長鏈非編碼RNA CASC9的靶基因預(yù)測及信號通路富集分析

袁曉霞，肖 楊，羅瑤敏，魏 晨，蔣振

（川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，四川 南充 637000）

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）為長度超過200 個(gè)nt的RNA 分子，其本身不編碼蛋白，但在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著調(diào)控作用[1-3]。研究表明[4-7]，lncRNA 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥及預(yù)后密切相關(guān)。癌癥易感候選基因9（cancer susceptibility candidate 9，CASC9）作為lncRNAs 家族的一員，被首次發(fā)現(xiàn)是在食管癌中的致癌作用，近年來被證實(shí)與越來越多的人類惡性腫瘤相關(guān)，其中大多數(shù)來源于鱗狀上皮組織[8，9]。但目前對于長鏈非編碼RNA CASC9的研究多為針對單獨(dú)的靶點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的實(shí)驗(yàn)研究，很少涉及對長鏈非編碼RNA CASC9 在細(xì)胞內(nèi)功能的整體研究，這使得對長鏈非編碼RNA CASC9的功能至今還不明確。為了全面闡明長鏈非編碼RNA CASC9在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控分子功能及生物學(xué)過程，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法，分析CASC9 在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控靶基因及信號通路，并對其進(jìn)行生物學(xué)功能注釋，探索CASC9 在細(xì)胞內(nèi)的功能作用和分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 lncRNA CASC9 靶基因預(yù)測 經(jīng)NCBI 基因數(shù)據(jù)庫查詢lncRNA CASC9的序列，經(jīng)miRDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.mirdb.org/）和Starbase3.0 數(shù)據(jù)庫（https://starbase.sysu.edu.cn/index.php）預(yù)測與CASC9 有miRNA-lncRNA 互作關(guān)系的miRNA，將miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miRNA 與Starbase3.0 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到的miRNA 取交集進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.2 miRNAs 靶基因預(yù)測 在Starbase3.0 數(shù)據(jù)庫中分別對miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測，選取預(yù)測程序個(gè)數(shù)為3，取預(yù)測到靶基因的評分排序前5 個(gè)，通過DAVI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因的GO 注釋和信號通路富集分析（Pathway）。

1.3 GO 注釋 從基因功能的3 個(gè)方面：細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物學(xué)過程（biological process，BP），得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的GO 注釋（P＜0.05），信號通路富集分析閾值取P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA CASC9 預(yù)測miRNA 在miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到50 個(gè)miRNA，Starbase 3.0 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到23個(gè)miRNA，取兩者交集共有16 個(gè)miRNA，其中有13 個(gè)是在Starbase3.0 數(shù)據(jù)庫預(yù)測程序數(shù)為3 時(shí)能預(yù)測到靶基因的miRNA，其miRNA 序列見表1。

表1 lncRNA-CASC9 預(yù)測的miRNAs

2.2 GO 注釋分析 將篩選出來的13 個(gè)miRNAs，通過分析其本身的序列及其在細(xì)胞內(nèi)的功能，根據(jù)其與長鏈非編碼RNA CASC9 結(jié)合能力進(jìn)行篩選，選取其中的結(jié)合能力強(qiáng)、評分較高的前5 個(gè)miRNA 并對其進(jìn)行靶基因預(yù)測。GO 功能注釋顯示：長鏈非編碼RNA CASC9 通過hsa-miR-383-5p 作用的靶基因主要調(diào)控金屬離子的結(jié)合信號通路，蛋白質(zhì)的泛素化降解過程；長鏈非編碼RNA CASC9 通過hsamiR-423-5p 作用的靶基因主要調(diào)控金屬離子的結(jié)合信號通路，蛋白質(zhì)的磷酸化過程；通過hsa-miR-3184-5p 作用的靶基因主要調(diào)控鎂離子的結(jié)合，Tau蛋白信號通路以及Wnt 信號通路；通過hsa-miR-146b-5 作用的靶基因主要調(diào)控金屬離子的結(jié)合信號通路，蛋白質(zhì)的磷酸化過程；通過hsa-miR-146a-5p 作用的靶基因主要調(diào)控蛋白激酶的結(jié)合信號通路以及蛋白質(zhì)的磷酸化過程，見圖1。

圖1 GO 注釋分析

圖1 GO 注釋分析(續(xù))

圖1 GO 注釋分析(續(xù))

2.3 信號通路富集分析 長鏈非編碼RNA CASC9通過hsa-miR-383-5p 作用的靶基因主要調(diào)控泛素化降解及MAPK 信號通路的作用過程；通過hsamiR-423-5p 作用的信號通路主要是RAS 信號通路及雌激素受體信號通路；通過hsa-miR-3184-5p作用的靶基因主要調(diào)控MAPK 信號通路，RAS 信號通路及雌激素受體信號通路；通過hsa-miR-146b-5 作用的信號通路包括自噬及粘附信號通路；通過hsa-miR-146a-5p 作用的靶基因主要調(diào)控蛋白質(zhì)的泛素化降解，p53 信號通路及細(xì)胞周期過程，見圖2。

