基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討桑枝改善高尿酸血癥的作用機(jī)制

阮仕洋，陳 慧，曾凡麗，廖尚高,2,3，羅喜榮,

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院/省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心/貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550004）

高尿酸血癥（Hyperuricemia，HUA）作為一種常見的代謝性疾病，主要是由于嘌呤在代謝過程中發(fā)生異常所致，體外嘌呤攝入過多、內(nèi)源性嘌呤生產(chǎn)過剩以及嘌呤排泄不及時(shí)等都是誘發(fā)高尿酸血癥的關(guān)鍵因素。根據(jù)發(fā)病過程中機(jī)制的差異性，可將其劃分為原發(fā)性HUA 和繼發(fā)性HUA 兩大類型，由基因突變引起的多為原發(fā)性HUA，為遺傳性類；由藥物使用或腎臟等疾病誘導(dǎo)的多為繼發(fā)性HUA。許多研究證明血清尿酸（UA）的升高已成為與疾病密切相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，如痛風(fēng)、糖尿病、心血管方面疾病、高血壓和腎臟方面慢性疾病等。臨床上，降低血清尿酸常作為防治HUA 的措施，目前常用抑制尿酸生成藥、改善尿酸排泄藥、尿酸酶合成劑和堿化尿液藥等4 類藥物治療HUA，但治療過程中副作用較為明顯，臨床應(yīng)用受到了限制。近年來傳統(tǒng)中藥成為研究熱點(diǎn)，主要由于其在療效突出的同時(shí)，兼具安全性高及多靶點(diǎn)治療的特性，所以在調(diào)節(jié)尿酸水平及發(fā)揮抗炎作用方面的優(yōu)勢是西醫(yī)無法替代的。

桑枝（L.）又名桑條，通常為桑樹干燥嫩枝的統(tǒng)稱，其藥性平和，味略苦澀，歸于肝經(jīng)，具有祛除風(fēng)濕、改善關(guān)節(jié)等功效，常用于治療關(guān)節(jié)炎及風(fēng)濕病等。據(jù)2022 年發(fā)布的藥食同源最新目錄，桑枝被收錄于可用于保健食品的物品名單中，表明桑枝可作為保健食品的原料，具有較大的開發(fā)及應(yīng)用前景。此外，桑枝治療痛風(fēng)痹證歷史悠久，《蒼生司命》中已有記載；陳寶剛等及高忠恩等在整理及論述總結(jié)傳統(tǒng)醫(yī)籍治療名方時(shí)，該功效也被論證。此外，研究表明，桑枝提取物能有效控制黃嘌呤氧化酶（XOD）的活性，從而降低HUA 模型小鼠的血清尿酸水平。近年來中藥研究領(lǐng)域，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被廣泛應(yīng)用，作為建立在系統(tǒng)生物學(xué)理論基礎(chǔ)上的一門新技術(shù)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要闡述藥物相互作用機(jī)制，特性主要包括“整體性”與“系統(tǒng)性”，通過從整體角度揭示藥物的作用機(jī)制，與中藥治療具有一致性，同時(shí)中醫(yī)的整體觀念也是如此，兩者之間不謀而合。結(jié)合現(xiàn)有研究報(bào)道及實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)，可知桑枝具有抗HUA 作用，但發(fā)揮防治作用的藥效物質(zhì)及作用方式缺少整體認(rèn)識(shí)。因此，本實(shí)驗(yàn)采取網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一新技術(shù)來探討桑枝治療HUA 的藥效組分及作用靶點(diǎn)，以期為桑枝后續(xù)開發(fā)及臨床研究給予方向及思路。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 桑枝組分及靶點(diǎn)建立

以“桑枝”、“Sangzhi”、“mulberry twig”為檢索詞，于TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php/）、Batman-TCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）、PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）、CNKI（https://www.cnki.net/）等數(shù)據(jù)庫平臺(tái)進(jìn)行檢索，獲取桑枝組分群，TCMSP 平臺(tái)中口服生物利用度（Oral bioavailability）和類藥性（Drug-like）及SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫中的Pharmacokinetics 和Druglikeness 等中藥體內(nèi)ADME 相關(guān)指標(biāo)參考程歡歡等進(jìn)行，借助Swiss-TargetPrediction 及PharmMapper（http://www.lilabecust.cn/pharmmapper/）在線平臺(tái)檢索組分靶點(diǎn)，去除重復(fù)值，建立桑枝組分靶點(diǎn)庫。

1.2 HUA 靶點(diǎn)獲取

于 GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMIM（https://omim.org/）平臺(tái)，以“Hyperuricemia”、“Gout”等為檢索關(guān)鍵詞，獲取HUA 靶點(diǎn)；借助UniProt（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫，設(shè)定物種類型為“Homo sapiens”，得到靶點(diǎn)名稱并去重，建立疾病靶點(diǎn)庫。

