強(qiáng)直性脊柱炎患者腸道菌群特征與疾病活動(dòng)度及外周血淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性

宋子怡，張升校，趙 蓉，喬 軍，宋 珊，程 婷，王彩虹，李小峰

山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 1風(fēng)濕免疫科 2風(fēng)濕免疫微生態(tài)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001 3山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030000

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種以中軸關(guān)節(jié)慢性炎癥為主要特征的風(fēng)濕免疫性疾病，病變主要累及骶髂關(guān)節(jié)與脊柱[1]。AS病因復(fù)雜，涉及遺傳、感染、環(huán)境、免疫等多個(gè)方面[2]，其中腸道微生物與AS發(fā)病密切相關(guān)[3]。人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-B27是位于細(xì)胞表面的糖蛋白，參與免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)，絕大多數(shù)AS患者呈HLA-B27陽(yáng)性，其可通過(guò)與腸道菌群相互作用進(jìn)而誘發(fā)AS[4]。Costello等[5]對(duì)腸道菌群16S rRNA基因測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，AS患者回腸中毛螺菌科、韋榮球菌科、普雷沃氏菌科、紫單胞菌科、擬桿菌科的相對(duì)豐度升高，瘤胃球菌科、理研菌科的相對(duì)豐度降低。Zhou等[3]通過(guò)宏基因組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，AS患者腸道富集的菌屬主要為擬桿菌、副桿菌、雙歧桿菌、發(fā)酵氨基酸球菌和普雷沃氏菌。Dominguez-Lopez等[6]則發(fā)現(xiàn)，HLA-B27陽(yáng)性AS患者腸道耶爾森氏菌、克雷伯氏菌和沙門氏菌水平增高。上述研究提示，AS患者腸道菌群處于失調(diào)狀態(tài)，直接或間接促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展，但作為免疫性疾病，AS患者中差異表達(dá)的菌群與具有免疫調(diào)節(jié)作用的淋巴細(xì)胞亞群水平的關(guān)系尚未明確，腸道菌群通過(guò)重塑免疫系統(tǒng)影響疾病活動(dòng)度的機(jī)制相關(guān)研究尚無(wú)報(bào)道。本研究對(duì)AS患者與健康人群的16S rRNA基因進(jìn)行高通量測(cè)序，分析AS患者腸道菌群變化，旨在揭示腸道菌群與AS發(fā)病的內(nèi)在聯(lián)系；同時(shí)探究腸道菌群與疾病活動(dòng)度和外周血淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性，以期為臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為回顧性分析。研究對(duì)象為2019年12月至2020年6月山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院住院治療的AS患者及性別、年齡與之相匹配的健康人群。收集兩組的基線資料，包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、臨床診斷、病程以及既往用藥情況。

AS納入標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)1984年修訂的紐約診斷標(biāo)準(zhǔn)均確診為AS，且處于活動(dòng)期[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)糞便標(biāo)本采集前1個(gè)月內(nèi)服用抗生素、益生菌/益生元等微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，3個(gè)月內(nèi)服用中藥(包括中成藥、成分明確的湯劑和成分未知的偏方等)或有灌腸史；(2)處于妊娠期；(3)合并惡性腫瘤、代謝性疾病或其他免疫性疾病。

健康人群來(lái)源于山西省人民醫(yī)院健康體檢中心，其納入標(biāo)準(zhǔn)：自覺無(wú)身體不適且體檢結(jié)果證實(shí)無(wú)明確的臨床疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)糞便標(biāo)本采集前1個(gè)月內(nèi)服用抗生素、益生菌/益生元等微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，3個(gè)月內(nèi)服用中藥(包括中成藥、成分明確的湯劑和成分未知的偏方等)或有灌腸史；(2)處于妊娠期。

本研究已通過(guò)山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審批(審批號(hào)：2017-KY-004)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集

AS患者于入院第二天收集初次中段糞便標(biāo)本(約10 g)，1 min內(nèi)稱取500 mg置于無(wú)菌離心管中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時(shí)采集外周靜脈血，2 h內(nèi)送檢實(shí)驗(yàn)室測(cè)定紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)和淋巴細(xì)胞亞群。

