參附注射液結合依達拉奉對心肌缺血再灌注損傷治療效果的影響分析＊

蘇天生 盧靜 肖章武 王志民

心肌缺血是由于冠狀動脈狹窄而心肌供血不足、供氧不足引起。目前臨床上針對心肌缺血主要采用溶栓治療或經皮冠狀動脈介入治療（PCI）來盡快恢復其血運，縮短缺血的時間，進而挽救患者的生命[1]。但是在再灌注過程中，可導致組織損傷呈進行性加重，即在缺血期間所引起的損傷性變化在再灌注后更為突出[2]。自由基生成在心肌缺血再灌注損傷中具有重要作用，依達拉奉作為一種有效的自由基清除劑和抗氧化劑，用于心肌缺血再灌注中具有良好的保護作用，減少再灌注損傷的發(fā)生[3-4]。而在進一步的研究中有學者發(fā)現，Wnt/β-聯蛋白（β-catenin）信號通路與心肌細胞的凋亡、壞死及氧化應激具有重要的關聯[5]。中成藥參附注射液以“益氣回陽，溫通心脈”的治則用于心肌缺血再灌注治療可有效改善心電圖，降低心律失常發(fā)生率，抑制心肌細胞凋亡[6]。為此，參附注射液結合依達拉奉是否能進一步增強療效受到了臨床的高度關注。本文將對兩種藥物單獨應用與聯合應用于大鼠的效果進行對比分析，以證實兩種藥物聯合應用時的有效性，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 動物材料 本次的研究對象為動物材料，50只SPF級的SD大鼠，均為雄性SD大鼠。納入標準：日齡 ＞56 d；體重在 300～400 g；雄性大鼠。排除標準：患有血管疾?。粚嶒炦^程中死亡。所有SD大鼠的喂養(yǎng)環(huán)境溫度為25 ℃，相對濕度為50%。所有SD大鼠在納入本實驗后喂養(yǎng)1周開始進行實驗，本研究的實驗過程嚴格遵守相關條例操作。

1.1.2 主要儀器 日本Olympus公司的BX51型光學顯微鏡，美國Perkin Elmer公司的XElx800型酶標儀，荷蘭Philips公司的1E33型超聲心動圖檢查儀，美國Harvard Apparatus公司的ALC-V8S型小動物呼吸機，德國Eppendorf公司的Centrifuge 5424R型低溫高速離心機等。

1.1.3 主要試劑 SOD酶聯免疫吸附試驗試劑盒（上海西格生物有限公司，批號XG-E0829），MDA酶聯免疫吸附試驗試劑盒（深圳子科生物科技有限公司，批號ZK-R3358），胰蛋白酶（美國Gibco公司，批號25200056），7-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號CA1410）等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組、模型建立與給藥 （1）分組：將50只大鼠編號后采取隨機數字表法分為五組，每組10只，分別為空白組、對照組、治療1組、治療2組、治療3組。（2）模型建立：通過手術給予對照組與3組治療組大鼠進行心肌缺血模型的建立。采用濃度為1%的戊巴比妥鈉（生產廠家：上海新亞藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字H31021725，規(guī)格：0.1 g）對大鼠進行麻醉，使用劑量為50 mg/kg，采取腹腔注射給藥方式。將大鼠以仰臥體位固定在手術臺上。對其胸部進行常規(guī)消毒后，將該處皮膚與部分肋骨剖開，使得大鼠的心臟顯露，將左冠狀動脈前降支分離并結扎，直至其左心室前壁的部分心肌組織呈現白色，即成功建立心肌缺血模型大鼠，最后進行切口的縫合。在手術期間，使用小動物呼吸機維持大鼠的呼吸頻率在100次/min，維持呼吸比為1∶2，維持潮氣量為8 ml。（3）給藥：將對照組與3組治療組的大鼠通過結扎左冠狀動脈前降支引起心肌缺血，再灌注前1 min給予治療1組參附注射液[生產廠家：華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字Z51020664，規(guī)格：10 ml/瓶 ]9 ml/kg，給予治療 2 組依達拉奉（生產廠家：山東羅欣藥業(yè)集團股份有限公司，批準文號：國藥準字 H20183189，規(guī)格：5 ml∶10 mg）10 mg/kg，給予治療3組參附注射液9 ml/kg聯合依達拉奉10 mg/kg，給予對照組生理鹽水 10 mg/kg，空白組大鼠不做任何處理（健康大鼠）。

1.2.2 大鼠組織取材 在完成心功能檢測后將大鼠處死，取其心臟后進行心室前壁組織與心肌組織的分離。將心室前壁組織浸泡于濃度為4%的多聚甲醛固定液中，共24 h，備用。心室前壁組織用于檢測Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達水平，心肌組織用于檢測氧化應激相關指標。