1.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)獲取

分別將“1.1”和“1.2”項(xiàng)下的靶點(diǎn)輸入在線平臺(tái)（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）制作靶點(diǎn)韋恩圖，獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）建立

參照王佰靈等將“1.3”項(xiàng)下靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING（https://string-db.org/）在線平臺(tái)分析，并將結(jié)果導(dǎo)入到Cytoscape 3.8.2 平臺(tái)展開網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)過程分析，篩選桑枝核心靶點(diǎn)。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)富集分析

將關(guān)鍵靶點(diǎn)借助DAVID（https://david.abcc.ncifcrf.gov/）平臺(tái)進(jìn)行GO 功能注釋及KEGG 富集分析（0.01），限定物種類型為“Homo sapiens”，并將結(jié)果可視化。

1.6 “化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖建立

利用Cytoscape 軟件平臺(tái)獲取“化合物-靶點(diǎn)-通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，圖中節(jié)點(diǎn)代表化合物、靶點(diǎn)、通路，邊表示彼此之間的交互關(guān)系。

1.7 核心靶點(diǎn)晶體結(jié)構(gòu)獲取及處理

于PDB（https://www1.rcsb.org/）平臺(tái)獲取核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的晶體結(jié)構(gòu)，借助Discovery Studio 3.5 平臺(tái)去除受體原配體和水分子、添加氫原子、檢測扭轉(zhuǎn)中心和扭轉(zhuǎn)鍵等，并尋找活性口袋。

1.8 分子對(duì)接

采用AutoDock Vina 1.1.2 軟件平臺(tái)將核心靶點(diǎn)分別與活性組分及對(duì)照藥（非布司他）進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，對(duì)網(wǎng)絡(luò)分析可靠性加以評(píng)價(jià)，并將結(jié)果可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑枝組分及靶點(diǎn)

從數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)挖掘共檢索到桑枝化合物156 個(gè)，首先依次將156 個(gè)化合物按“1.1”項(xiàng)進(jìn)行ADME篩選，其次采取SwissTargetPrediction 及PharmMapper 在線平臺(tái)對(duì)符合ADME 篩選條件的化合物進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，其中PharmMapper 平臺(tái)以Normalized Fit Score≥0.7 為遴選條件，SwissTarget-Prediction 平臺(tái)以Probability≥0 為遴選條件，然后將每個(gè)化合物分別在兩個(gè)平臺(tái)中預(yù)測所得的靶點(diǎn)進(jìn)行匯總并去重，得到每個(gè)化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，通過UniProt 在線平臺(tái)核對(duì)校正。最終共獲得符合條件的潛在活性組分45 個(gè)以及匯總?cè)ブ匕悬c(diǎn)共620 個(gè)，組分詳情見表1。

表1 桑枝潛在活性組分Table 1 Potential active components of mulberry twig

2.2 HUA 及共同靶點(diǎn)

以“Hyperuricemia”、“Gout”等為檢索關(guān)鍵詞，從Genecards 和OMIM 在線平臺(tái)獲取疾病作用靶點(diǎn)，共1277 個(gè)。將“2.1”項(xiàng)下的成分靶點(diǎn)與HUA 相關(guān)的1277 個(gè)靶點(diǎn)取交集，獲取共同靶點(diǎn)，共128 個(gè)，結(jié)果見圖1。

圖1 HUA 靶點(diǎn)與活性組分靶點(diǎn)交集韋恩圖Fig.1 Venn diagram of the intersection of HUA target and active component target

2.3 蛋白互作網(wǎng)路（PPI）結(jié)果

將128 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING 平臺(tái)分析并用Cytoscape 軟件平臺(tái)建立PPI 圖，結(jié)果見圖2。節(jié)點(diǎn)代表不同靶點(diǎn)，交互作用強(qiáng)弱以節(jié)點(diǎn)連線數(shù)量表示，節(jié)點(diǎn)顏色由外到內(nèi)變化代表相應(yīng)的degree 值由小到大。Degree 值均大于中位數(shù)12 的靶點(diǎn)共有56 個(gè)，其中靶點(diǎn)、、、、、、、、、、、、的Degree 值大于中位數(shù)的3 倍，表明以上靶點(diǎn)可能為桑枝治療HUA 的核心靶點(diǎn)，對(duì)發(fā)揮治療作用具有重要意義。

圖2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Protein interaction network diagram

2.4 交集靶點(diǎn)富集分析

于DAVID 平臺(tái)進(jìn)行GO 功能注釋及KEGG 富集分析（＜0.01）。GO 分析共獲取295 個(gè)條目，將前10 結(jié)果可視化，結(jié)果見圖3。生物過程（BP）共212 個(gè)，主要包括細(xì)胞增殖正相調(diào)控、凋亡過程負(fù)相調(diào)控等；細(xì)胞組成（CC）共31 個(gè)，靶點(diǎn)主要存在于質(zhì)膜及細(xì)胞質(zhì)等；分子功能（MF）共52 個(gè)，主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP 結(jié)合等。