1.2.2 16S rRNA基因組DNA提取

采用QIAamp PowerFecal DNA試劑盒提取兩組糞便組織腸道菌群16S rRNA基因組DNA。向加有糞便標(biāo)本的磁珠管中依次加入PowerBead Solution緩沖液750 μL和Solution C1溶液60 μL，輕輕震蕩混勻，置于65 ℃水浴中孵育10 min；將磁珠管置于離心機(jī)中，13 000×g離心1 min；取上清液(400～500 μL)轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，并加入Solution C2溶液250 μL，渦旋混勻，2～8 ℃孵育5 min；瞬時(shí)離心后取600 μL上清液至2 mL離心管中；加入Solution C3溶液200 μL，依次震蕩混勻、孵育、離心，取700 μL上清液至新的離心管；加入Solution C4溶液1200 μL，渦旋混勻。取700 μL上清液，加至核酸純化柱(MB Spin Column)中，13 000×g離心1 min去除濾液；重復(fù)上述操作，直至所有上清液均通過(guò)純化柱。加入Solution C5溶液500 μL，13 000×g離心1 min后去除濾液。于離心柱白色濾膜中心處加入Solution C6溶液100 μL洗脫DNA。采用超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度，質(zhì)量合格后-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 16S rRNA基因擴(kuò)增及測(cè)序

采用兩步法對(duì)腸道菌群的16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系主要包括模板DNA、dNTP、緩沖液、高保真DNA聚合酶KAPA HiFi HotStart Ready Mix(美國(guó)Roche公司)及引物(上游引物：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′；下游引物：5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。擴(kuò)增后均采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量，合格后將PCR產(chǎn)物置于DNA片段篩選磁珠試劑盒中純化并回收。采用Qubit 4.0熒光定量?jī)x將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物制備為樣品混合文庫(kù)，濃度達(dá)4 nmol/L后上機(jī)檢測(cè)，采用Illumina Miseq PE300系統(tǒng)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

將測(cè)序獲得的paired-end (PE) reads拼接成一條序列。首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量的測(cè)序樣本，得到清潔數(shù)據(jù)。采用Trimmomatic V0.32軟件濾除低質(zhì)量序列和接頭序列，采用USEARCH 11.0.1軟件去除嵌合序列。采用QIIME2 2021.2軟件對(duì)樣品序列進(jìn)行質(zhì)控、去噪。將每個(gè)操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)代表性序列與SILVA 16S rDNA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，得到最終的優(yōu)化序列，隨后對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行物種分類注釋和OTU聚類分析，得到對(duì)應(yīng)的物種信息和豐度分布情況。后續(xù)分析采用R 4.0.1軟件進(jìn)行：(1)菌群多樣性：采用Vegan程序包和非參數(shù)多元方差分析進(jìn)行菌群多樣性分析，包括α多樣性和β多樣性。α多樣性分析中，以Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)評(píng)估菌群豐富度，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)評(píng)估菌群多樣性，以Goods Coverage指數(shù)評(píng)估測(cè)序深度覆蓋樣本中所有物種的概率，以稀釋曲線評(píng)估測(cè)序深度；β多樣性分析中，采用基于Bray curtis距離矩陣的主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis,PCoA)評(píng)估菌落特征，并繪制矩陣樣本樹樹狀圖。(2)腸道微生態(tài)構(gòu)成：在門、屬水平上分析AS患者與健康人群腸道主要組成菌群的組成(相對(duì)豐度大于1%的物種)。(3)差異菌群：基于Stamp分析，采用t檢驗(yàn)比較兩組人群在門、屬水平上的差異菌群。

1.2.5 外周血淋巴細(xì)胞測(cè)定

采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)。包括T細(xì)胞(CD3+CD45+)、B細(xì)胞 (CD19+CD45+)、CD4+T細(xì)胞(CD3+CD4+CD45+)、CD8+T細(xì)胞(CD3+CD8+CD45+)、自然殺傷 (natural killer,NK)細(xì)胞 (CD16+CD56+CD45+)、Th1細(xì)胞(CD4+IL-2+)、Th2細(xì)胞(CD4+IL-4+)、Th17細(xì)胞(CD4+IL-17+)、Treg細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3+)。

1.2.6 疾病活動(dòng)度評(píng)價(jià)