1.3 觀察指標

1.3.1 心功能指標 使用戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后，并將大鼠固定于手術臺上，采用超聲心動圖檢測其心功能指標，包括左室射血分數（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）?？瞻捉M大鼠檢測1次心功能指標即可，對照組與3組治療組的大鼠分別在灌注10、30、60 min各進行1次心功能指標檢測。

1.3.2 心肌組織氧化應激指標 采用酶聯免疫吸附法檢測，分別將酶標儀設定為490、695 nm波長的條件下進行超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的檢測。采用DCFH-DA熒光探針法檢測活性氧（ROS），使用流式細胞儀測得ROS的水平。

1.3.3 心室前壁組織中Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達水平 采用Western blot法進行檢測心室前壁組織中的Wnt1、β-catenin表達水平，通過全自動凝膠成像系統(tǒng)成像后，采取Image J v1.8.0軟件分析，取蛋白與內參灰度值的比值作為該蛋白的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0軟件對所得數據進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用配對樣本t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般資料對比

各組大鼠一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），有可比性，見表1。

表1 各組大鼠一般資料對比（±s）

表1 各組大鼠一般資料對比（±s）

組別 日齡（d） 體重（g）空白組（n=10） 63.00±4.00 331.42±12.63對照組（n=10） 62.00±3.00 330.23±15.81治療1組（n=10） 63.00±3.00 333.81±15.25治療2組（n=10） 62.00±4.00 331.75±15.31治療3組（n=10） 63.00±4.00 330.89±12.46 F值 0.230 0.090 P值 0.922 0.986

2.2 各組心功能指標對比

空白組LVEF與LVFS分別為（61.75±3.36）%與（44.79±2.68）%。對照組及治療1、2、3組LVEF、LVFS均低于空白組（P＜0.05）；治療1、2、3組LVEF、LVFS均高于對照組（P＜0.05）；治療1、2組LVEF、LVFS比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但治療1、2組LVEF、LVFS均低于治療3組（P＜0.05），見表2。

表2 各組心功能指標對比[%，（±s）]

表2 各組心功能指標對比[%，（±s）]

注：空白組LVEF與LVFS分別為（61.75±3.36）%與（44.79±2.68）%。*與同時點空白組對比，P＜0.05；#與同時點對照組對比，P＜0.05；△與同時點治療3組對比，P＜0.05。

組別 灌注 10 min 灌注 30 min 灌注 60 min LVEF LVFS LVEF LVFS LVEF LVFS對照組（n=10） 43.37±2.06* 25.58±1.69* 41.75±2.18* 24.07±1.65* 39.69±2.27* 23.95±1.71*治療 1 組（n=10） 46.65±1.88*#△ 28.69±1.75*#△ 49.21±1.75*# △ 31.58±1.88*# △ 53.31±2.12*#△ 33.65±1.81*#△治療 2 組（n=10） 46.79±1.85*#△ 28.75±1.79*#△ 49.63±1.81*# △ 31.69±1.82*# △ 53.88±2.15*#△ 33.83±1.79*#△治療3組（n=10） 49.26±1.69*# 31.46±2.07*# 53.36±2.07*# 35.46±2.12*# 57.89±2.46*# 40.76±2.07*#

2.3 各組氧化應激指標對比

對照組及治療1、2、3組SOD均低于空白組，MDA、ROS均高于空白組（P＜0.05）。治療 1、2、3組SOD均高于對照組（P＜0.05），MDA、ROS均低于對照組（P＜0.05）。治療1、2組 SOD、MDA、ROS比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但治療1、2組SOD均低于治療3組，MDA、ROS均高于治療3組（P＜0.05），見表3。

表3 各組氧化應激指標對比（±s）

表3 各組氧化應激指標對比（±s）

*與同時點空白組對比，P＜0.05；#與同時點對照組對比，P＜0.05；△與同時點治療3組對比，P＜0.05。

組別 SOD（U/mg） MDA（nmol/mg） ROS空白組（n=10） 88.63±3.75 3.92±0.58 44.38±3.07對照組（n=10） 36.85±1.69* 9.79±0.97* 75.66±4.25*治療 1 組（n=10） 65.57±3.62*#△ 5.42±1.01*#△ 58.63±5.42*#△治療 2 組（n=10） 65.88±3.56*#△ 5.33±0.97*#△ 57.99±5.38*#△治療 3組（n=10） 80.42±3.84*# 4.89±0.72*# 50.69±4.86*#

2.4 各組Wnt1、β-catenin表達水平對比

對照組及治療1、2、3組 Wnt1、β-catenin表達水平均高于空白組（P＜0.05）；治療1、2、3組Wnt1、β-catenin表達水平均低于對照組（P＜0.05）；治療1、2組Wnt1、β-catenin表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療1、2組Wnt1、β-catenin表達水平均高于治療3組（P＜0.05），見表 4。

