提取方法對(duì)百里香精油化學(xué)成分和抗氧化活性的影響

劉 歡，趙巨堂，羅海濤，任周營(yíng)，邵燈寅,

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047；2.江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，江西南昌 330096）

百里香（L.）是唇形科（Labiatae）百里香屬（）雙子葉植物，因其植株具有濃郁的芳香而聞名，別名地椒、山椒、麝香草等。百里香原產(chǎn)于歐洲南部，在我國(guó)主要分布在甘肅、陜西等黃河以北地區(qū)，被作為食品的調(diào)味品而廣泛種植，是一種重要的烹飪香料，可以去除食品中的腥味，給予其清香和草香味。百里香中除了含有大量揮發(fā)性香味成分外，還有碳水化合物、蛋白質(zhì)和鈣、鐵、鋅、硒等微量元素，具有很高的食用價(jià)值。百里香精油作為主要生物活性成分，其分析和應(yīng)用正在不斷研究與發(fā)展。

百里香精油的用途十分廣泛，由于其具有愉悅、宜人的香氣在香精香料和化妝品工業(yè)被用作芳香劑、增味劑。同時(shí)百里香精油還表現(xiàn)出優(yōu)良的抑菌、防腐和抗氧化性能，亦可有望成為人工合成添加劑的替代品。研究表明，精油的質(zhì)量與提取方法息息相關(guān)，不同提取方法所展現(xiàn)出的物化性質(zhì)有可能差異很大，直接關(guān)系著精油的應(yīng)用效果。目前有關(guān)于百里香精油的研究多集中于對(duì)其抗氧化性和抗菌保鮮方面的探索，對(duì)于不同提取方法的考察鮮有報(bào)道。在各種提取方法中水蒸氣蒸餾法（SD）是指將植物原料浸泡在容器中的水中，然后將混合物煮沸的過程，是一種傳統(tǒng)而且最為常用的精油獲取方式。同時(shí)蒸餾萃取（SDE）結(jié)合了水蒸氣蒸餾與有機(jī)萃取兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，在少量萃取溶劑存在的條件下便可制得更多的樣品，更好地濃縮了香氣成分，一定程度上避免了水蒸氣蒸餾法提取后收集微量精油時(shí)因粘壁而損失的情況。兩種方法最主要的區(qū)別是SDE 法可以將有機(jī)蒸汽和樣品蒸汽交匯后同時(shí)冷凝下來，即在不斷的水蒸氣蒸餾過程中進(jìn)行溶劑萃取，對(duì)于精油的交換萃取更為徹底。等離子體輔助提?。–PAE）則是一種較為新穎的非熱加工提取技術(shù)，等離子是由自由電子、離子、自由基、激發(fā)態(tài)粒子構(gòu)成的整體呈電中性的導(dǎo)電流體，含有多種活性物質(zhì)，主要用于殺菌保藏和組分改性，這種準(zhǔn)中性電離氣體會(huì)導(dǎo)致果皮表面蝕刻，這有助于使存在于角質(zhì)層下方的油腺破裂，便于浸出。Ebadi 等利用冷等離子體輔助提取檸檬馬鞭草精油時(shí)，發(fā)現(xiàn)短時(shí)間的處理檸檬馬鞭草對(duì)于得率的提高有著積極的影響，而且一定程度上改變了精油中揮發(fā)性成分的種類和含量。雖然近年來我國(guó)有文獻(xiàn)報(bào)道過百里香精油的成分及提取工藝的影響，但是嘗試的提取方法多為較常規(guī)的溶劑提取、微波提取等，在百里香精油提取上，對(duì)于同時(shí)蒸餾萃取和等離子體這種新型非熱處理方法輔助提取精油的研究還有待拓展。

