基于培養(yǎng)基優(yōu)化提高過表達(dá)MET14 基因的重組庫德畢赤酵母M48 脫鎘能力的研究

徐婉瑩，戚曉雪，徐 瑩，汪東風(fēng)

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003）

鎘是一種有害重金屬，對植物、動物和人類的生物功能都有危害作用，國際癌癥研究中心將其列為人類致癌物（Ⅰ類）。鎘可以通過口服途徑（食物、水）、吸入或通過皮膚吸收進(jìn)入體內(nèi)，對骨骼、腎臟、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用。被重金屬污染的環(huán)境中，植物、水生生物等通過食物鏈富集作用使得食品中鎘超標(biāo)問題時有發(fā)生，因此需要開發(fā)一種安全高效的重金屬脫除技術(shù)來解決這一問題。脫鎘微生物因其來源廣泛、價格低廉、安全無污染以及在低濃度下的高效率等特點，在食品加工領(lǐng)域脫除重金屬的應(yīng)用中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。庫德畢赤酵母（）是發(fā)酵食品中常見的酵母菌，并且已被證實是益生菌酵母，在某些食品加工生產(chǎn)中有所應(yīng)用。本課題組前期研究從白酒酒醅中分離出一株具有多種重金屬離子抗性以及良好吸附能力的A16（CK），并發(fā)現(xiàn)鹽脅迫可明顯提高其鎘抗性。進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)錄組研究CK 鎘抗性提高機(jī)理發(fā)現(xiàn)，硫同化通路對于緩解酵母鎘毒性具有重要意義，于是特異性選擇硫代謝通路中差異表達(dá)量最高的腺苷酰硫酸激酶基因在CK 細(xì)胞中過表達(dá)，最終構(gòu)建并篩選出一株具有高鎘抗性及脫鎘率的重組M48（簡稱M48）。前期研究發(fā)現(xiàn)，逆境環(huán)境（高鹽、低pH、乙醇和高溫）中重組菌株M48 仍能較好生長且脫鎘能力有所提升，在復(fù)雜的食品體系中脫鎘具有較大優(yōu)勢。

微生物的生長受多種因素影響，其中培養(yǎng)基的組成至關(guān)重要。Blazejak 等研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁的厚度，尤其是它的外層，在一定程度上受培養(yǎng)基成分的控制，添加甘露糖的培養(yǎng)基中酵母的細(xì)胞壁厚度顯著增加，且可以提高酵母對鎂離子的吸附量及其生物量。黃章嬈等用單因素和響應(yīng)面試驗對富鋅酵母的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，最優(yōu)條件下其對鋅的吸附量及生物量均顯著提高。Fathollahi 等研究了培養(yǎng)基中葡萄糖、氨基酸、磷酸鹽、硝酸鹽、鈣和鎂對細(xì)菌生物膜鎘吸附效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)條件對生物膜的形成及其對鎘的脫除率有顯著影響。因此，為了提高重組菌株M48 的脫鎘率和生物量，充分挖掘其在實際生產(chǎn)應(yīng)用中的價值，對其進(jìn)行培養(yǎng)基成分優(yōu)化是非常有必要的。

本研究以重組菌株M48 的脫鎘率和生物量為指標(biāo)，通過單因素實驗、部分析因設(shè)計以及中心組合設(shè)計對培養(yǎng)基碳源、氮源、無機(jī)鹽以及含硫物質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而確定重組菌株M48 的最佳培養(yǎng)基成分，并進(jìn)行了驗證。本研究結(jié)果為建立微生物脫鎘技術(shù)提供了一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原始菌株A16 保藏于中國海洋大學(xué)食品化學(xué)與營養(yǎng)研究室；過表達(dá)基因的重組菌株M48 由本實驗室構(gòu)建并保存；氯化鈉、氯化鎘（CdCl·2.5HO）、無水乙醇、無水葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸、尿素、硫酸銨、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈣、氯化銅、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、半胱氨酸、硫酸鈉、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨 分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母浸粉 分析純，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；瓊脂粉、谷胱甘肽、潮霉素B 分析純，上海索萊寶生物科技有限公司；果糖、低聚果糖、阿拉伯糖、木糖 食品級，河南萬邦化工科技有限公司；甲硫氨酸 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；YPD 培養(yǎng)基 酵母浸粉10 g/L，無水葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，121 ℃滅菌20 min后備用（若配制固體培養(yǎng)基，則需再添加瓊脂20 g/L）。