圖3 桑枝靶點(diǎn)GO 功能富集分析Fig.3 GO function enrichment analysis of the targets of mulberry twig

KEGG 富集分析結(jié)果表明，128 個(gè)交集靶點(diǎn)總共涉及78 條通路（＜0.01），信號(hào)通路排名前25 的結(jié)果見圖4，主要包括PI3K-Akt、TNF、Ras、Rap1、HIF-1、TRP、Cancer、Toll-like receptor等信號(hào)通路。

圖4 桑枝靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of the targets of mulberry twig

2.5 “化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)作用圖

將成分、靶點(diǎn)及通路預(yù)測結(jié)果處理后，導(dǎo)入到Cytoscape 平臺(tái)，搭建三者之間交互作用圖，結(jié)果見圖5。其中，環(huán)桑色烯（Cyclomulberrochromene）、槲皮素（Quercetin）、柚皮素（Naringenin）、異鼠李素（Isorhamnetin）、圣草酚（Eriodictyol）、山奈酚（Kaempferol）、桑色素（Morin）、桑辛素M（Moracin M）、木犀草素（Luteolin）、桑黃酮E（Kuwanon E）等的degree 值較高（圖中藍(lán)色圓點(diǎn)），degree 值分別為32、28、25、28、23、27、27、27、27、26，均能與多個(gè)靶點(diǎn)相互作用，推測上述組分可能是桑枝治療HUA的主要活性組分。

圖5 “化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 “Compound-Target-Pathway”network diagram

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

將“2.3”項(xiàng)下靶點(diǎn)蛋白分別與“2.5”項(xiàng)下活性組分及對(duì)照藥（非布司他）進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果見圖6。當(dāng)配體與受體相互作用時(shí)，一般認(rèn)為結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol，則表明兩者結(jié)合良好，并且該值越小代表結(jié)合越良好，相互作用越強(qiáng)。結(jié)果顯示，95%組分與靶點(diǎn)蛋白之間均具有較好的結(jié)合，且部分結(jié)合性優(yōu)于對(duì)照藥，揭示預(yù)測結(jié)果較為可靠。

圖6 分子對(duì)接能量熱圖Fig.6 Molecular docking heat-map

選取結(jié)合能較小的結(jié)果進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，Kuwanon E 與中的Pro-249、Tyr-152 形成氫鍵，與Phe-153 產(chǎn)生π-π 共軛，與Lys-206、Phe-153 形成疏水作用，使體系能量降低，結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定（圖7A）；Luteolin 分別與中的His-204、Glu-181、Thr-182 形成氫鍵，與Lys-206 產(chǎn)生疏水作用，使體系能量降低，形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)（圖7B）；與中的Gln-51、Tyr-224、Asp-228 形成氫鍵，與Trp-52 產(chǎn)生疏水作用，降低體系能量，形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)（圖7C）；與中的Gln-661、Pro-168、Pro-757殘基形成氫鍵，與Arg-662 產(chǎn)生疏水作用，形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)（圖7D）；結(jié)果表明幾者之間均結(jié)合良好。