本研究采用SD 法、SDE 法和CPAE 法制備百里香精油，綜合比較了傳統(tǒng)和新興提取方法對(duì)于百里香精油得率、揮發(fā)性成分、抗氧化性的影響，考察百里香精油的主要活性物質(zhì)與抗氧化能力的相關(guān)性，旨在獲得更為科學(xué)有效的方法，為百里香精油的工業(yè)生產(chǎn)和綜合利用提供理論依據(jù)和文獻(xiàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百里香葉 品種為銀葉百里香，產(chǎn)地為廣西玉林。樣品預(yù)處理：用蒸餾水將百里香清洗后，在60 ℃烘箱中干燥6 h，室溫冷卻后用粉碎機(jī)粉碎，然后過60 目篩，收集后于干燥陰涼處保存?zhèn)溆谩?/p>

無水硫酸鈉、水楊酸、30%過氧化氫、過硫酸鉀、抗壞血酸、氯化鈉、正己烷、二氯甲烷、氯化鉀、三氯化鐵、無水乙酸鈉、冰醋酸、無水乙醇、甲醇、七水合硫酸亞鐵、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、氯化鋁、無水碳酸鈉 分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；福林酚試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）均為分析純；2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、2-茨醇標(biāo)準(zhǔn)品、百里香酚標(biāo)準(zhǔn)品、香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純 索萊寶生物科技有限公司。

DZF-6055 鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HWS-24 型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DFY-500 中藥粉碎機(jī) 大德中藥機(jī)械有限公司；KE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-III 型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；Agilent7890-7000A氣相色譜-三重串接四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；ZNHW 型智能恒溫電熱套 上海錦岐儀器設(shè)備有限公司；LE2202E 電子天平 梅特勒托利多儀器有限公司；U-T6 紫外可見分光光度計(jì)屹譜儀器制造有限公司；BD/BC-218E 冰柜 浙江星星冷鏈集成股份有限公司；WBFY-205 型微波化學(xué)反應(yīng)器 上海秋佐科學(xué)儀器有限公司；VORTEX 3 旋渦振蕩器 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；非平衡性大氣壓下介質(zhì)阻擋放電（DBD）冷等離子體系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室自主開發(fā)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水蒸氣蒸餾法（SD）提取百里香精油 稱取50 g 百里香粉后添加1000 mL 蒸餾水以及1% NaCl，在組裝好的揮發(fā)油提取器及冷凝裝置中微沸條件下反應(yīng)3 h，提取結(jié)束后冷卻至室溫，取10 mL 正己烷把百里香精油萃取出來，之后添加3 g NaSO，然后置于-18 ℃冰箱冷凍8 h，濾除固體后旋蒸除去溶劑，將百里香精油收集備用。

1.2.2 同時(shí)蒸餾萃?。⊿DE）百里香精油 稱取50 g百里香粉后添加500 mL 蒸餾水以及1% NaCl，在另一個(gè)容器中加入50 mL 二氯甲烷（分析純）并放入60 ℃的水浴鍋中，通過同時(shí)蒸餾萃取裝置將兩個(gè)容器連接起來，等兩邊蒸汽都開始冷凝后打開計(jì)時(shí)器，提取3 h 后再把二氯甲烷收集起來并添加適量無水NaSO除去少量水分，然后置于-18 ℃冰箱冷凍8 h，濾除固體后旋蒸除去溶劑，將百里香精油收集備用。

1.2.3 冷等離子體輔助提?。–PAE）百里香精油 稱取50 g 百里香粉放入直徑18 cm，高度3 cm 的等離子體反應(yīng)室中用等離子體處理，冷等離子體的產(chǎn)生是由非平衡性大氣壓下介質(zhì)阻擋放電（DBD）冷等離子體系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的，該反應(yīng)室由上下兩個(gè)平面銅電極組成，電極之間的距離（放電空間）和電極兩端的電勢(shì)（電壓）可以根據(jù)需要變化。所采用的系統(tǒng)利用大氣（O、N）作為等離子體放電的來源，介質(zhì)阻擋材料為聚氯乙烯（PVC），百里香粉在45 kV 的高壓和50 Hz的頻率處理5 min 結(jié)束，在原料中添加1000 mL 蒸餾水以及1% NaCl，組裝好揮發(fā)油提取器及冷凝裝置在微沸條件下反應(yīng)3 h，提取結(jié)束待收集管冷卻后取10 mL 正己烷把百里香精油萃取出來，之后加3 g NaSO，然后置于-18 ℃的冰箱冷凍8 h，濾除固體后旋蒸除去溶劑，將百里香精油收集備用。

