續(xù)6 h 無(wú)明顯變化，GABA 處理組中腐胺含量顯著低于對(duì)照組（＜0.05），對(duì)照組和3-MP 處理組中腐胺含量均呈先上升后下降的趨勢(shì)，6 h前兩組無(wú)明顯差異（＞0.05），在6 和9 h 出現(xiàn)顯著性差異（＜0.05）（圖4A）。如圖4B 所示，在整個(gè)貯藏過(guò)程中，對(duì)照組和兩個(gè)處理組精胺含量呈先上升后下降趨勢(shì)，除前3 h 無(wú)顯著差異外（＞0.05），在后6 h中對(duì)照組中精胺含量顯著高于外源GABA 組（＜0.05）。抑制劑處理提高了精胺含量，在貯藏期間保持了高于對(duì)照組的水平。GABA 處理組中的亞精胺含量在整個(gè)貯藏過(guò)程中逐漸降低，對(duì)照組呈現(xiàn)先下降再上升，然后下降的變化趨勢(shì)，而抑制劑處理組中的含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，且與對(duì)照組相比，外源GABA 組中亞精胺含量顯著降低（＜0.05）。與本文結(jié)果相似的是，外源GABA 可以通過(guò)激活多胺降解途徑，改變多胺生物合成能力，調(diào)節(jié)了游離Spd 和Spm 與游離Put 的比例，一定程度的促進(jìn)甜瓜幼苗內(nèi)GABA 含量增加。因此，本文認(rèn)為外源應(yīng)用GABA 可能是通過(guò)刺激多胺代謝，降低內(nèi)源多胺水平，促進(jìn)GABA 在南瓜體內(nèi)富集，從而維持鮮切南瓜采后品質(zhì)。

圖4 外源GABA 和3-MP 處理對(duì)鮮切南瓜中多胺含量的影響Fig.4 Effect of exogenous GABA and 3-MP treatments on the content of polyamines in fresh-cut pumpkins

2.5 外源GABA、3-MP 對(duì)DAO、PAO 和AMADH活性的影響

當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，腐胺、精胺和亞精胺可直接或間接被DAO、PAO 和AMADH 等氧化酶氧化生成GABA。胺氧化酶協(xié)同作用參與植物中多胺降解，可以維持植物中GABA 的內(nèi)源性水平。如圖5A 所示，在貯藏期間，對(duì)照組中DAO 活性呈緩慢下降趨勢(shì)，而兩處理組DAO 活性先下降后升高。GABA 處理組的DAO 活性除第9 h 外，其余與對(duì)照組無(wú)顯著差異（＞0.05）。而3-MP 處理組的DAO 活性始終顯著低于對(duì)照組（＜0.05）。對(duì)照組和外源GABA 組中的PAO 活性無(wú)顯著差異（＞0.05）。和其他組相比，抑制劑組呈現(xiàn)較低的酶活性（圖5B）。對(duì)照組和GABA 處理組的AMADH 活性在貯藏期間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，GABA處理顯著提高了AMADH 活性（＜0.05），且AMADH活性始終高于對(duì)照組，而3-MP 處理顯著抑制了AMADH 活性（＜0.05）。

圖5 外源GABA 和3-MP 處理對(duì)鮮切南瓜中DAO、PAO 和AMADH 活性的影響Fig.5 Effects of exogenous GABA and 3-MP treatments on the activities of DAO,PAO and AMADH in fresh-cut pumpkins

雖然GABA 處理對(duì)DAO 和PAO 的酶活性影響不大，但根據(jù)多胺含量和AMADH 的變化趨勢(shì)，推測(cè)外源GABA 處理雖然可以激活多胺降解途徑，增加GABA 含量，但主要還是通過(guò)GABA 支路富集內(nèi)源GABA。與本文結(jié)果相似的是，在大豆發(fā)芽期間，雖然DAO 和AMADH 的活性無(wú)顯著變化，通過(guò)促進(jìn)多胺降解途徑，仍提高了其GABA 含量。近期有研究指出，通過(guò)增強(qiáng)多胺降解途徑催化酶活性，促進(jìn)多胺的代謝能夠迅速積累GABA 并參與防御反應(yīng)系統(tǒng)，但多胺降解途徑合成GABA 的能力遠(yuǎn)低于GABA 支路。綜合以上結(jié)論，本文認(rèn)為GABA的富集有多胺代謝途徑的參與，只是對(duì)GABA 積累的貢獻(xiàn)率較低。

2.6 外源GABA、3-MP 對(duì)CmGAD 基因表達(dá)的影響

如圖6 所示，對(duì)照組和處理組南瓜中表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在6 h 到達(dá)峰值。在貯藏期間，GABA 處理組相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（＜0.05），而3-MP 處理組其表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（＜0.05）?；虮磉_(dá)量與GAD 在貯藏期間活性變化趨勢(shì)相似。同樣也與上調(diào)西蘭花芽菜中、以及楊樹(shù)中基因的表達(dá)量可以促進(jìn)內(nèi)源GABA 含量的結(jié)果一致。因此，本文認(rèn)為外源GABA 可以通過(guò)調(diào)控表達(dá)量，促進(jìn)內(nèi)源GABA 的作用。

圖6 外源GABA 和3-MP 處理對(duì)鮮切南瓜中CmGAD 基因表達(dá)的影響Fig.6 Effect of exogenous GABA and 3-MP treatments on CmGAD gene expression in fresh-cut pumpkins

3 結(jié)論

結(jié)果表明，外源GABA 條件下，促進(jìn)GABA 支路中谷氨酸含量顯著上升，提高了GAD、GABAT 的活性和的基因表達(dá)量，促使足夠多的谷氨酸向GABA 轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)GABA 支路的合成效率。多胺降解途徑中，多胺（Put、Spd、Spm）的轉(zhuǎn)化率顯著提高（＜0.05），雖然DAO 和PAO 的活性與對(duì)照組沒(méi)有顯示出較為明顯的差異，但AMADH 的活性在貯藏期間始終高于對(duì)照組，加速了多胺轉(zhuǎn)化富集成GABA，說(shuō)明多胺途徑同樣得到了激活。而3-MP 抑制劑處理則出現(xiàn)了完全相反的效果，GABA 的含量遠(yuǎn)不如對(duì)照組。綜上所述，GABA 支路和多胺代謝在外源GABA 誘導(dǎo)鮮切南瓜內(nèi)源GABA 具有協(xié)同作用。此外，GABA 處理是一種安全、健康、環(huán)保的果蔬處理方式，可以維持鮮切南瓜中可溶性固形物和顏色的變化，抑制菌落總數(shù)上升，防止鮮切南瓜受到微生物的侵染，減少-胡蘿卜素的流失，有助于保持南瓜的品質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)并未從多胺分子層面進(jìn)行深入研究，這也可能是導(dǎo)致某些酶活性能并未表現(xiàn)出顯著提高的原因之一，若能進(jìn)一步研究，將為GABA處理采后果蔬投入市場(chǎng)應(yīng)用提供更加可靠的理論依據(jù)。