圖7 桑枝分子對(duì)接模式圖Fig.7 Molecular docking pattern diagram of mulberry twig

3 討論與結(jié)論

“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霰砻鳎Ｉ?、槲皮素、異鼠李素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、環(huán)桑色烯、桑辛素M 等為桑枝治療HUA 的主要活性組分。研究表明：桑色素是一種具有抑制和促進(jìn)尿酸排泄雙重作用的天然產(chǎn)物黃酮成分；槲皮素可降低XOD 活性，并減少葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9 在肝臟及腸道中的表達(dá)量，從而使血清尿酸（UA）表達(dá)水平降低；異鼠李素能夠抑制XOD 在肝臟中的活性，從而使UA 的產(chǎn)生量減少；山奈酚能抑制XOD 的活性且具有顯著性，當(dāng)?shù)孜锱cXOD 活性位點(diǎn)中心結(jié)合時(shí)，其能夠占據(jù)該位點(diǎn)，從而使尿酸生成量減少；柚皮素能清除XOD 活性；木犀草素能夠降低血清IL-1和TNF-表達(dá)水平，還能通過降低腎臟mURAT1，并在一定程度上抑制XO 活性，對(duì)高尿酸血癥小鼠具有有效的尿酸排泄作用。上述結(jié)果表明本研究篩選具有一定的理論依據(jù)，可為桑枝治療HUA 的藥效成分研究提供方向，綜上初步推測加強(qiáng)尿酸排泄、抑制尿酸生成以及改善炎癥3 個(gè)方面可能是桑枝中主要活性組分發(fā)揮治療HUA 的作用方式。分子對(duì)接結(jié)果表明，桑枝活性組分與核心靶點(diǎn)結(jié)合良好（結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol），其中對(duì)接結(jié)合能最好的活性化合物L(fēng)uteolin 與關(guān)鍵的、核心靶點(diǎn)蛋白，研究證明Luteolin 可以濃度依賴性地抑制靶點(diǎn)蛋白的表達(dá)量；Luteolin 可作為靶點(diǎn)蛋白的直接抑制劑，從而在NF-B 的激活中起核心作用，證實(shí)了Luteolin 具有較強(qiáng)的抗炎活性，其能夠直接阻斷激酶活性。綜上可知活性組分可對(duì)關(guān)鍵核心靶點(diǎn)加以調(diào)控從而發(fā)揮治療HUA 作用，另一方面也對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測結(jié)果的可靠性進(jìn)行了驗(yàn)證。高尿酸血癥（HUA）是一種代謝性疾病，與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。在桑枝治療HUA 的分子機(jī)制中，GO 功能注釋及KEGG通路分析結(jié)果表明，128 個(gè)核心靶點(diǎn)在功能注釋方面，主要參與細(xì)胞增殖的正調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)自磷酸化、血管生成、炎癥反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)等發(fā)揮關(guān)鍵治療作用的生物過程；在分子功能方面，發(fā)揮蛋白酪氨酸激酶活性、ATP 結(jié)合、受體結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶活性等關(guān)鍵功能作用，提示桑枝可能通過體內(nèi)的多種生物學(xué)過程發(fā)揮治療HUA 的作用。KEGG 通路富集分析方面，桑枝活性主要涉及調(diào)控TNF、HIF-1、Cancer、PI3K-Akt、Ras、Rap1、TRP、Toll-like receptor 等信號(hào)通路，結(jié)合PPI 拓?fù)浞治龊Y選桑枝防治HUA 的核心靶點(diǎn)，推測桑枝可能通過調(diào)控如、、、、等靶點(diǎn)，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、蛋白質(zhì)ATP 結(jié)合的過程，從而抑制炎癥反應(yīng)、改善免疫功能及調(diào)節(jié)尿酸代謝轉(zhuǎn)運(yùn)來發(fā)揮治療HUA 作用。大量研究證明，TNF 信號(hào)通路在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中意義重大，其機(jī)制包括誘導(dǎo)IL-1 活化、增強(qiáng)IL-6 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、激活NFB 炎癥信號(hào)通路，該過程與慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)；并且TNF-水平在痛風(fēng)患者血清中表達(dá)會(huì)升高，當(dāng)NF-B 的表達(dá)被TNF-上調(diào)后會(huì)引起一系列效應(yīng)，從而使機(jī)體炎癥反應(yīng)程度受到影響，與HUA的發(fā)生密切相關(guān)。TRP 通路屬離子通道類，與炎癥和疼痛發(fā)生息息相關(guān)，研究揭示，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、骨關(guān)節(jié)炎等病癥和該通路密切相關(guān)。Toll-like receptor 通路與炎性疾病關(guān)系緊密，其能夠識(shí)別內(nèi)源性的尿酸鹽結(jié)晶信號(hào)分子，從而激活NFB，進(jìn)而誘導(dǎo)IL-1、IL-6、IFN-、TNF-、IFN-等炎癥因子釋放表達(dá)，促進(jìn)痛風(fēng)性炎癥發(fā)作。PI3K-Akt 信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡及細(xì)胞增殖兩方面緊密相關(guān)，調(diào)控該信號(hào)通路，可以使造血和血小板生成率增加，發(fā)揮補(bǔ)血活血的作用，從而促進(jìn)血管新生，加快生物過程轉(zhuǎn)化，推測調(diào)控該通路可以促進(jìn)代謝轉(zhuǎn)運(yùn)，從而加快尿酸排泄。綜上，本研究采取網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)桑枝治療HUA 的活性組分、核心靶點(diǎn)及信號(hào)通路作了初步探索，并借助分子對(duì)接將活性組分及核心靶點(diǎn)加以進(jìn)一步驗(yàn)證，從系統(tǒng)層面闡釋了桑枝治療HUA 中多組分、多通路、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。但由于中藥成分具有復(fù)雜性，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)桑枝的初步探索仍具有不足，針對(duì)預(yù)測結(jié)果中桑枝治療HUA 的作用靶點(diǎn)及通路，后期將進(jìn)一步予以實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期為桑枝治療HUA 的藥效組分研究提供理論依據(jù)及參考，也為后期加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化及進(jìn)一步探討提供依據(jù)。