AA-6800 型島津原子吸收分光光度計 島津國際貿(mào)易（上海）有限公司；ZQTY-70V 型振蕩培養(yǎng)箱上海知楚儀器有限公司；LD5-10B 型低速離心機(jī)北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；Sartorius 普及型pH 計 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化 將-80 ℃甘油保藏的重組菌株M48劃線于YPD 固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h 后接種到新的YPD 固體斜面培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h。刮取適量菌體接種于YPD 液體培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h，即完成菌株的活化并獲得一定量的種子液。

1.2.2 重組菌株M48 的質(zhì)粒穩(wěn)定性分析

1.2.2.1 無選擇壓力傳代 在普通YPD 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)傳代。將1.2.1 步驟中得到的M48 種子液記為0 代。按2%的接種量吸取0 代菌液于新的YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h，此為1 代。以此類推傳至30 代。其中，分別對第5、10、15、20、25、30 代的菌液進(jìn)行梯度稀釋至10倍，涂布于YPD 平板中，28 ℃過夜培養(yǎng)至單菌落長出。分別隨機(jī)挑取100 個單菌落于普通YPD 平板和含500 μg/mL 潮霉素B 的YPD 平板中，28 ℃過夜培養(yǎng)，統(tǒng)計可生長的菌落點。

1.2.2.2 有選擇壓力傳代 使M48 在含500 μg/mL潮霉素B 的YPD 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)傳代，其余操作方法同1.2.2.1。質(zhì)粒穩(wěn)定性（%）的計算公式如下：

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 碳源對重組菌株M48 脫鎘率和生物量的影響 將YPD 液體培養(yǎng)基中碳源（葡萄糖）分別用等濃度（20 g/L）的果糖、阿拉伯糖、低聚果糖及木糖替換，各吸取1 mL M48 種子液于不同碳源的50 mL液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h，測定不同碳源條件下培養(yǎng)的M48 的脫鎘率和生物量并計算綜合值。以YPD 液體培養(yǎng)基為對照。

1.2.3.2 氮源對重組菌株M48 脫鎘率和生物量的影響 液體培養(yǎng)基以20 g/L 葡萄糖為碳源，分別添加20 g/L 的蛋白胨、酵母浸粉、尿素、硫酸銨及硝酸銨作為氮源，各吸取1 mL M48 種子液于不同氮源的50 mL 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h，測定不同氮源條件下培養(yǎng)的M48 的脫鎘率和生物量并計算綜合值。以YPD 液體培養(yǎng)基為對照。

1.2.3.3 無機(jī)鹽對重組菌株M48 脫鎘率和生物量的影響 液體培養(yǎng)基以20 g/L 葡萄糖為碳源、20 g/L酵母浸粉為氮源，分別添加2 g/L 的磷酸二氫鉀、氯化鈣、氯化銅、硫酸鎂、硫酸亞鐵及硫酸錳作為無機(jī)鹽，添加量參考陳文明等研究。各吸取1 mL M48種子液于不同無機(jī)鹽的50 mL 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h，測定不同無機(jī)鹽培養(yǎng)的M48 的脫鎘率和生物量并計算綜合值。以不加無機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基為對照。

1.2.3.4 含硫物質(zhì)對重組菌株M48 脫鎘率和生物量的影響 液體培養(yǎng)基以20 g/L 葡萄糖為碳源、20 g/L酵母浸粉為氮源，分別添加2 g/L 的半胱氨酸（Cys）、甲硫氨酸（Met）、硫酸鈉、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉及谷胱甘肽（GSH）作為含硫物質(zhì)，添加量參考張丹丹研究。各吸取1 mL M48 種子液于不同含硫物質(zhì)的50 mL 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h，測定不同無機(jī)鹽培養(yǎng)的M48 的脫鎘率和生物量并計算綜合值。以不加含硫物質(zhì)的液體培養(yǎng)基為對照。

1.2.4 部分析因設(shè)計 以單因素實驗結(jié)果為依據(jù)，選定葡萄糖（A）、酵母浸粉（B）、磷酸二氫鉀（C）、硫酸鎂（D）、甲硫氨酸（E）五個因素進(jìn)行考察，以脫鎘率、生物量和綜合值為響應(yīng)指標(biāo)，利用Design Expert 13 軟件進(jìn)行2部分析因設(shè)計，安排21 次試驗，其中包括5 次中心點試驗，因素水平和編碼值見表1。

