基于非靶向代謝組學(xué)的藍(lán)莓酵素和沙棘酵素代謝產(chǎn)物特征比較

姚沛琳，劉夢茹，楊 澳，蔣家璇，姚 坤,

（1.宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州 234000；2.宿州市天然產(chǎn)物與功能性食品工程技術(shù)研究中心，安徽宿州 234000）

水果酵素是以新鮮水果為原料，加入糖類物質(zhì)，在不控溫的條件下，經(jīng)多種有益微生物通過較長時間發(fā)酵而得到的功能性微生物產(chǎn)品。水果酵素中含有多種有益營養(yǎng)物質(zhì)，包括黃酮醇、類黃酮、花青素等多酚類物質(zhì)，蘋果酸、檸檬酸、乳酸等有機(jī)酸物質(zhì)，多種活性酶類以及氨基酸等。這些營養(yǎng)成分和生物活性成分的存在賦予了酵素多種生理功能，如抗氧化作用、抑菌作用、保護(hù)心血管作用、緩解肥胖等。隨著人們對功能性食品的需求與日俱增，酵素產(chǎn)品逐漸受到消費(fèi)者和學(xué)者的廣泛關(guān)注。

代謝組學(xué)是指對一個生物體系在特定的時間和條件下所有小分子代謝物質(zhì)的定性定量分析，從而描述生物內(nèi)源性代謝物的整體及其對內(nèi)、外因素變化應(yīng)答規(guī)律。非靶向代謝組學(xué)可以無偏向性地對所有小分子代謝物同時進(jìn)行檢測分析，篩選出靶標(biāo)的代謝物。目前代謝組學(xué)已被運(yùn)用到食品研究中。胡明珍等利用非靶向代謝組學(xué)分析了副干酪乳酸桿菌發(fā)酵枸杞汁各階段的代謝差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的發(fā)酵階段對枸杞發(fā)酵液中氨基酸類物質(zhì)的代謝影響最大。唐富豪等利用非靶向代謝組學(xué)首次較系統(tǒng)評價了芥菜及其乳酸菌發(fā)酵芥菜的酚類物質(zhì)組成和差異。

目前對酵素的研究主要集中在抗氧化方面，如金哲寧等對沙棘酵素功能成分及其體外抗氧化性能進(jìn)行了研究，王高堅等對藍(lán)莓酵素發(fā)酵過程中的抗氧化活性進(jìn)行了研究。姚笛等對火龍果、藍(lán)莓、桑葚三種酵素的抗氧化活性與微生物多樣性的相關(guān)性進(jìn)行了研究。酵素的功能成分復(fù)雜，影響抗氧化活性的因素眾多，而且難以運(yùn)用某一特定的方法把所有的功能物質(zhì)全部檢測出來，因此為酵素的功能性成分及其作用的研究造成了較大困難。代謝組學(xué)可以宏觀的檢測出樣品間的主要差異物質(zhì)，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)分析不同酵素產(chǎn)品間的差異代謝物的研究未見報道。

本研究以新鮮的藍(lán)莓和沙棘為原料，采用自然發(fā)酵的方法制得藍(lán)莓酵素和沙棘酵素，使用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜測定藍(lán)莓和沙棘酵素中全部代謝物質(zhì)的豐度，結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法篩選差異代謝物，分析相關(guān)的代謝通路，找出藍(lán)莓和沙棘酵素之間的主要代謝差異，為水果酵素中特征性功能性成分的研究提供有效地研究策略。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮藍(lán)莓和新鮮沙棘 均購買于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場；單晶冰糖 購買于安徽福香源生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司；甲醇（色譜級）、乙腈（質(zhì)譜級）、2-氯苯丙氨酸（純度98.5%）、甲酸（質(zhì)譜級）、甲酸銨（純度99.9%）國藥集團(tuán)；去離子水 通過Millipore 系統(tǒng)制得。