AS患者疾病活動(dòng)度的評(píng)定采用強(qiáng)直性脊柱炎疾病活動(dòng)度-C反應(yīng)蛋白評(píng)分(ankylosing spondylitis disease activity score-C-reactive protein,ASDAS-CRP)[8]，分為臨床緩解(ASDAS-CRP<1.3分)、低疾病活動(dòng)度(1.3分≤ ASDAS-CRP<2.1分)、高疾病活動(dòng)度(2.1分≤ ASDAS-CRP<3.5分)、極高疾病活動(dòng)度(ASDAS-CRP≥3.5分)。

1.3 樣本量估算

由于表示腸道菌群與疾病關(guān)聯(lián)強(qiáng)度估計(jì)值的比值比在文獻(xiàn)中缺乏記載，暫未進(jìn)行樣本量估算。查詢文獻(xiàn)，一般腸道菌群分析相關(guān)論文的樣本量均較小，甚至有9例患者和9例健康人群的報(bào)道[5]。本文擬納入62例AS患者和62例健康人群，理論上可滿足數(shù)據(jù)分析需求。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用R 4.0.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。年齡、體質(zhì)量指數(shù)等計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；ESR、CRP不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)(四分位數(shù))表示。性別、用藥情況等為計(jì)數(shù)資料，以頻數(shù)(百分?jǐn)?shù))表示。腸道差異菌群的比較采用t檢驗(yàn)。采用Spearman法分析AS患者腸道差異菌群與疾病活動(dòng)度、外周血淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

共入選符合納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的AS患者62例、健康人群62名。兩組體質(zhì)量指數(shù)無(wú)顯著差異[(24.18±3.40)kg/m2比(24.33±3.52)kg/m2，P=0.810]。健康人群中，男性42例、女性20例；年齡(42.0±13.5)歲。AS患者中，男性42例、女性20例，年齡(42.0±13.7)歲，HLA-B27陽(yáng)性(83.87%)，病程1.8(0，8.0)年，延遲診斷2.0(0，8.5)年，ESR為32.5(14.5，54.0)mm/h，CRP為15.9(5.2，35.9)mg/L，低、高、極高疾病活動(dòng)度分別11例(17.7%)、26例(41.9%)、25例(40.3%)。既往用藥情況：應(yīng)用激素2例(3.2%)、非甾體抗炎藥24例(38.7%)、免疫抑制劑9例(14.5%)、生物制劑10例(16.1%)、其他3例(4.8%)。

2.2 測(cè)序結(jié)果

124份糞便標(biāo)本，經(jīng)測(cè)序、篩選共獲得1 843 905條優(yōu)化序列，平均每個(gè)樣本14 870條序列，經(jīng)過(guò)濾與合并，共獲得5 594 217個(gè)用于構(gòu)建OTU的高質(zhì)量序列。序列共聚類為1051個(gè)OTU，其序列相似性為97%。AS患者和健康人群的Goods Coverage指數(shù)分別為99.7%、99.8%，提示測(cè)序深度已基本覆蓋樣本中的所有物種，測(cè)序結(jié)果可反映樣本中微生物真實(shí)情況。逐步擴(kuò)大隨機(jī)抽樣的測(cè)序深度，可見隨測(cè)序深度增加，稀釋曲線斜率逐漸趨于平坦，提示測(cè)序量充足，樣本的 α多樣性指標(biāo)已達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)(圖1)。

圖1 AS患者與健康人群腸道菌群α多樣性稀釋曲線圖

2.3 腸道菌群多樣性分析

α多樣性分析顯示，AS患者腸道菌群Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均低于健康人群，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)亦低于健康人群，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。β多樣性分析顯示，兩組菌群在PCoA1軸與PCoA2軸之間形成兩個(gè)不同的群落，表明二者的菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異(P<0.01)，見圖2。

圖2 AS患者與健康人群腸道菌群多樣性比較

AS：強(qiáng)直性脊柱炎

A.α多樣性；B.β多樣性

AS：同圖1

2.4 腸道微生態(tài)構(gòu)成及菌群差異

為了解兩組腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)差異，本研究在門和屬水平上分析了相對(duì)豐度大于1%的物種組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌門均以厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門為主，但在門水平和屬水平上多種菌群的相對(duì)豐度存在差異。