表1 25-1 部分析因設(shè)計的因素水平表Table 1 Factors and levels of 25-1 fractional factorial design

1.2.5 中心組合設(shè)計優(yōu)化M48 培養(yǎng)基成分 Central Composite Design（CCD）中心組合設(shè)計利用Design Expert 13 軟件進(jìn)行，葡萄糖（A）、酵母浸粉（B）和磷酸二氫鉀（C）作為自變量，脫鎘率、生物量及綜合值為響應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行三因素五水平的響應(yīng)面試驗，因素水平和編碼值見表2。

表2 CCD 試驗設(shè)計的因素水平表Table 2 Factors and levels of CCD experimental design

1.2.6 生物量測定 生物量的測定方法采用干重法：取不同條件下培養(yǎng)完的菌液8 mL 于已烘干至恒重的10 mL 離心管，5000 r/min 離心10 min，棄去上清，沉淀用純水洗滌兩次后，80 ℃烘干至恒重，稱重后計算生物量M（g/L），計算公式如下：

式中：M 為酵母菌的生物量，g/L；M為已烘干至恒重的空的10 mL 離心管質(zhì)量，g；M為已烘干至恒重的菌泥和10 mL 離心管的總重，g；V 為菌液體積，mL。

1.2.7 脫鎘率測定 對于經(jīng)不同條件培養(yǎng)24 h 的50 mL 培養(yǎng)液，用血球計數(shù)板計算酵母菌的濃度。取含8×10個酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液于10 mL 離心管中，5000 r/min 離心10 min，純水洗滌兩次后獲得菌泥，加入10 mL 質(zhì)量濃度為10 mg/L 的鎘離子水溶液，28 ℃、180 r/min 振蕩吸附2 h，離心并取上清液，用火焰原子吸收光譜法測定溶液中鎘離子濃度并計算脫鎘率，通過相同細(xì)胞個數(shù)的酵母菌脫鎘率來反應(yīng)酵母菌的脫鎘能力。脫鎘率R（%）的計算公式如下：

式中：R 為酵母菌的脫鎘率，%；C為鎘離子溶液的初始鎘濃度，mg/L；C為吸附后鎘離子溶液的鎘濃度，mg/L。

1.2.8 綜合值計算方法 在此規(guī)定綜合值的計算公式為：

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3 次，實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Design Expert 13 進(jìn)行實驗設(shè)計與結(jié)果統(tǒng)計分析；采用SPSS 25 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差分析（ANOVA），用多重比較Tukey 檢測對各組實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性檢驗。＜0.05 說明不同處理間有顯著差異。利用Origin 2018 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌株M48 的質(zhì)粒穩(wěn)定性分析

無選擇壓力培養(yǎng)時，若重組菌株的質(zhì)粒穩(wěn)定性較差，隨傳代次數(shù)的不斷增加，質(zhì)粒丟失的菌株將會占據(jù)優(yōu)勢甚至全部替代帶有質(zhì)粒的重組菌。而在選擇壓力下，即向培養(yǎng)基中添加適量的抗生素后，只有含有相應(yīng)抗生素抗性的質(zhì)粒重組菌才能正常生長。因此，有必要分別在無選擇壓力的普通YPD 液體培養(yǎng)基和有選擇壓力的含抗生素YPD 液體培養(yǎng)基中對重組菌株M48 的質(zhì)粒穩(wěn)定性進(jìn)行研究。表3結(jié)果顯示，無選擇壓力和有選擇壓力條件下，重組菌株M48 在第5、10、15、20、25、30 代的質(zhì)粒穩(wěn)定性均為100%，說明重組菌株M48 具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

表3 重組菌株M48 的質(zhì)粒穩(wěn)定性結(jié)果（%）Table 3 Plasmid stability of recombinant strain M48 (%)