H1850-R 冷凍離心機(jī) 湖南湘儀公司；QL-866混勻儀 德國Vortex Mixer 公司；5305 真空濃縮儀 德國Eppendorf 公司；UltiMate 3000 液相色譜儀、Q Exactive 質(zhì)譜儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵素的制備 用無菌水在無菌條件下分別輕輕沖洗藍(lán)莓和沙棘，除去表面沙子和灰塵，在無菌操作臺中自然晾干。冰糖用紫外殺菌，酵素罐（2 L）用高壓蒸汽滅菌。將發(fā)酵水果原料與冰糖按質(zhì)量比1:1，分別加入已滅菌的酵素罐中，一層原料一層冰糖，食材壓實，排盡空氣，裝至酵素罐2/3 處，封口，放置暗處發(fā)酵一年。取每種水果發(fā)酵樣品各6 個平行，收集密封后于液氮中保存。

1.2.2 樣品制備及處理 在4 ℃下將所有樣本融化30 min，從每個樣本中各取100 μL 于2 mL 離心管中，向每個離心管加入400 μL 甲醇并振蕩60 s，使其充分混勻；在12000 r/min 4 ℃下離心10 min，將全部上清液轉(zhuǎn)移至新的2 mL 離心管中，真空濃縮干燥；用150 μL 2-氯苯丙氨酸（4 mg/L）80%甲醇溶液復(fù)溶，使用0.22 μm 膜過濾上清液，得到待測樣本，進(jìn)行LC-MS 檢測。每個樣品均有6 個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 儀器檢測條件 超高效液相色譜條件：采用Thermo Ultimate 3000 儀器進(jìn)行色譜分離，使用ACQUITY UPLCHSS T3 1.8 μm（2.1 mm×150 mm）色譜柱，將自動進(jìn)樣器溫度設(shè)為8 ℃，流速為0.25 mL/min，色譜柱溫度維持在40 ℃，進(jìn)樣2 μL 進(jìn)行梯度洗脫，流動相為正離子0.1%甲酸水（C）-0.1%甲酸乙腈（D）；負(fù)離子5 mmol/L 甲酸銨水（A）-乙腈（B）。梯度洗脫程序為0～1 min，2%流動相B/D；1～9 min，2%～50% 流動相B/D；9～12 min，50%～98%流動相B/D；12～13.5 min，98%流動相B/D；13.5～14 min，98%～2%B/D；14～20 min，2% D-正模式（14～17 min，2% B-負(fù)模式）。

飛行時間質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子噴霧電壓為3.50 kV，負(fù)離子噴霧電壓為2.50 kV，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb。毛細(xì)管溫度設(shè)置為325 ℃，以分辨率70000 進(jìn)行全掃描，掃描范圍為81～1000 u，利用HCD 對其進(jìn)行二級裂解，碰撞電壓為30 eV，同時利用動態(tài)排除除去沒不必要的MS/MS 信息。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Proteowizard 軟件（v3.0.8789）對數(shù)據(jù)進(jìn)行峰識別、過濾、對齊，對數(shù)據(jù)的峰面積進(jìn)行歸一化。對于多元變量分析，采用主成分分析方法（principal components analysis，PCA），對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制（QC）與質(zhì)量保證（QA）分析。使用和進(jìn)行主成分分析（PCA）和最小二乘法判別分析PLS-DA（Partial Least Squares Discriminant Analysis），根據(jù)學(xué)生式t 檢驗的值＜0.05，同時PLS-DA 模型主成分的VIP 值＞1，進(jìn)行差異性代謝物的篩選。采用基于KEGG 數(shù)據(jù)庫中的MetPA 數(shù)據(jù)庫分析差異代謝物的相關(guān)代謝通路。對差異顯著的代謝通路進(jìn)行注釋并分析各差異代謝路徑之間的總關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種酵素樣品的代謝物主成分分析（PCA）