表4 各組Wnt1、β-catenin表達水平對比（±s）

表4 各組Wnt1、β-catenin表達水平對比（±s）

*與同時點空白組對比，P＜0.05；#與同時點對照組對比，P＜0.05；△與同時點治療3組對比，P＜0.05。

組別 Wnt1 β-catenin空白組（n=10） 0.91±0.15 1.12±0.16對照組（n=10） 1.88±0.21* 1.68±0.19*治療 1 組（n=10） 1.29±0.18*#△ 1.47±0.21*#△治療 2 組（n=10） 1.33±0.19*#△ 1.47±0.19*#△治療3組（n=10） 1.17±0.16*# 1.29±0.18*#

3 討論

當發(fā)生心肌缺血再灌注損傷時，由于血運已經處于異常狀態(tài)，心肌細胞線粒體、血管內皮細胞中黃嘌呤氧化酶與中性粒細胞的呼吸爆發(fā)及兒茶酚胺氧化等途徑造成的大量自由基產生，導致生物膜的結構受到損傷，引起脂質過氧化的發(fā)生，大量的細胞內酶被釋放出，導致心肌細胞受損[7]。參附注射液與依達拉奉均對心肌缺血再灌注具有保護作用[8-9]，兩者聯合將可成為心肌缺血再灌注治療中的心肌保護治療新方案，以下將對兩者的作用效果及作用機制進行分析。

從此次的研究結果可知，隨著再灌注時間的延長，對照組LVEF、LVFS逐漸降低，而治療1、2、3組LVEF、LVFS逐漸升高。表明在再灌注前使用參附注射液和/或依達拉奉均能發(fā)揮保護心肌的作用，減少再灌注損傷的發(fā)生。但治療1、2組LVEF、LVFS無顯著差異，且兩組LVEF、LVFS均低于治療3組。表明參附注射液與依達拉奉聯合應用時比單獨用藥的效果更為顯著，可發(fā)揮更強的心肌保護作用，進而心功能得到更顯著的改善。氧化應激在心肌缺血引起的損傷過程中具有重要作用[10]。SOD、MDA、ROS是3項評估氧化應激反應的重要指標。SOD屬于一種抗氧化金屬酶，能夠對超氧陰離子自由基產生催化作用，進而歧化生成氧及過氧化氫，是平衡機體氧化與抗氧化過程的重要物質，當SOD水平降低時則反映出機體發(fā)生的氧化應激損傷[11]。ROS是化學反應活性自由基，由于其具有高度反應性，當其生成量過高時，將引發(fā)氧化應激，造成DNA損傷、蛋白質功能障礙等，進而導致細胞凋亡與壞死[12]。MDA是脂質過氧化物的終產物，其變化水平與ROS的變化水平呈正相關[13]。本次研究中，對照組與治療1、2、3組SOD均低于空白組，MDA、ROS均高于空白組。由此可看出相比于健康大鼠，心肌缺血大鼠存在明顯的氧化應激反應。治療1、2、3組SOD高于對照組，MDA、ROS均低于對照組。治療1、2組SOD、MDA、ROS無顯著差異，且該兩組的SOD均低于治療3組，MDA、ROS高于治療3組。表明參附注射液與依達拉奉均能夠減輕心肌缺血大鼠的氧化應激反應，且兩種藥物聯合應用時的減輕效果更為顯著。除了氧化應激反應以外，Wnt/β-catenin信號通路與也與心肌缺血再灌注損傷有關。據相關研究報道，在健康的心肌組織中，Wnt/β-catenin信號通路為失活狀態(tài)，在出現缺血現象的心肌組織或者發(fā)生梗死的心肌組織中，Wnt/β-catenin信號通路則表現為過度活化的狀態(tài)，該信號通路的活化可誘導心肌細胞發(fā)生凋亡，以及促進心室的重塑[14]。在本次研究中，對照組及治療1、2、3組Wnt1、β-catenin表達水平均高于空白組。證實了心肌缺血大鼠相比健康大鼠的心肌組織發(fā)生了明顯的Wnt/β-catenin信號通路活化。治療1、2、3組Wnt1、β-catenin表達水平低于對照組，治療1、2組Wnt1、β-catenin表達水平無顯著差異，且該兩組Wnt1、β-catenin表達水平均高于治療3組。表明在再灌注前使用參附注射液與依達拉奉能夠降低Wnt/β-catenin信號通路的活化狀態(tài)，進而減少其誘導的心肌細胞凋亡等現象發(fā)生，當兩種藥物聯合應用時可增大降低Wnt/β-catenin信號通路活化狀態(tài)的程度，進而發(fā)揮更顯著的保護效果。

綜上所述，參附注射液與依達拉奉均對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用，兩種藥物聯合應用的效果得以顯著增強，主要通過減輕氧化應激反應、調控Wnt/β-catenin通路相關蛋白發(fā)揮作用，進而改善心功能。