2.2 不同培養(yǎng)基成分對重組菌株M48 脫鎘能力及生長情況的影響

2.2.1 碳源 酵母菌可以利用糖類物質(zhì)作為碳源和能源供其生命所需，不同菌種的生長對碳源的需求也各不相同。不同碳源對重組菌株M48 脫鎘能力和生長情況的影響如圖1。由圖1a 可知，碳源種類對M48 的脫鎘率和生物量有較大影響，其中碳源為低聚果糖、木糖或阿拉伯糖時M48 的脫鎘率較高，但生物量都很低，顯著低于葡萄糖或果糖（＜0.05）。而由圖1b 可知，碳源為果糖時的綜合值最低。一方面從成本角度考慮，葡萄糖比木糖、阿拉伯糖價格低廉；另一方面從時間角度考慮，相同培養(yǎng)時間下（24 h），碳源為木糖或阿拉伯糖的生物量較低，可能是由于在24 h 時M48 還未到對數(shù)生長期，生長緩慢，雖然此時M48 的脫鎘率較高但不能選擇其作為碳源，而葡萄糖是一種速效碳源，能夠在菌體生長初期快速提供能量使其快速生長，因此，選擇葡萄糖為最佳碳源進(jìn)行下一步研究。

圖1 不同碳源對重組菌株M48 脫鎘率和生物量以及綜合值的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on cadmium removal rate,biomass and comprehensive value of recombinant strain M48

2.2.2 氮源 探究不同氮源種類對重組菌株M48 脫鎘能力和生長情況的影響。Guo 等研究表明，降低氮源濃度有利于酵母細(xì)胞對銅的吸收，因此本研究中氮源添加量統(tǒng)一為20 g/L。結(jié)果如圖2，不同的有機(jī)氮源和無機(jī)氮源對M48 脫鎘率和生物量有顯著影響（0.05）：尿素、硝酸鈉或硫酸銨作為氮源時M48 不能正常生長，這與Li 等研究結(jié)果一致，且當(dāng)?shù)礊榱蛩徜@時M48 培養(yǎng)24 h 后50 mL 培養(yǎng)液中細(xì)胞數(shù)不足8×10個，生物量太少，因此未進(jìn)行脫鎘試驗；酵母浸粉作為唯一氮源時，可以保持M48 與對照組同樣高的生物量，且能顯著提高其脫鎘率（＜0.05），圖2b中也可以直觀看出此時M48 綜合值最大。這是由于酵母浸粉營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、多種氨基酸、B 族維生素、生長因子以及微量元素等，能夠促進(jìn)菌體生長，是酵母菌的優(yōu)質(zhì)氮源。200655 以酵母浸粉為氮源時其生物量也最大，因此選擇酵母浸粉作為氮源進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 不同氮源對重組菌株M48 脫鎘率和生物量以及綜合值的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on cadmium removal rate,biomass and comprehensive value of recombinant strain M48

2.2.3 無機(jī)鹽 無機(jī)鹽是微生物生長繁殖的重要營養(yǎng)物質(zhì)，為細(xì)胞的生命活動提供必不可少的微量元素。液體培養(yǎng)基在最佳碳源和最佳氮源基礎(chǔ)上通過添加磷酸二氫鉀、氯化鈣、氯化銅、硫酸鎂、硫酸亞鐵及硫酸錳來研究不同無機(jī)鹽對M48 脫鎘率及生物量的影響。由圖3a 可知，當(dāng)無機(jī)鹽為硫酸鎂時，M48 的脫鎘率最高，其次為磷酸二氫鉀，均顯著高于空白組（＜0.05）；磷酸二氫鉀、硫酸鎂或氯化鈣作為無機(jī)鹽時可使M48 保持與空白組相當(dāng)?shù)纳锪?。從圖3b 綜合值結(jié)果看，硫酸鎂作為無機(jī)鹽時，M48 的綜合值最大，磷酸二氫鉀次之，綜合選擇硫酸鎂和磷酸二氫鉀作為最佳無機(jī)鹽進(jìn)行下一步研究。

圖3 不同無機(jī)鹽對重組菌株M48 脫鎘率和生物量以及綜合值的影響Fig.3 Effects of different inorganic salts on cadmium removal rate,biomass and comprehensive value of recombinant strain M48

無機(jī)鹽不僅能夠?qū)Νh(huán)境滲透壓起到緩沖作用、維持細(xì)胞液的濃度，還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞膜點位、酶的激活等胞內(nèi)生理過程。推測硫酸鎂或磷酸二氫鉀的加入激活了M48 胞內(nèi)的相關(guān)酶，有利于對脫鎘有利的前體物如GSH 等的合成，進(jìn)而提高其脫鎘能力。但無機(jī)鹽對脫鎘率因離子種類而異。此外，本研究中加入的無機(jī)鹽對M48 生物量沒有提升，說明其并不會促進(jìn)菌體的生長，而其他這與孫媛媛研究結(jié)果一致。