圖1 是藍(lán)莓酵素和沙棘酵素這兩種樣品的主成分分析圖。第一主成分（PC1）的貢獻(xiàn)率是48.9%，第二主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率是8.4%，兩者總貢獻(xiàn)率是57.3%，從整體上能夠反映出兩種樣品之間的代謝差異。從第一主成分方向看，藍(lán)莓酵素在第一主成分負(fù)軸上，沙棘酵素在第一主成分正軸上，從第二主成分方向看，藍(lán)莓酵素除了一個偏離較大的樣本外，其他樣本基本在中心線附近，沙棘酵素樣本也分布在中心線附近，兩種樣品在PC1 表現(xiàn)出組間差異，在PC2表現(xiàn)出組內(nèi)聚集，說明兩種酵素樣品的代謝物差異主要體現(xiàn)在第一主成分上。

圖1 藍(lán)莓酵素（A）和沙棘酵素（B）的PCA 得分圖Fig.1 PCA score chart for blueberry jiaosu (A) and seabuckthorn jiaosu (B)

2.2 兩種酵素樣品的PLS-DA 分析

PLS-DA 是偏最小二乘法-判別分析，是一種監(jiān)督模型。PLS-DA 可以忽略組內(nèi)誤差，消除與研究目的無關(guān)的隨機(jī)誤差，因此本文進(jìn)一步采用PLS-DA方法對構(gòu)建的模型進(jìn)行驗證。兩種酵素樣品的PLSDA 得分圖如圖2（a）所示，藍(lán)莓酵素樣品主要分布在置信區(qū)間左側(cè)，沙棘酵素樣品主要分布在置信區(qū)間右側(cè)，說明該模型能夠?qū)煞N酵素樣品進(jìn)行有效區(qū)分。此外，模型的交叉驗證參數(shù)X=0.555，Y=1，=0.987，這三個模型參數(shù)均大于0.5，說明模型的可解釋度和可預(yù)測性良好，因此本研究建立的PLSDA 模型能夠有效解釋兩種酵素之間的代謝差異。

因為PLS-DA 在建模時對樣品進(jìn)行了指定和分組，所以能更大地區(qū)分組間差異，但這也導(dǎo)致數(shù)據(jù)的PLS-DA 模型存在過擬合的問題，因此采用隨機(jī)置換檢驗法對模型進(jìn)行外部交叉驗證，如圖2（b）所示，回歸線呈向上趨勢，圖中所有藍(lán)色的點從左到右均低于最右側(cè)的原始的藍(lán)色的點，說明置換檢驗過關(guān)，模型不存在過度擬合的現(xiàn)象，可用于探索兩種酵素樣品的代謝物差異。

圖2 兩種酵素樣品的PLS-DA 得分圖（a）和置換檢驗圖（b）Fig.2 PLS-DA score chart (a) and replacement test chart (b) for two jiaosu samples

2.3 差異代謝物組學(xué)分析

根據(jù)PLS-DA 模型分析結(jié)果，將t 檢驗的值小于0.05 的代謝物和樣本之間代謝物濃度的差異倍數(shù)FC 值大于1.5 或小于0.5 的代謝物作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，來篩選藍(lán)莓和沙棘酵素之間差異顯著的代謝物。兩種酵素樣品中共得到3728 個差異代謝物，上調(diào)的差異代謝物有1151 個，下調(diào)的差異代謝物的有2577 個，由此可知，酵素中的代謝物組成非常豐富，用傳統(tǒng)方法無法對酵素中的代謝物質(zhì)進(jìn)行全部研究而且無法對主要代謝物進(jìn)行篩選和鑒定。經(jīng)篩選處理后，共篩選出390 種主要差異代謝物，主要體現(xiàn)在有機(jī)酸類、氨基酸類以及黃酮類。

