基于Postn介導(dǎo)的TGF-β/NF-κB通路探討綠原酸改善心肌肥大的作用及機(jī)制研究

盧 娜，金立民，苑 野*

(吉林大學(xué)大學(xué)第一醫(yī)院 1.小兒心血管科;2.麻醉科,吉林 長(zhǎng)春130021)

心肌肥大(CHT)是心力衰竭和心臟重塑等心臟病的病理表現(xiàn)之一，也是心律失常、心肌梗死和猝死原因之一[1-2]。探究心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制并找到有效干預(yù)手段對(duì)于防止心肌肥大具有重要意義。然而，心肌肥大發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今仍未完全闡明。骨膜蛋白(Postn)是心肌肥大的關(guān)鍵因子，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)Postn的水平與壓力超負(fù)荷引起的左心室肥厚密切相關(guān)，其在心臟重構(gòu)及心肌纖維化過(guò)程中起到了介質(zhì)的作用[3-4]。更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Postn能夠誘導(dǎo)整合素α3，α5，β3，β5激活TGF-β/NF-κB核因子信號(hào)通路釋放ANP、腦鈉肽(BNP)和β-MHC等肥大標(biāo)志物，進(jìn)而促進(jìn)心肌肥大[5]。綠原酸(CGA)是由咖啡酸與奎尼酸形成的縮酚酸，屬于苯丙素類化合物。CGA具有抗氧化清除自由基、抗炎、抗菌、抗病毒等生物活性[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，CGA在改善心肌肥大方面具有潛在的良好功效[8]。此外前期研究也發(fā)現(xiàn)CGA能夠顯著抑制Postn，然而，Postn介導(dǎo)的TGF-β通路是否參與CGA抑制心肌肥大少見報(bào)道[1-2]，鑒于此，本研究旨在借助心肌肥大細(xì)胞模型探究CGA通過(guò)Postn/TGF-β/NF-κB通路抑制心肌肥大的機(jī)制，為心肌肥大的有效治療和CGA的臨床應(yīng)用提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠心肌細(xì)胞系 H9c2(ATCC)，胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基(HyClone 公司)，Postn、α3、α5、β3、β5、TGF-β、NF-κB、ANP、BNP和β-MHC單克隆抗體(Abcam)，綠原酸、AngⅡ(美國(guó) Sigma 公司)，Lipofectamine 2000試劑盒(Thermo Fisher)，山羊抗兔二抗(上海碧云天)，CCK-8 細(xì)胞檢測(cè)試劑盒(上海碧云天)，Postn-siRNA(上海吉瑪生物有限公司)，引物(上海生工生物)，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(四正柏生物)，ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物)。倒置顯微鏡(日本尼康公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)。凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.2 方法

1.2.1心肌細(xì)胞肥大模型構(gòu)建 胰酶消化 H9c2 心肌細(xì)胞后接種于完全培養(yǎng)基，24 h 后換1%胎牛血清培養(yǎng)基同步化，采用1 μmol/L 濃度AngⅡ誘導(dǎo)48 h 后胰酶消化，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2分組及干預(yù)方法 將細(xì)胞分為：(1)對(duì)照組:DMEM 完全培養(yǎng)基作為安慰劑；(2)模型組：不做特殊處理；(3)Postn-siRNA組：采用Lipofectamine 2000試劑盒將Postn-siRNA轉(zhuǎn)染至模型細(xì)胞；(4)綠原酸組：培養(yǎng)基中加入綠原酸100 μmol /L；(5)Postn-siRNA+綠原酸組：綠原酸100 μmol /L+Postn-siRNA轉(zhuǎn)染。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1細(xì)胞表面積測(cè)定 各組細(xì)胞以1×104個(gè)/cm2密度種植于24孔板，置于Nikon倒置顯微鏡下采集圖像，隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野選取10個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用 Image-Pro Plus 圖像分析軟件檢測(cè)細(xì)胞表面積，取均值。

1.3.2CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力 于每孔中加入 10%CCK-8 溶液繼續(xù)培養(yǎng) 1.5 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm波長(zhǎng)下吸光度(OD450)。細(xì)胞存活率%=(處理組OD450/對(duì)照組OD450)×100%。

1.3.3Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) RIPA 裂解液裂解蛋白，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度，SDS-PAGE分離目的蛋白，隨后轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶1 000 稀釋后一抗(Postn、α3、α5、β3、β5、TGF-β、NF-κB、ANP、BNP和β-MHC)，4℃ 搖床孵育過(guò)夜，TBST 洗膜后加入HRP標(biāo)記二抗(1∶2 000)，室溫?fù)u床1 h，以GAPDH 為內(nèi)參，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量。

1.3.4RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 采用Triozol提取細(xì)胞總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定所抽提RNA的濃度和純度，按照說(shuō)明書進(jìn)行cDNA 合成。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。按以下體系進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng):2×qPCR Mix 10 μl，primer 各2 μl，cDNA 2 μl，50×Rox 0.4 μl，加ddH2O至20 μl。反應(yīng)程序:95℃ 10 s;60℃ 20 s;72℃15 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用相對(duì)定量 2-ΔΔCt計(jì)算 Postn、α3、α5、β3、β5、NF-κB、TGF-β1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，250 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，隨后加入5 μl Annexin V/FITC，室溫避光孵育5 min；再加入10 μl 20 μg/mL的PI溶液，最后加入400 μl PBS，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞表面積比較