1.2.4 百里香精油得率的計(jì)算

1.2.5 GC-MS 分析條件

1.2.5.1 色譜條件 色譜柱：HP-5MS 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持3 min，以6 ℃/min 升溫至240 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min 升溫至280 ℃，保持3 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，流量：1 mL/min，進(jìn)樣量：1 μL；分流比：20:1。

1.2.5.2 質(zhì)譜條件 電離方式EI，電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃，溶劑延遲4 min；掃描離子質(zhì)量范圍35～550 amu。對(duì)照質(zhì)譜庫(kù)NIST08 結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行成分定性，使用面積歸一化法計(jì)算百里香精油各組分的相對(duì)含量。

1.2.6 總酚、總黃酮、總花青素含量的測(cè)定

1.2.6.1 精油中總酚含量的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[11]的方法，將3 種精油配制為1 mg/mL 乙醇-精油溶液，將0.5 mL 的乙醇-精油溶液與2.5 mL 的Foline-Ciocalteu 試劑（用蒸餾水1:10 稀釋）和2 mL 的7.5%碳酸鈉溶液在試管中混合，搖勻。將混合物在45 ℃的熱水浴中保持15 min。由試劑空白作為參比，在765 nm 處測(cè)量吸光度。以沒食子酸（Gallic acid，GA）作為標(biāo)準(zhǔn)品并按上述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=9.17619x+0.03195（=0.99903），總酚含量以每克精油中沒食子酸的毫克數(shù)表示。

1.2.6.2 精油中總黃酮含量的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[12]的方法，將三種精油配為1 mg/mL 乙醇-精油溶液，吸取1.0 mL 乙醇-精油溶液于10 mL 試管中，加蒸餾水4.4 mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，混勻，靜置5 min；再加入10%氯化鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；然后加4%氫氧化鈉溶液2.0 mL，搖勻，靜置15 min。由試劑空白作為參比，在510 nm 處測(cè)定吸光度。以蘆?。≧utin）作為標(biāo)準(zhǔn)品并按上述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=1.09702x+0.00752（=0.99979），總黃酮含量以每克精油中蘆丁的毫克數(shù)表示。

1.2.6.3 精油中花青素含量的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[13]的方法，將三種精油配成1 mg/mL 乙醇-精油溶液，取1 mL 樣品溶液加入到試管中，然后加入2 mL 氯化鉀緩沖液（pH1.0），充分混合，室溫下放置30 min。用蒸餾水作空白調(diào)零，在510 和700 nm 下測(cè)量混合物的OD 值。然后樣液與乙酸鈉緩沖液（pH4.5）類似地合并，并分別在相同波長(zhǎng)下測(cè)量這些溶液的吸光度。測(cè)量重復(fù)3 次。總花青素含量計(jì)算公式如下：

式中，C 為花青素含量，mg/g；A 為兩種緩沖液吸光度的差值；A表示樣品在520 nm 處測(cè)得的吸光度；A表示樣品在700 nm 處測(cè)得的吸光度；V 為精油溶液體積，mL；M 為矢車菊-3-葡糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量，449.2 ；n 為稀釋倍數(shù)；為摩爾消光系數(shù)，26900（矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)）；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.2.7 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)[14]的方法，將1 mL 精油稀釋液用移液槍轉(zhuǎn)移到5 mL 離心管中，再移取1 mmol/L 的DPPH 反應(yīng)液2 mL，渦旋后在陰暗條件下反應(yīng)30 min，測(cè)得混合液在517 nm下的吸光值A(chǔ)，無水乙醇代替精油測(cè)得A，無水乙醇代替DPPH 反應(yīng)液測(cè)得A，用無水乙醇調(diào)零，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照，平行操作重復(fù)3 次。清除率按下式計(jì)算：