2.4 差異代謝物富集通路分析

由藍(lán)莓和沙棘兩種酵素的差異代謝物數(shù)量可知，酵素的發(fā)酵是一個非常復(fù)雜的過程，因此需要進(jìn)一步對其代謝通路進(jìn)一步分析。通過KEGG 數(shù)據(jù)庫的比對，共檢測出61 條代謝通路，將其結(jié)果繪制成氣泡圖，如圖3 所示，圖中每一個氣泡表示一個KEGG Pathway 通路。氣泡的大小和橫坐標(biāo)數(shù)值表示影響值，氣泡越大和橫坐標(biāo)數(shù)值越大表示此通路越重要。氣泡顏色和縱坐標(biāo)數(shù)值表示富集分析的值（取負(fù)對數(shù)，即-lg），顏色越深值越小，富集程度越顯著。由圖3 可知，黃酮和黃酮醇的生物合成處的氣泡最大，顏色最深，說明藍(lán)莓酵素和沙棘酵素之間差異最顯著的代謝物質(zhì)是黃酮類化合物。

圖3 代謝通路影響因子圖Fig.3 Metabolic pathway influence factor graph

根據(jù)差異代謝物在不同條件下，表達(dá)出的代謝物質(zhì)之間的變化，通過比較藍(lán)莓和沙棘酵素之間的KEGG 代謝途徑，主要有13 條代謝途徑，由圖4 所示。其中差異較為顯著的代謝路徑是：黃酮和黃酮醇生物合成、-丙氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、賴氨酸生物合成、泛酸和輔酶A 生物合成、苯丙氨酸代謝、檸檬酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）、酪氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、谷胱甘肽代謝。但是結(jié)合差異代謝物數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，-丙氨酸代謝、賴氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝、檸檬酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）、乙醛酸和二羧酸代謝路徑中并沒有差異代謝物質(zhì)的出現(xiàn)。因此對有差異代謝物出現(xiàn)的6 條代謝路徑進(jìn)行具體分析，如圖5 所示。將藍(lán)莓酵素和沙棘酵素進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在兩種酵素中某些物質(zhì)的含量差異較為顯著，把其數(shù)值的差異表示為差異倍數(shù)。

圖4 藍(lán)莓和沙棘酵素主要KEGG 代謝差異路徑Fig.4 Main KEGG metabolic difference pathway of blueberryjiaosu and sea-buckthorn jiaosu

圖5A 是黃酮和黃酮醇生物合成路徑，在該途徑中藍(lán)莓酵素與沙棘酵素相比，藍(lán)莓酵素中山奈素，山奈酚、木犀草素都表達(dá)為上調(diào)，差異倍數(shù)分別為2.2911、3.4576、4.974。沙棘酵素中3-O-甲基槲皮素表達(dá)為下調(diào)，差異倍數(shù)為0.04135。由此路徑可知，藍(lán)莓酵素中富含山奈素、山奈酚和木犀草素，三者都具有抗癌、抗菌、抗炎、免疫增強(qiáng)等作用。沙棘酵素中富含3-O-甲基槲皮素，這種物質(zhì)可抑制癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)凋亡。山奈酚經(jīng)酶的催化合成山奈素，在類黃酮3'-單加氧酶的作用下，山奈酚轉(zhuǎn)化為槲皮素，通過黃酮醇3-O-葡萄糖乙酰轉(zhuǎn)移酶，將槲皮素轉(zhuǎn)移成異槲皮苷，槲皮素通過酶催化反應(yīng)為3-O-甲基槲皮素，山奈酚在經(jīng)過類莫酮生物合成反應(yīng)生成芹菜素，由芹菜素通過黃酮類化合物3'-單氧酶合成為木犀草素。