基于兩組物種差異t檢驗(yàn)，圖3展示了在門水平前10個(gè)和屬水平前33個(gè)差異豐富的菌群。在門水平上，相較于健康人群，AS患者變形菌門、髕骨細(xì)菌門、廣古菌門和迷蹤菌門的相對(duì)豐度升高(P均<0.05)，厚壁菌門、梭桿菌門、疣微菌門、協(xié)同菌門和彎曲桿菌門等菌群的相對(duì)豐度均降低(P均<0.05)。在屬水平上，AS患者大腸桿菌志賀菌屬、活潑瘤胃球菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、克雷伯氏菌屬、腸球菌屬、腸桿菌屬、鏈球菌屬、產(chǎn)糞甾醇真桿菌屬等菌群的相對(duì)豐度升高(P均<0.05)，普雷沃氏菌屬、糞桿菌屬、阿加桿菌屬、羅氏菌屬、戴阿利斯特桿菌屬、挑剔真桿菌屬、毛螺菌屬、糞球菌屬、擬普雷沃

圖3 基于Stamp分析和t檢驗(yàn)的AS患者與健康人群腸道菌群差異圖

A.門水平；B.屬水平

AS：同圖1

氏菌屬、沙門氏菌屬、梭桿菌屬、Muri菌屬、藍(lán)綠藻菌屬、毛螺菌科NK4A136組菌屬、考拉桿菌屬、多爾氏菌屬、丁酸弧菌屬、丁酸球菌屬、毛螺菌科UCG-004屬、霍氏真桿菌屬等菌群的相對(duì)豐度均降低(P均<0.05)。

2.5 腸道菌群與AS疾病活動(dòng)度、外周血淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性

基于Stamp分析結(jié)果，選取AS患者中與健康人群相對(duì)豐度差異顯著的菌群，進(jìn)一步分析菌群與疾病活動(dòng)度、外周血淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性，結(jié)果顯示AS患者外周血ESR與克雷伯氏菌屬(r=0.309，P=0.015)、丁酸球菌屬(r=0.310，P=0.014)、羅氏菌屬(r=0.342，P=0.007)的相對(duì)豐度，CRP與糞桿菌屬(r=0.352，P=0.005)、Muri菌屬(r=0.268，P=0.035)的相對(duì)豐度，ASDAS-CRP評(píng)分與糞桿菌屬(r=0.351，P=0.005)、瘤胃球菌屬(r=0.274，P=0.031)的相對(duì)豐度呈正相關(guān)，見圖4。

阿加桿菌屬的相對(duì)豐度與T細(xì)胞(r=0.302，P=0.017)、CD4+T細(xì)胞(r=0.310，P=0.014)、B細(xì)胞(r=0.292，P=0.021)、Th2細(xì)胞(r=0.429，P<0.001)、Th17細(xì)胞(r=0.288，P=0.023)水平，鏈球菌屬的相對(duì)豐度與B細(xì)胞水平(r=0.270，P=0.034)，普雷沃氏菌屬的相對(duì)豐度與Th1細(xì)胞(r=0.279，P=0.028)、Th17細(xì)胞(r=0.262，P=0.040)水平，CAG-352菌屬的相對(duì)豐度與Th1細(xì)胞水平(r=0.283，P=0.030)均呈正相關(guān)；大腸桿菌志賀菌屬的相對(duì)豐度與Th2細(xì)胞水平(r=-0.261，P=0.040)，其他腸桿菌科細(xì)菌屬的相對(duì)豐度與CD4+T細(xì)胞水平(r=-0.255，P=0.046)均呈負(fù)相關(guān)，見圖4。

圖4 差異菌群相對(duì)豐度與疾病活動(dòng)度、外周血淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性

3 討論

腸道內(nèi)微生物數(shù)量驚人，約1014個(gè)，比人體的細(xì)胞還要多，其可將食物成分分解轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并防止病原體通過(guò)胃腸道黏膜侵入機(jī)體、維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，與機(jī)體的多種生命活動(dòng)息息相關(guān)，被稱為“微生物器官”。病理狀態(tài)下，腸道菌群多樣性、組成和功能會(huì)發(fā)生變化，即腸道菌群紊亂。此時(shí)，致病菌可侵襲黏膜固有層，腸道通透性增加并激活炎癥細(xì)胞釋放促炎因子，誘發(fā)AS等多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展[9]。本研究以體檢健康人群為參照，探究了AS患者腸道微生物變化，并進(jìn)一步分