式中，R：清除率，%；A：空白組吸光值；A：樣品組吸光值；A：無水乙醇代替DPPH 反應(yīng)液所得吸光值。

1.2.8 ABTS 自由基清除能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)[15]的方法，分別用10 mL 容量瓶配制好7 mmol/L ABTS 溶液與2.5 mmol/L 過硫酸鉀溶液后在燒杯中混合，避光保存16 h 后即為ABTS 儲(chǔ)備液，然后用無水乙醇將其稀釋成734 nm 下OD 值為0.70±0.02 即得淡綠色的ABTS 工作液。將1 mL 精油-無水乙醇稀釋液與3 mL 上述工作液在5 mL 離心管中混合后于陰暗條件下反應(yīng)30 min，在734 nm 處測(cè)定吸光值A(chǔ)，無水乙醇代替精油測(cè)得A，無水乙醇代替ABTS 工作液測(cè)得A，用無水乙醇調(diào)零，以抗壞血酸為陽性對(duì)照，平行操作重復(fù)3 次。清除率按下式計(jì)算：

式中，R：清除率，%；A：空白組吸光值；A：樣品組吸光值；A：無水乙醇代替ABTS 工作液所得吸光值。

1.2.9 總抗氧化能力測(cè)定（FRAP 法）參考文獻(xiàn)[16]的方法測(cè)定總抗氧化能力。FRAP 工作液的配置：將0.3 mol/L 醋酸緩沖溶液（用1 mol/L HCl 調(diào)至pH3.6）、10 mmol/L 2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）鹽酸溶液和20 mmol/L FeCl溶液按10:1:1 體積比配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。分別取0.2～1.6 mmol/L FeSO0.1 mL，加入1.8 mL FRAP 工作液和3.1 mL 的蒸餾水，37 ℃下水浴30 min，在593 nm 處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0.4990x+0.0223（=0.9990）。分別取0.1 mL 精油-乙醇溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL），同法處理，用無水乙醇調(diào)零，測(cè)定吸光度。以抗壞血酸作為陽性對(duì)照，樣品的總抗氧化能力以FRAP 值表示，1 FRAP=1 mmol/L FeSO，即樣品的抗氧化能力相當(dāng)于FeSO濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel（2010 版本，美國(guó)微軟公司）和SPSS（25.0 版本，美國(guó)IBM 公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，方差分析（ANOVA）采用鄧肯多重比較（=0.05），相關(guān)性分析以Pearson 相關(guān)系數(shù)表示；使用Origin（2018 版本，美國(guó)IBM 公司）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。所有測(cè)定重復(fù)三次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對(duì)精油得率的影響

所有樣品的色狀均一，呈現(xiàn)淡黃色。不同提取方法下的百里香精油得率如圖1 所示，可以看出在三種提取方法下百里香精油的得率有顯著差異（＜0.05），得率從高到低依次是SDE（1.30%）＞CPAE（1.17%）＞SD（0.98%）。本研究中，SDE 法相比SD法萃取更為完全，所以提取效果更好，而CPAE 可能是通過等離子體的作用引起離子和電子的轟擊，導(dǎo)致百里香表面的刻蝕，使油腺體破裂，從而提高了得率。精油得率受原料生長(zhǎng)環(huán)境因素和提取方法的影響很大。徐世千等采用了水蒸氣蒸餾法、有機(jī)溶劑萃取法和超臨界CO萃取法來提取百里香精油，得率在0.19%～0.27%，其中，超臨界CO萃取法的產(chǎn)量最高，但是質(zhì)量較差，不利于進(jìn)一步利用。也有研究者優(yōu)化超高壓提取和微波提取百里香精油，最佳條件下得率在1.04%～1.11%之間。

圖1 不同提取方法對(duì)百里香精油得率的影響Fig.1 Effect of different extraction methods on yield of essential oil from Thymus vulgaris L.