圖2 富集通路分析

圖2 富集通路分析（續(xù)）

3 討論

健康細(xì)胞中的細(xì)胞增殖受到生長信號和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的嚴(yán)格調(diào)控，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。在與各種癌癥類型中細(xì)胞的不受控制的增殖相關(guān)的多種因素中，CASC9 通過不同的機(jī)制是癌細(xì)胞持續(xù)生長的必要因素。

CASC9 最先被發(fā)現(xiàn)是在食管癌中的致癌作用，后續(xù)研究證實(shí)越來越多的人類惡性腫瘤與CASC9相關(guān)，其中大多數(shù)來源于鱗狀上皮組織。CASC9 表達(dá)在多種惡性腫瘤中異常升高，其過表達(dá)可加速細(xì)胞增殖，癌細(xì)胞的遷移、細(xì)胞生長和耐藥性，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡[10-12]。此外，CASC9 與鱗狀上皮細(xì)胞的腫瘤性轉(zhuǎn)化和非鱗狀上皮組織中的鱗狀化生密切相關(guān)[13-15]。研究顯示，在食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）中CASC9 異常表達(dá)，其中功能分析揭示了CASC9 在促進(jìn)體外細(xì)胞增殖和體內(nèi)腫瘤生長中的作用[16，17]。研究發(fā)現(xiàn)[18-21]，CASC9的表達(dá)與癌癥進(jìn)展之間存在直接相關(guān)性，與對照細(xì)胞相比，CASC9的缺失降低了癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖和集落形成，而過表達(dá)則具有相反的作用。

本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析CASC9的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用miRDB、Starbase 等數(shù)據(jù)庫查詢與CASC9 相關(guān)的miRNAs 共16 個(gè)，再利用這些miRNA預(yù)測其作用的靶基因，進(jìn)一步對其進(jìn)行GO 功能注釋和Pathway 信號通路富集。結(jié)果顯示，與CASC9相關(guān)的miRNAs 分別是hsa-miR-383-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-3184-5p、hsa-miR-146b-5p、hsamiR-146a-5p、hsa-miR-874-3p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-488-3p。進(jìn)一步選取前5 個(gè)評分最高的miRNA 進(jìn)行功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa-miR-383-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-3184-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-146a-5p的靶基因主要分子功能分布在金屬離子結(jié)合、鎂離子結(jié)合等分子生物學(xué)功能，表明其生物學(xué)功能主要和細(xì)胞內(nèi)的金屬離子功能密切相關(guān)，其生物學(xué)過程主要分布在蛋白質(zhì)的磷酸化和信號通路上，表明它們的生物學(xué)功能主要與蛋白質(zhì)磷酸化和腫瘤信號通路相關(guān)。

在生物系統(tǒng)中，細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期受到各種檢查點(diǎn)、腫瘤抑制基因、癌基因和其他下游靶標(biāo)的緊密調(diào)控。在鼻咽癌（NPC）中，CASC9 與缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）相互作用，增強(qiáng)其穩(wěn)定性并進(jìn)一步促進(jìn)NPC的糖酵解，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[22]。另一方面，信號通路富集顯示，它們主要分布在泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解通路，Autophage 相關(guān)信號通路，MAPK信號通路，RAS 信號通路以及細(xì)胞內(nèi)的腫瘤信號通路，提示它們的功能主要與細(xì)胞內(nèi)腫瘤相關(guān)的代謝通路和信號通路相關(guān)。在ESCC 細(xì)胞中，CASC9 通過降低相關(guān)mRNA 水平下調(diào)程序性細(xì)胞死亡4（PDCD4）蛋白。對細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的研究已經(jīng)確定了PDCD4 和CASC9 之間的強(qiáng)相關(guān)性，其中PDCD4 部分恢復(fù)了由CASC9 敲除引起的G1/S 停滯。從機(jī)制上來看，敲低CASC9 降低了S 期細(xì)胞周期蛋白E2（CCNE2）和CDK6的表達(dá)，而抑制PDCD4 恢復(fù)表達(dá)[23]。另外，在肺腺癌（LAD）中還發(fā)現(xiàn)CASC9的上調(diào)通過細(xì)胞周期蛋白D1 調(diào)節(jié)G1期的細(xì)胞周期進(jìn)程[24]。體外試驗(yàn)證明[25]，CASC9的上調(diào)導(dǎo)致TU212 喉癌細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）基因的過度表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。CASC9 調(diào)節(jié)TGFβ2 mRNA的穩(wěn)定性，從而上調(diào)TGFβ 和TERT的表達(dá)水平，進(jìn)而導(dǎo)致對Decapentaplegic 同源物3的磷酸化增加。因此，與CPSF3 和TGFβ 相關(guān)的CASC9 有助于提高CRC 細(xì)胞的增殖[26]。

綜上所述，長鏈非編碼RNA CASC9 在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控作用與鎂離子結(jié)合、蛋白質(zhì)磷酸化調(diào)控、蛋白質(zhì)泛素化降解、自噬以及多種腫瘤發(fā)生信號通路密切相關(guān)，其可通過上述作用通路調(diào)控疾病的病理進(jìn)展。