ESR:紅細(xì)胞沉降率；CRP:C反應(yīng)蛋白；ASDAS:強(qiáng)直性脊柱炎疾病活動(dòng)度評(píng)分；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

析其與疾病活動(dòng)度、外周血淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性，結(jié)果表明AS患者腸道菌群α多樣性降低，β多樣性亦存在顯著差異；其克雷伯氏菌屬、大腸桿菌志賀菌屬、腸桿菌屬等致病菌增多，厚壁菌門、梭桿菌門等有益菌減少，且與ESR、CRP、ASDAS-CRP等疾病活動(dòng)度指標(biāo)以及外周血淋巴細(xì)胞亞群具有一定相關(guān)性，可能促進(jìn)了AS發(fā)病。

16S rRNA是原核生物核糖體中30S亞基的組成部分，根據(jù)不同物種間的同源性，其序列分為保守區(qū)和可變區(qū)，呈交替排列。原核16S rRNA序列的保守區(qū)反映了物種間的親緣關(guān)系，而可變區(qū)則可體現(xiàn)物種間的差異。因此，16S rDNA可作為微生物系統(tǒng)分類研究中最常用的分子標(biāo)志物。目前已有眾多學(xué)者對(duì)腸道菌群與AS的關(guān)系進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)AS患者的腸道菌群呈現(xiàn)為異于健康人群的分布特征，認(rèn)為紊亂的腸道菌群可通過(guò)調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)促進(jìn)AS進(jìn)展，但不同研究對(duì)AS患者腸道菌群多樣性特征存在爭(zhēng)議[3,5,10-11]。Costello等[5]、Breban等[12]通過(guò)對(duì)AS患者腸道菌群16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序，分別得出AS患者腸道菌群多樣性增加和多樣性降低兩個(gè)截然不同的結(jié)論。Zhang等[10]、Liu等[13]比較了AS患者與健康人群腸道菌群多樣性后發(fā)現(xiàn)，Shannon、Simpson、Chao1和ACE指數(shù)均無(wú)顯著差異。Chen等[11]在一項(xiàng)納入41例AS患者和19名健康人群的研究中發(fā)現(xiàn)，二者的Shannon和Simpson指數(shù)無(wú)顯著差異，而β多樣性有顯著差異，基于差異菌建立的模型區(qū)分AS患者和健康人群的曲線下面積高達(dá)0.950。本研究首先對(duì)AS患者的菌群多樣性進(jìn)行了探索，結(jié)果顯示相較于健康人群，代表物種豐富度的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)在AS患者中均降低，表示物種多樣性的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)無(wú)顯著變化；在β多樣性分析中，AS患者形成了不同于健康人群的群落，表明菌群多樣性改變可能并非AS患者腸道菌群變化的最主要特征，相較菌群種類，最主要的變化主要體現(xiàn)為細(xì)菌豐富度變化，這可能進(jìn)一步影響其腸道功能。本研究AS患者腸道菌群多樣性變化特征與既往研究不完全一致，分析原因：腸道菌群受等多種因素的影響，如年齡、種族、地理位置、飲食習(xí)慣、吸煙情況；此外本研究部分AS患者正在接受藥物治療，亦可能影響其菌群多樣性檢測(cè)結(jié)果。

除菌群多樣性存在差異外，雖然AS患者與健康人群腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌門均以厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門為主，但在門水平和屬水平上二者多種菌群的豐度存在差異。在門水平上，AS患者變形菌門、髕骨細(xì)菌門、廣古菌門等表達(dá)升高，厚壁菌門、梭桿菌門、疣微菌門、協(xié)同菌門和彎曲桿菌門等表達(dá)降低；在屬水平上，大腸桿菌志賀菌屬、克雷伯氏菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬等表達(dá)較高，普雷沃氏菌屬、糞桿菌屬等表達(dá)較低。這些差異表達(dá)的菌群不僅影響腸道微生物代謝水平，同時(shí)可通過(guò)增加腸道通透性、分子模擬以及代謝產(chǎn)物等機(jī)制刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，促進(jìn)自身抗體生成，加速AS發(fā)展。如AS患者回腸中存在大腸桿菌等侵入性和粘附性細(xì)菌，其豐度增加可導(dǎo)致緊密連接蛋白減少和腸道血管屏障受損，進(jìn)而引起“腸漏”[14]。此時(shí)，腸道內(nèi)的病原體及細(xì)菌產(chǎn)物可能隨血液到達(dá)關(guān)節(jié)等部位，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。在HLA-B27陽(yáng)性的遺傳背景下，腸道菌群紊亂可增加AS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[15]。一些研究支持了腸道菌群可通過(guò)與HLA-B27相互作用增加AS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的觀點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，HLA-B27陽(yáng)性個(gè)體對(duì)克雷伯氏菌、耶爾森菌和沙門氏菌熱休克蛋白的IgG抗體水平高于HLA-B27陰性人群[6]。