2.2 提取方法對(duì)精油化學(xué)成分的影響

2.2.1 百里香精油揮發(fā)性成分分析 本實(shí)驗(yàn)采用GC-MS 對(duì)三種方法提取的百里香精油進(jìn)行了揮發(fā)性成分分析，結(jié)果如表1 所示，總計(jì)鑒定出36 種化合物，占總成分的98.670%～99.774%，其中，萜烯化合物含量占總成分的6.368%～9.976%，醇類化合物含量占總成分的50.348%～51.575%，酮類化合物含量占總成分的1.448%～1.744%，酚類化合物占總成分的30.296%～35.200%，其他化合物占總成分的4.395%～7.681%。

表1 百里香精油成分的 GC-MS 分析Table 1 GC-MS analysis of essential oil from Thymus vulgaris L.

百里香精油中的主要成分（含量超過10%）有4 個(gè)，含量最高的是2-茨醇（32.194%～32.515%），又稱為龍腦、冰片，它具有一定清熱明目的功效和類似薄荷和胡椒的香氣特征；其次是香芹酚（17.265%～19.998%）和百里香酚（13.031%～15.202%），它們是從葉綠體中產(chǎn)生的含氧單萜，有著濃郁的麝香味被廣泛用于制作香料，也是評(píng)估百里香精油質(zhì)量的重要參數(shù)；然后是-松油醇（11.296%～12.012%），它有著較強(qiáng)的抑菌、抗氧化和驅(qū)蚊活性。百里香精油是這些高含量化合物的天然來源。與已發(fā)表的報(bào)道相比，本研究百里香精油的揮發(fā)性成分中，2-茨醇代替百里香酚成為精油中含量最高的組分，這種差異主要是由于原料產(chǎn)地和生長(zhǎng)條件的不同而導(dǎo)致的。Miguel 等的研究也給出了較為接近的結(jié)果，觀察到不同采收期、采集地的百里香精油的2-茨醇含量在10.7%～30.8%范圍內(nèi)，Borges 等也發(fā)現(xiàn)百里香精油（原料產(chǎn)地為巴西）的揮發(fā)性成分中以2-茨醇為主要化合物，而更多文獻(xiàn)顯示出用該品種百里香所提的精油其百里香酚含量在39.5%～71.29%之間，占據(jù)主導(dǎo)地位，2-茨醇含量則在1.19%～2.14%之間。在其他組分中，p-聚傘花烴和-萜品烯是所有百里香品種都具有的成分，也有研究者報(bào)道-萜品烯可以通過中間產(chǎn)物p-聚傘花烴來合成百里香酚。

研究表明，提取參數(shù)中的許多因素，如溫度、時(shí)間、提取過程的類型以及原料產(chǎn)出的地點(diǎn)、土壤成分、濕度、海拔等許多其他環(huán)境因素都會(huì)影響精油的含量和組成。三種方法在成分上所表現(xiàn)出的差異可以歸因于SDE 法中有機(jī)蒸汽與樣品蒸汽可以進(jìn)行更徹底的交換和萃取，從而獲取更多有效成分；而在CPAE 法中等離子體的應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生活性物質(zhì)和自由基，可能導(dǎo)致精油化合物的氧化降解或異構(gòu)化。

總體而言，與傳統(tǒng)的SD 法相比，SDE 法和CPAE法得到更高的2-茨醇、百里香酚和香芹酚含量，精油質(zhì)量更高。

2.2.2 百里香精油總酚、總黃酮、花青素含量分析目前為止進(jìn)行的研究已經(jīng)證實(shí)，百里香不僅被認(rèn)為是酚類和類黃酮的重要來源，而且還具有作為天然抗氧化劑的前景?？偡?、總黃酮和花青素含量是廣泛用于評(píng)估樣品中抗氧化活性的重要指標(biāo)。不同提取方法得到的百里香精油抗氧化活性含量如表2 所示，水蒸氣蒸餾法相比其他方法總酚當(dāng)量最低，只有129.51 mg 沒食子酸當(dāng)量，SDE 法的精油總酚含量最高，可達(dá)133.67 mg 沒食子酸當(dāng)量，但兩者并無顯著差異（＞0.05）。這與GC-MS 結(jié)果分析里三種樣品酚類含量的比較結(jié)果相一致?？傸S酮的含量在47.53～54.82 mg Rutin/g EO 之間，SDE 法與CPAE 法得到的精油在總黃酮含量上有顯著差異（＜0.05）?；ㄇ嗨氐暮吭?.08～0.32 mg/g EO，其中，SDE 法提取的百里香精油中含量最高，其次是CPAE 法和SD 法，而且SDE 法與其他方法相比有顯著性差異（＜0.05）。