2.2.4 含硫物質(zhì) 不同含硫物質(zhì)對M48 的脫鎘率和生物量有很大影響，圖4 中，與空白組相比，Met 的加入可顯著提高M(jìn)48 的脫鎘率（＜0.05），生物量與空白組保持相當(dāng)水平，無顯著差異（＞0.05）。其他含硫物并不能提高M(jìn)48 的脫鎘能力與促進(jìn)其生長，同時生物量均低于對照組。添加Met 時M48 的綜合值顯著高于其他組（＜0.05），因此選擇Met 作為含硫物添加到培養(yǎng)基中進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 不同含硫物對重組菌株M48 脫鎘率和生物量以及綜合值的影響Fig.4 Effects of different sulfur substances on cadmium removal rate,biomass and comprehensive value of recombinant strain M48

Met 的添加能促進(jìn)胞內(nèi)Cys 及GSH 的合成，從而有利于GSH 與鎘的結(jié)合。且硫代腺苷甲硫氨酸（SAM）也是GSH 的一種合成前體，其作為一種重要的甲基供體在機(jī)體內(nèi)參與眾多反應(yīng)，對細(xì)胞生長代謝有著巨大影響。因此作為SAM 前體物質(zhì)的Met 添加至培養(yǎng)基中有利于M48 對鎘的吸附，提高其脫鎘率。另外，本研究中直接添加Cys、GSH 等其他含硫物質(zhì)并不能提高M(jìn)48 的脫鎘率，且生物量沒有比空白組增加且有所降低，提示這些含硫物質(zhì)對M48 的生長無用甚至有抑制作用，此結(jié)果與張丹丹研究結(jié)果一致。有文獻(xiàn)報道，外源GSH 對高鹽、低pH 脅迫等不利條件下的魯氏酵母、唾液乳桿菌的生長有保護(hù)作用，而對無鹽脅迫的魯氏酵母的生長無影響。另外還有研究發(fā)現(xiàn)，過量的GSH會誘發(fā)新的自由基反應(yīng)從而造成更嚴(yán)重的氧化損傷，對細(xì)胞生長不利。在本研究中，外源GSH 抑制M48 的生長和吸附鎘的能力。由此看來，外源GSH對菌株的生長和其他性能的影響與GSH 的濃度以及細(xì)胞所處條件等因素有關(guān)，比如原始菌株CK 中過表達(dá)基因后，干擾了對Cys 和GSH 的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和胞內(nèi)代謝途徑；外源加入還原性物質(zhì)Cys或GSH，使培養(yǎng)基氧化還原電位降低，從而影響M48的生長及脫鎘能力，具體原因還有待深入分析。

2.3 部分析因設(shè)計確定影響M48 脫鎘能力及生長情況的主要因素

部分析因設(shè)計常用于微生物的培養(yǎng)基優(yōu)化中。根據(jù)前期單因素實驗，研究葡萄糖、酵母浸粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂以及Met 五種培養(yǎng)基成分對M48 脫鎘能力及生長情況的影響，結(jié)果見表4。其中，在不同的培養(yǎng)基成分濃度組合下M48 的脫鎘率大致在44%～77%間變化，生物量大致在7～11 g/L 間變化。

表4 25-1 部分析因設(shè)計試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Design and results of 25-1 fractional factorial design

對綜合值結(jié)果進(jìn)行方差分析（表5），因素葡萄糖（A）、酵母浸粉（B）和磷酸二氫鉀（C）對重組菌株M48 的綜合值有顯著性的影響（＜0.05），該模型極顯著（＜0.0001），決定系數(shù)=0.9845，=0.9755，失擬項不顯著（＞0.05），模型可用于下一步分析。因此，確定葡萄糖（A）、酵母浸粉（B）和磷酸二氫鉀（C）三個因素作為影響重組菌株M48 脫鎘能力和生長情況的關(guān)鍵因子，并進(jìn)行下一步響應(yīng)面分析。

表5 25-1 部分因子設(shè)計綜合值結(jié)果分析Table 5 Result analysis of comprehensive value of 25-1 fractional factorial design