圖5B 是精氨酸和脯氨酸代謝路徑，在該途徑中，1-吡咯啉-5-碳酸鈣通過吡咯啉-5-羧酸還原酶與脯氨酸相互轉(zhuǎn)化，脯氨酸通過脯氨酰4-羥化酶轉(zhuǎn)化為4-羥脯氨酸，再經(jīng)過酶的催化生成1-吡咯啉-3-羥基-5-羧酸鹽，4-羥基谷氨酸半醛和1-吡咯啉-3-羥基-5-羧酸鹽相互轉(zhuǎn)化，后者通過1-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶生成L-赤型-4-羥基谷氨酸。N4-乙?；?氨基丁醛通過乙醛脫氫酶（NAD）轉(zhuǎn)化為N4-乙酰氨基丁酸，在經(jīng)酶的催化生成4-氨基丁酸，最后經(jīng)酶多步催化生成精氨酸。

圖5C 是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝路徑，在該途徑中藍(lán)莓酵素與沙棘酵素相比，沙棘酵素中的L-天冬氨酸表達(dá)為下調(diào)，差異倍數(shù)為0.42899，結(jié)果說明，沙棘酵素中富含L-天冬氨酸，具有促進(jìn)肝機(jī)能的作用。這個途徑是圍繞檸檬酸循環(huán)進(jìn)行的，分為兩條路徑，一條路徑為L-天冬氨酸通過酶的催化氧化轉(zhuǎn)化為延胡索酸鹽和L-天冬酰胺；另一條為2-酮戊二酸經(jīng)過谷氨酸合成酶（NADH）催化生成L-谷氨酸鹽，然后通過谷氨酸脫羧酶轉(zhuǎn)化為4-氨基丁酸脂（GABA），經(jīng)4-氨基丁酸酯經(jīng)-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶作用，生成琥珀酸半醛，利用琥珀酸半醛脫氫酶生成琥珀酸，最后L-谷氨酸鹽通過1-苯丙胺-5-甲基苯丙胺脫氫酶轉(zhuǎn)化為L-1-吡咯啉-5-羧酸鹽。

圖5D 是泛酸和輔酶A 生物合成，在該路徑中藍(lán)莓酵素與沙棘酵素相比，沙棘酵素中L-纈氨酸表達(dá)為下調(diào)，差異倍數(shù)為0.31624，表明沙棘酵素中富含L-纈氨酸，可作為營養(yǎng)增補(bǔ)劑。L-纈氨酸經(jīng)過酶的多步催化生成R-泛酸。然后，尿嘧啶通過二氫嘧啶脫氫酶（DADP）與5,6-二氫尿嘧啶相互轉(zhuǎn)化，5,6-二氫尿嘧啶通過二氫嘧啶酶轉(zhuǎn)化為N-氨甲酰--丙氨酸，N-氨甲酰--丙氨酸通過-脲基丙酸酶轉(zhuǎn)化為-丙氨酸。

圖5E 是酪氨酸代謝路徑，在該路徑中酪氨酸通過天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶和組氨酸磷酸轉(zhuǎn)氨酶聯(lián)合作用，轉(zhuǎn)化成4-羥基-苯丙酮酸，再通過4-羥基苯甲酸酯二氧酶生成尿黑酸，經(jīng)多種酶催化生成延胡索酸鹽，由琥珀酸和延胡索酸鹽共同進(jìn)入檸檬酸循環(huán)。

圖5F 是谷胱甘肽代謝路徑，藍(lán)莓酵素與沙棘酵素相比，藍(lán)莓酵素中谷胱甘肽表達(dá)為上調(diào)，差異倍數(shù)為5.2098；沙棘酵素中抗壞血酸表達(dá)為下調(diào)，差異倍數(shù)為0.66454，表明藍(lán)莓酵素中富含谷胱甘肽，沙棘酵素中富含抗壞血酸，二者都具有抗氧化作用。谷胱甘肽在谷胱甘肽水解酶作用下，一條合成途徑為催化合成L-半胱氨酰甘氨酸，再由丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和氨肽酶的聯(lián)合作用下合成L-半胱氨酸，然后，由L-γ-谷氨酰半胱氨酸通過-谷氨酰環(huán)素轉(zhuǎn)移酶催化下生成L-半胱氨酸和通過谷胱甘肽合成酶生成谷胱甘肽，另一條合成途徑為催化合成L-γ-谷氨酸-L-氨基酸，通過-谷氨酰環(huán)素轉(zhuǎn)移酶作用生成5-羥脯氨酸，然后在5-氧丙烯酸酶（ATP-水解）催化下生成L-谷氨酸鹽。谷胱甘肽在色氨酸和酶的作用下生成谷胱甘肽亞精胺，由谷胱甘肽亞精胺在酶的催化下生成色氨硫酮，在色氨硫酮生成二硫色胺途中，抗壞血酸在L-焦化過氧化酶催化下生成脫氫抗壞血酸。