表2 百里香精油中總酚、總黃酮、花青素含量Table 2 Contents of total phenols,flavonoids and anthocyanins in Thymus vulgaris L.essential oil

2.3 提取方法對(duì)精油抗氧化活性的影響

2.3.1 百里香精油對(duì)DPPH 自由基的清除能力DPPH 自由基清除活性測(cè)試是最常用的抗氧化活性評(píng)估方法。由圖2 可以看出，在0.5～5 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，三種精油對(duì)DPPH 自由基都有著良好的清除能力，呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。SDE 法提取的精油在2 mg/mL 時(shí)清除率便可達(dá)到95%以上，此時(shí)已接近同濃度V的清除活性，但總體上抗氧化活性要弱于V。SDE 法、CPAE 法、SD法精油的IC分別為0.57、0.86、1.28 mg/mL，所以DPPH 抗氧化活性排序?yàn)椋篠DE＞CPAE＞SD。

圖2 百里香精油對(duì)DPPH 自由基的清除能力Fig.2 Scavenging activity of Thymus vulgaris L.essential oil on DPPH free radicals

不同精油間抗氧化性的差異可能歸因于酚類化合物含量的不同。因此，表現(xiàn)出較高抗氧化活性的精油其總酚含量可能更高。近年來，百里香精油的抗氧化能力已經(jīng)得到深入研究。百里香精油里富含的百里香酚和香芹酚與它們較高的自由基清除活性密切相關(guān)。酚類化合物的抗氧化原理可以解釋為由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)允許它們向自由基供氫，從而使自由基被還原。此外，由單萜酚和倍半萜組成的精油已被認(rèn)為具有更高的抗氧化能力。

2.3.2 百里香精油對(duì)ABTS 自由基的清除能力 由圖3 可知，在0.02～1 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，三種精油對(duì)ABTS 自由基都有著良好的清除能力，呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。SDE 法提取的精油在1 mg/mL 時(shí)已接近同濃度V的清除活性，CPAE 法相比SD 法抗氧化效果略有提高，但差距并不明顯。SDE 法、CPAE 法、SD 法精油的IC分別為0.018、0.022、0.028 mg/mL，所以ABTS 抗氧化活性排序?yàn)椋篠DE＞CPAE＞SD。Mayara 等也報(bào)道了百里香精油極強(qiáng)的ABTS 自由基清除活性，除此之外還研究了百里香精油主要揮發(fā)性成分的單體抗氧化性，發(fā)現(xiàn)只有百里香酚和香芹酚具有高效清除自由基的功能（IC分別為3.7 μg/mL 和3.4 μg/mL），而單體松油烯和芳樟醇并沒有表現(xiàn)出抗氧化活性。也有報(bào)道稱-松油醇對(duì)于ABTS 自由基也具有可觀的清除效果。總體而言，百里香精油對(duì)ABTS 自由基的清除活性主要來自其酚類物質(zhì)。

圖3 百里香精油對(duì)ABTS 自由基的清除能力Fig.3 Scavenging activity of Thymus vulgaris L.essential oil on ABTS free radicals