關(guān)于AS中腸道微生物組和HLA-B27的作用機(jī)制有兩種假說(shuō)。Ebringer等[16]針對(duì)腸道菌群與AS的關(guān)系提出了“分子模擬”假說(shuō)，認(rèn)為腸道克雷伯氏菌的多肽結(jié)構(gòu)與HLA-B27分子中的部分氨基酸序列相似，由此產(chǎn)生的交叉免疫反應(yīng)可激活CD8+T或B細(xì)胞，誘發(fā)AS。另一種假說(shuō)認(rèn)為由于HLA-B27結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成時(shí)速度緩慢，易發(fā)生折疊錯(cuò)誤，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致Paneth細(xì)胞表達(dá)過(guò)多白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-23及輔助性Th17細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量干擾素-β、腫瘤壞死因子-α與IL-17[17]，發(fā)生持續(xù)性炎癥反應(yīng)，該過(guò)程與沙門氏菌復(fù)制能力增強(qiáng)有關(guān)[18]。本研究中沙門氏菌的相對(duì)豐度降低，推測(cè)可能與大部分患者既往或正在接受治療有關(guān)。據(jù)研究表明，延緩病情的抗風(fēng)濕藥[19]、生物制劑[20]可通過(guò)維持腸道緊密連接或恢復(fù)正常腸道菌群結(jié)構(gòu)延緩AS發(fā)展。此外，鏈球菌屬等機(jī)會(huì)性致病菌可誘導(dǎo)具有機(jī)體免疫防御的功能細(xì)胞因子和趨化因子快速產(chǎn)生(如干擾素-γ)，并介導(dǎo)參與AS發(fā)病的促炎細(xì)胞因子IL-17和腫瘤壞死因子-α分泌[21-22]。厚壁菌門、梭狀芽胞桿菌等益生菌通過(guò)分解膳食纖維產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)，誘導(dǎo)Treg分化，進(jìn)而產(chǎn)生IL-10等抗炎細(xì)胞因子，增強(qiáng)機(jī)體免疫耐受功能[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門、梭桿菌門等益生菌的相對(duì)豐度減少，可能促進(jìn)了AS發(fā)病。

ESR、CRP、ASDAS-CRP是評(píng)價(jià)AS疾病活動(dòng)度的常用指標(biāo)，其水平高低與炎性腰背痛、晨僵等癥狀顯著相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，克雷伯氏菌屬、丁酸球菌屬、羅氏菌屬、糞桿菌屬、Muri菌屬、糞桿菌屬和瘤胃球菌屬等特定菌群表達(dá)水平與疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)，表明這些細(xì)菌可能參與AS患者病情進(jìn)展。克雷伯氏菌是一類有莢膜的革蘭氏陰性桿菌，其中肺炎克雷伯菌是醫(yī)源性感染的主要細(xì)菌之一。HLA-B27陽(yáng)性AS患者中，糞便產(chǎn)氣克雷伯菌與急性非肉芽腫性前葡萄膜炎和外周滑膜炎具有相關(guān)性[25]。Zhang等[26]認(rèn)為腸道菌群參與了AS發(fā)病，并從基因?qū)W說(shuō)、受體學(xué)說(shuō)、分子擬態(tài)等方面總結(jié)了肺炎克雷伯菌感染促進(jìn)AS發(fā)病的機(jī)制。此外，有研究[27]發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌可與抗HLA-B27單克隆抗體相結(jié)合，提示肺炎克雷伯菌可通過(guò)交叉免疫反應(yīng)參與AS發(fā)生與發(fā)展。在非活動(dòng)性AS患者中，克雷伯氏菌培養(yǎng)陽(yáng)性與隨后發(fā)生的炎癥損傷具有相關(guān)性，認(rèn)為克雷伯氏菌是AS的始動(dòng)因子，進(jìn)一步證實(shí)了該菌在AS進(jìn)展中的作用[28]。上述研究表明，以克雷伯氏菌增高為代表的腸道菌群紊亂可引起疾病活動(dòng)度增加，進(jìn)而促進(jìn)AS發(fā)展[29]。AS患者常合并炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)，研究表明活潑瘤胃球菌屬豐度增加與較高的IBD疾病活動(dòng)度相關(guān)，該菌群可通過(guò)影響腸道黏液層的功能而破壞腸道屏障完整性，促進(jìn)疾病發(fā)生[30]。本研究活潑瘤胃球菌屬的相對(duì)豐度增加，與Breban等[12]觀察結(jié)果一致，為活潑瘤胃球菌參與AS發(fā)病提供了證據(jù)。