圖5 藍(lán)莓和沙棘酵素的主要差異代謝物途徑Fig.5 The main differences in metabolite pathways between blueberries and sea buckthorn enzymes

2.5 差異代謝物的分析

根據(jù)藍(lán)莓酵素和沙棘酵素的最為顯著的關(guān)鍵代謝通路，共篩選并鑒定出9 個關(guān)鍵代謝物，如表1 所示。芹菜素、山奈素、木犀草素、山奈酚、3-O-甲基槲皮素屬于黃酮類，山奈酚、山奈素、木犀草素這三種物質(zhì)在藍(lán)莓酵素中前三種物質(zhì)平均相對豐度均呈上升趨勢。沙棘酵素中3-O-甲基槲皮素平均相對豐度均呈上升趨勢。黃酮類物質(zhì)不僅具有抗氧化性，還具有抗菌抗病毒抗腫瘤等功效。L-天冬酰胺、谷胱甘肽、L-纈氨酸均屬于氨基酸類，其中L-天冬酰胺和L-纈氨酸在沙棘酵素中平均相對豐度均呈上升趨勢，二者對治療肝臟疾病有重要意義。藍(lán)莓酵素中富含谷胱甘肽，不僅可以作為體內(nèi)的自由基清除劑，還可以起到預(yù)防癌癥、動脈硬化和延緩衰老的作用。抗壞血酸屬于有機(jī)酸類，在沙棘酵素中平均相對豐度呈上升趨勢，可以起到增強(qiáng)免疫力、延長機(jī)體壽命等作用。

表1 藍(lán)莓酵素和沙棘酵素關(guān)鍵代謝差異物Table 1 Key metabolic differential substances between blueberries and sea buckthorn enzymes

3 結(jié)論

本研究基于非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，研究了藍(lán)莓酵素和沙棘酵素的差異代謝物質(zhì)，共鑒定分析出3728 個差異代謝物，但是通過對差異代謝物通路分析，篩選出6 條最為顯著的關(guān)鍵通路，其中包含9 個關(guān)鍵代謝物，即芹菜素、山奈素、山奈酚、木犀草素、3-O-甲基槲皮素、L-天冬酰胺、谷胱甘肽、L-纈氨酸、抗壞血酸，其中有5 種參與黃酮和黃酮醇生物合成，1 種參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，2 種參與谷胱甘肽代謝，1 種參與泛酸和輔酶A 生物合成。從中可以映射出在黃酮和黃酮醇生物合成中代謝差異物質(zhì)最多，其中藍(lán)莓酵素中富含山奈酚、山奈素和木犀草素、谷胱甘肽，沙棘酵素中富含3-O-甲基槲皮素、L-天冬酰胺、L-纈氨酸、抗壞血酸。從藍(lán)莓和沙棘酵素的差異代謝物數(shù)量可知，水果酵素中的成分非常復(fù)雜，在評價酵素功能成分時，無法利用傳統(tǒng)的分析方法對代謝物質(zhì)進(jìn)行鑒定，本研究首次利用非靶向代謝組學(xué)系統(tǒng)地分析了兩種常見水果酵素的代謝差異，找出了最關(guān)鍵的代謝差異物，為后續(xù)更精準(zhǔn)地評價酵素功能性提供了一定的理論參考。