2.3.3 百里香精油總抗氧化能力 金屬離子的存在會(huì)加速活性氧化物的形成同時(shí)激發(fā)氧化反應(yīng)的產(chǎn)生。將金屬離子還原可以阻止這一反應(yīng)并提供氧化穩(wěn)定性。因此，本實(shí)驗(yàn)采用鐵離子還原法測(cè)定百里香精油的還原能力。由圖4 可知，在0.2～1.2 mg/mL濃度范圍內(nèi)，V和百里香精油的總抗氧化能力呈明顯的劑量依賴效應(yīng)，V的FRAP 值在2.795～5.593 mmol/L 之間，三種方法所得精油的總抗氧化能力沒有明顯的差異，其中，SDE 法的精油FRAP 值在0.275～1.053 mmol/L 范圍內(nèi)，相比SD 法（0.244～1.022 mmol/L）和CPAE 法（0.283～0.998 mmol/L）精油的FRAP 值略高?？偪寡趸芰樞?yàn)椋篠DE＞SD＞CPAE。百里香的高還原力與其百里香酚和香芹酚的含量有著密切關(guān)系，主要是由于芳香環(huán)上的羥基具有很強(qiáng)的供氫能力。

圖4 百里香精油總抗氧化能力Fig.4 Total antioxidant capacity of Thymus vulgaris L.essential oil

2.3.4 百里香精油的化學(xué)成分與抗氧化性相關(guān)性分析 精油的生物活性組分與其抗氧化性之間有著明顯的相關(guān)性。如表3 所示，DPPH 自由基清除能力與總酚呈顯著性正相關(guān)（＜0.05），與2-茨醇、百里香酚、香芹酚、-松油醇含量呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.838、0.818、0.820、0.843，可見這幾種成分是百里香精油中清除DPPH 自由基的關(guān)鍵物質(zhì)。ABTS 自由基清除能力與2-茨醇、-松油醇含量呈顯著正相關(guān)（＜0.05），與花青素含量呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.990，可知2-茨醇、-松油醇和花青素在清除ABTS 自由基時(shí)起到重要作用?？偪寡趸芰εc總酚含量呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.821。除此之外，可以看出百里香酚和香芹酚的含量呈現(xiàn)出極強(qiáng)的相關(guān)性，而且香芹酚含量高的精油，百里香酚含量也較高，這可能是因?yàn)樗鼈冎g具有生物合成關(guān)系，Thompson等的研究也得出了與本文類似的結(jié)果。經(jīng)過Pearson 相關(guān)性分析也進(jìn)一步證實(shí)，百里香精油的抗氧化活性與酚類物質(zhì)的含量密切相關(guān)。

表3 不同方法提取的百里香精油抗氧化性與主要化學(xué)成分的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficients between antioxidant activity and main chemical components of essential oil extracted by different methods

3 結(jié)論

本研究采用SD 法、SDE 法和較為新穎的CPAE法制得了三種百里香精油，從得率上看，CPAE 法比SD 法有了一定的提高，但SDE 法可以在同樣的時(shí)間里獲得最多的精油且有著顯著差異（＜0.05）。通過GC-MS 分析了三種百里香精油的揮發(fā)性成分，共鑒定出了36 種組分，組分和含量上三種精油有著一定差異，在主要活性成分上SDE 法和CPAE 法都展現(xiàn)出比SD 法更高的含量。對(duì)百里香精油進(jìn)行了總酚、總黃酮和花青素含量的測(cè)定，SDE 法的精油中三種活性物質(zhì)也呈現(xiàn)出較高的含量，這與三種精油的GC-MS 分析結(jié)果中酚類物質(zhì)的含量水平相一致。三種精油對(duì)于DPPH、ABTS 自由基都有很強(qiáng)的清除能力，也具有一定的總抗氧化能力?？傮w上來說，三種精油的抗氧化能力順序?yàn)镾DE＞CPAE＞SD。通過活性成分和抗氧化能力的相關(guān)性分析表明，百里香精油的自由基清除能力與酚類物質(zhì)的含量呈現(xiàn)很強(qiáng)的正相關(guān)性。綜合來看，SDE 法不論是在品質(zhì)和效率上都是制備百里香精油的最優(yōu)方法。百里香精油作為有前景的天然抗氧化劑，如何開發(fā)出更加安全、穩(wěn)定的遞送載體從而更廣泛、高效地應(yīng)用于食品和醫(yī)療事業(yè)將會(huì)是未來研究的重點(diǎn)。