AS作為一種風(fēng)濕免疫性疾病，免疫功能異常在其中占據(jù)重要地位。外周血淋巴細(xì)胞亞群是機(jī)體主要的免疫細(xì)胞，其與AS的關(guān)系逐漸被研究者所關(guān)注。為進(jìn)一步明確腸道菌群在AS進(jìn)展中的作用，本研究首次對(duì)腸道菌群與AS患者外周血淋巴細(xì)胞亞群水平的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示阿加桿菌屬的相對(duì)豐度與T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞，普雷沃氏菌屬的相對(duì)豐度與Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞水平呈正相關(guān)。阿加桿菌屬數(shù)量增加可激發(fā)腸道免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)Th17等促炎免疫細(xì)胞分化，介導(dǎo)AS進(jìn)展，但具體機(jī)制尚不明確。普雷沃氏菌是一種條件致病菌，與腸道炎癥關(guān)系密切，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病中，其表達(dá)增高可作為機(jī)體微生物失調(diào)的標(biāo)志性特征。普雷沃氏菌主要激活Toll樣受體2，促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生IL-23和IL-1等炎癥因子，并刺激上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-8、IL-6和趨化因子CCL20，誘導(dǎo)腸道黏膜中性粒細(xì)胞聚集，發(fā)生Th17免疫反應(yīng)。此外，普雷沃氏菌屬介導(dǎo)的黏膜炎癥可播散至全身，導(dǎo)致全身性疾病[31]。本研究結(jié)果阿加桿菌屬與普雷沃氏菌屬的相對(duì)豐度在AS患者中均顯著降低，推測(cè)可能與患者入院前接受治療有關(guān)，且其他因素如飲食習(xí)慣、地理環(huán)境等亦可影響腸道菌群特征。

本研究局限性：(1)部分患者正在接受或入院前已接受藥物治療，可能影響腸道菌群測(cè)定結(jié)果。(2)因腸道菌群受種族、地理位置、飲食習(xí)慣等影響，本研究對(duì)象主要來(lái)源于山西省內(nèi)，不能代表全國(guó)人群的腸道菌群特征，結(jié)果外推需謹(jǐn)慎。

綜上所述，隨著16S rRNA基因測(cè)序和宏基因組學(xué)等技術(shù)取得突破性進(jìn)展，腸道菌群和AS的聯(lián)系陸續(xù)被揭示。本研究進(jìn)一步明確了既往研究結(jié)果，提示AS患者腸道菌群多樣性降低，處于菌群失調(diào)狀態(tài)，并發(fā)現(xiàn)腸道菌群紊亂可能通過(guò)調(diào)控淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)目和功能進(jìn)而影響AS疾病活動(dòng)度、參與AS的發(fā)生與發(fā)展，為該病的臨床診療提供了新思路。

作者貢獻(xiàn)：宋子怡負(fù)責(zé)選題設(shè)計(jì)并撰寫論文初稿；張升校、喬軍負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析；趙蓉、宋珊、程婷負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集和文獻(xiàn)查閱；王彩虹、李小峰負(fù)責(zé)論文修訂。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突