2.4 CCD 試驗優(yōu)化M48 培養(yǎng)基成分

根據(jù)2部分析因設(shè)計結(jié)果，CCD 試驗中三個關(guān)鍵因素的中心點分別為葡萄糖20 g/L，酵母浸粉20 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，試驗設(shè)計與結(jié)果見表6。采用Design Expert 13 軟件對結(jié)果進(jìn)行回歸分析，以綜合值（Y）代表影響重組菌株M48 脫鎘能力和生長情況的綜合評價響應(yīng)值，回歸方程為：

表6 CCD 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 CCD experimental design and results

多元回歸方差分析結(jié)果見表7，回歸模型的=129.36，＜0.0001，從而此模型高度顯著。失擬項不顯著（＞0.05），模型決定系數(shù)=0.9915，=0.9838，模型擬合程度較高，因此可以用此回歸方程確定重組菌株M48 脫鎘能力和生長情況的綜合值的最優(yōu)值。

由表7 方差分析結(jié)果知，一次項中A、B 以及二次項的AB、A、B及C對重組菌株M48 脫鎘能力和生長情況的綜合值的影響極顯著（＜0.01）。通過三因素的值可知，影響重組菌株M48 脫鎘能力和生長情況的綜合值的因素主要順序是B＞A＞C，即酵母浸粉＞葡萄糖＞磷酸二氫鉀，其中，葡萄糖和酵母浸粉是影響M48 綜合值的顯著因素。

表7 CCD 試驗綜合值結(jié)果方差分析Table 7 Variance analysis of comprehensive value results of CCD experimental

利用Design Expert 13 軟件繪制了三維響應(yīng)面及其等高線，葡萄糖、酵母浸粉及磷酸二氫鉀三因素的兩兩相互作用對M48 綜合值的影響結(jié)果如圖5。圖5a 中，隨酵母浸粉添加量不斷增大，M48 的綜合值先增大后減少。圖5b 中，葡萄糖和磷酸二氫鉀交互作用不明顯。圖5c 中，固定酵母浸粉添加量時，磷酸二氫鉀曲線較為平緩，酵母浸粉和磷酸二氫鉀交互作用不明顯。

圖5 各因素對重組菌株M48 脫鎘能力和生長情況的綜合值的三維響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.5 Three dimensional response surface diagram and contour diagram of comprehensive values of various factors on cadmium removal capacity and growth of recombinant strain M48

通過Design Expert 13 軟件對試驗進(jìn)行擬合，得到重組菌株M48 脫鎘能力和生長情況綜合值的最優(yōu)值對應(yīng)的培養(yǎng)基成分為：葡萄糖23.42 g/L，酵母浸粉27.72 g/L，磷酸二氫鉀2.04 g/L，此條件下M48的綜合值最大，預(yù)測綜合值為45.19。

2.5 驗證試驗

為驗證擬合模型的可靠性，以培養(yǎng)基成分最優(yōu)條件：葡萄糖23.42 g/L，酵母浸粉27.72 g/L，磷酸二氫鉀2.04 g/L 對重組菌株M48 進(jìn)行培養(yǎng)。在最優(yōu)培養(yǎng)基成分條件下進(jìn)行三次驗證實驗，得到重組菌株M48 脫鎘率為79.63%，生物量為9.95 g/L，綜合值為44.79，與預(yù)測值45.19 非常接近，說明此模型可以很好的預(yù)測重組菌株M48 脫鎘能力和生長情況的綜合值。

3 結(jié)論

本研究以實驗室構(gòu)建的一株對脅迫環(huán)境有較好耐受性以及高鎘抗性的基因重組M48 為對象，以脫鎘率和生物量的綜合值為指標(biāo)，通過單因素、部分析因設(shè)計和中心組合設(shè)計對其培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，最終得到最佳條件為：葡萄糖23.42 g/L，酵母浸粉27.72 g/L，磷酸二氫鉀2.04 g/L，此條件下培養(yǎng)得到的M48 脫鎘率為79.63%，是未優(yōu)化前（29.49%）的2.70 倍，生物量為9.95 g/L，是未優(yōu)化前（8.57 g/L）的1.16 倍，從而為其后續(xù)在鎘脫除領(lǐng)域工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中提供研究基礎(chǔ)。