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞表面積明顯增大(P<0.05)；與模型組比較，Postn-siRNA組和綠原酸組細(xì)胞表面積明顯減小(P<0.05) ，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Postn-siRNA組和綠原酸組相比，Postn-siRNA+綠原酸組表面積明顯減小(P<0.05) ，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) 。詳見圖1。

圖1 各組細(xì)胞表面積比較

2.2 各組細(xì)胞活力比較

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞活性明顯減少(P<0.05);與模型組比較，Postn-siRNA組和綠原酸組細(xì)胞活性明顯增加(P<0.05)，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Postn-siRNA組和綠原酸組相比，Postn-siRNA+綠原酸組活性明顯增加(P<0.05)，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2。

圖2 各組細(xì)胞活力比較

2.3 各組蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，模型組Postn、α3、α5、β3、β5、NF-κB、TGF-β1、ANP、BNP和β-MHC蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，Postn-siRNA組和綠原酸組細(xì)胞上述蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Postn-siRNA組和綠原酸組相比，Postn-siRNA+綠原酸組細(xì)胞上述蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖3。

圖3 各組蛋白表達(dá)比較

2.4 各組細(xì)胞mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，模型組Postn、α3、α5、β3、β5、NF-κB、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，Postn-siRNA組和綠原酸組細(xì)胞上述mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Postn-siRNA組和綠原酸組相比，Postn-siRNA+綠原酸組細(xì)胞上述mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖4。

圖4 各組細(xì)胞mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

2.5 各組細(xì)胞凋亡率比較

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，與模型組比較，Postn-siRNA組和綠原酸組細(xì)胞凋亡率明顯減小(P<0.05)，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與Postn-siRNA組和綠原酸組相比，Postn-siRNA+綠原酸組細(xì)胞凋亡率明顯減小(P<0.05)；與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) 。詳見圖5。

圖5 各組細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

心肌肥大是心臟對(duì)多種心血管刺激出現(xiàn)的一種失代償性反應(yīng)，未加干預(yù)可進(jìn)展為心力衰竭等多種疾病，甚至猝死，心肌肥大是心血管疾病發(fā)病率和死亡率增高的主要原因之一[9]。因此防治心肌肥大對(duì)改善預(yù)后具有重要臨床意義。

Postn是一種由四個(gè)Fasciclin結(jié)構(gòu)域組成的分子量為90 kDa的異功能分泌型細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，研究表明，Postn在調(diào)節(jié)長(zhǎng)期壓力超負(fù)荷刺激和心肌梗死后的心肌肥大、間質(zhì)纖維化和心室重構(gòu)方面起著至關(guān)重要的作用[10-11]。研究顯示，在心肌細(xì)胞中，細(xì)胞外基質(zhì)中的Postn可能會(huì)誘導(dǎo)TGF-β1的合成，激活TGF-β/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)心肌肥大。由此可見，Postn/TGF-β/NF-κB信號(hào)通路在心肌細(xì)胞肥大中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)Postn的活性對(duì)于防治心肌肥大具有較大潛力。CGA廣泛存在于植物中，以金銀花、杜仲中的含量較高，具有廣泛的藥理作用，如具有降低血壓、恢復(fù)血管彈性和保護(hù)心臟等多種作用[12]。綜合現(xiàn)有研究表明，CGA在心肌肥大的治療中無(wú)論單獨(dú)治療還是聯(lián)合其他藥物使用均表現(xiàn)出極大的潛質(zhì)，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CGA能夠顯著抑制Postn和TGF-β1的mRNA表達(dá)并抑制心肌肥大，且二者存在正相關(guān)性關(guān)系，但CGA對(duì)Postn和TGF-β1的抑制機(jī)制尚不清楚。AngⅡ是調(diào)節(jié)血壓和體液的重要激素，可通過(guò)升高血壓或直接刺激心肌成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，因此，本研究采用AngⅡ構(gòu)建心肌肥大細(xì)胞模型，通過(guò)加以CGA和(或)Postn干擾，觀察其對(duì)心肌細(xì)胞表面積，活力及凋亡的影響，同時(shí)觀察Postn/TGF-β/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白變化，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞表面積明顯下降，存活率明顯下降，凋亡率明顯增加，而分別給予CGA或Postn-siRNA后，上述指標(biāo)變化均得到明顯逆轉(zhuǎn)，提示CGA或Postn-siRNA可以增加心肌肥大細(xì)胞活力，抑制凋亡，而同時(shí)給予CGA和Postn-siRNA干預(yù)，上述指標(biāo)均與對(duì)照組無(wú)明顯差異，表明Postn通路參與CGA抑制的心肌肥大作用。為了進(jìn)一步研究CGA對(duì)Postn/TGF-β/NF-κB通路的作用，本研究分別采用Western blot和RT-PCR檢測(cè)此通路相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示，給予CGA或Postn-siRNA后Postn、α3、α5、β3、β5、NF-κB、TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)、ANP、BNP和β-MHC蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05)，表明CGA通過(guò)抑制Postn結(jié)合整合素α3、α5、β3、β5而抑制TGF-β/NF-κB核因子信號(hào)通路，從而減少釋放ANP、BNP和β-MHC，發(fā)揮抑制心肌肥大作用[4]。

綜上所述，綠原酸介導(dǎo)Postn/TGF-β/NF-κB通路調(diào)控細(xì)胞活性和凋亡，進(jìn)而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，在抑制心肌肥大進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。也為將Postn介導(dǎo)的TGF-β/NF-κB通路作為防治心肌肥大的分子靶點(diǎn)提供了新的科學(xué)依據(jù)，也進(jìn)一步了解綠原酸在心肌肥大中的防治機(jī)制。