CDKN2A 基因突變與腎細胞癌藥物敏感性和預(yù)后的關(guān)系

李松，李瑞杰，趙小磊

（1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院泌尿外科，河南 開封 475000；2.鄭州市第二人民醫(yī)院綜合科，河南 鄭州 450000）

腎透明細胞癌（kidney renal clear cell carcinoma）是泌尿系統(tǒng)腎細胞癌的一個獨特亞型，根治性切除是腎細胞癌的主要治療方法，其次是化療和靶向治療。然而，即使手術(shù)治療成功，仍有30%的患者可能出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移[1-3]。不同基因突變的患者可能對不同的藥物治療產(chǎn)生耐藥性，因此對不同基因突變的患者進行個體化治療更為重要[4]。因此，確定腎細胞癌進展和預(yù)后的潛在生物標志物和潛在相關(guān)分子機制是必要的，尋找潛在相關(guān)的靶向藥物對于個體化治療至關(guān)重要。Xu J等[5]研究證實，CDKN2A 啟動子甲基化發(fā)生在支氣管細胞癌變的早期。Hayashi T等[6]研究了胃癌患者的腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)CDKN2A的失活通常是由5'CpG 島的純合缺失和高甲基化引起的，這在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。Wang L等[7]發(fā)現(xiàn)，在77 例平滑肌肉瘤患者中，22%的患者存在CDKN2A 基因啟動子高甲基化，表明CDKN2A 啟動子高甲基化及其蛋白表達缺失與預(yù)后不良密切相關(guān)。然而，CDKN2A 在腎細胞癌中的作用尚不確定[8]。CDKN2A 突變狀態(tài)可能影響某些腎細胞癌患者的病情進展和治療。因此，探索CDKN2A 突變患者的一些相關(guān)信號通路將有助于進一步了解腎細胞癌進展的分子水平機制，并為患者的個體化治療策略提供指導(dǎo)。為了探索腎細胞癌預(yù)后和個體化治療反應(yīng)的機制，本研究對腎細胞癌的RNA 測序數(shù)據(jù)集以分析基因突變，研究泛癌和腎細胞癌中CDKN2A 突變的藥物敏感性。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從在線探索工具TCGA 數(shù)據(jù)庫下載（http://xena.ucsc.edu/）腎細胞癌基因表達譜（使用AgilentG4502A_07_3的腎細胞癌RNA 表達和突變基因）和臨床信息。采用開源網(wǎng)絡(luò)工具cBioPortal 分析Kaplan-Meier 圖和CDKN2A 突變（http://www.cbioportal.org/index.do）。BioPortal 數(shù)據(jù)庫（http：//www.cbioportal.org）整合了各種基因數(shù)據(jù)類型，包括TCGA、UCSC、GDAC 等，從cBioPortal 數(shù)據(jù)庫獲得600份腎細胞癌樣本，通過數(shù)據(jù)庫篩選選項，提取患者相關(guān)資料，篩選條件：①“Cancer Type：KIRC”；②“Gene：CDKN2A”；③“Data Type：mRNA”。應(yīng)用survival 選項分析600 份樣本中CDKN2A 突變情況與生存時間（總體生存和無疾病生存）關(guān)系圖，對3 種不同腎細胞癌研究中突變類型的mRNA 表達進行比較。

1.2 GDSC 數(shù)據(jù)庫分析 癌癥藥物敏感性基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（GDSC）（https://www.cancerrxgene.org/）是癌癥臨床研究中最常用的數(shù)據(jù)庫之一，收集了大量關(guān)于腫瘤細胞藥物敏感性的信息，進入數(shù)據(jù)庫所有藥物的界面，將“CDKN2A”數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)與化合物敏感性相關(guān)聯(lián)，查看泛癌和腎細胞癌中CDKN2A 突變在藥物的細胞系IC50圖，并繪制和生成與相應(yīng)藥物敏感性的火山圖和散點圖。

1.3 基因集富集分析 基因集富集分析（GSEA）用于評估按表型相關(guān)性排序的基因列表中預(yù)定義基因集中的基因分布，以確定它們對表型的作用（http://software.org/gsea/下載.jsp）。應(yīng)用分子特征數(shù)據(jù)庫（MSigDB），基于標稱P值和標準化富集分數(shù)（NES）分析路徑富集。根據(jù)CDKN2A 基因表達量分為兩組，通過GSEA4.1.0 分析CENPF 基因表達水平對各種生物通路基因集的影響，按照默認富集加權(quán)統(tǒng)計方法，選擇MSigDB 數(shù)據(jù)庫的基因集（c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt）作為參照基因集，置換次數(shù)為1000 次，計算基因富集得分（enrichment score，ES）。

1.4 差異基因（DEGs）的鑒定與富集分析 使用R軟件包在微陣列數(shù)據(jù)中選擇-Log10（Pvalue）＞2 且∣Log2（fold change）∣＜1的DEGs。由DAVID（http://david.ncifcrf.gov）對DEGs 進行KEGG 途徑和GO 富集分析，其中FDR＜0.05，-LogFDR＞1.302的前幾個通路被認為是顯著的。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Wilcoxon 試驗比較突變型和野生型之間的CDKN2A mRNA 表達水平；采用Kaplan-Meier 法和Log rank 檢驗，通過Graphpad 計算不同CDKN2A 組之間的臨床結(jié)果；edgeR 和GSEA中的FDR 分別采用Benjamini-Hochberg 程序進行多次試驗調(diào)整，以控制FDR。P＜0.05 被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎細胞癌中的CDKN2A 表達及突變 600 例腎細胞癌樣本中有5.00%的CDKN2A 突變病例，其余為野生型（圖1A）。CDKN2A 在腎細胞癌中的突變類型包括亞基突變、錯義突變、截斷突變和跨越整個基因的深度缺失（圖1B）。其中，3.00%為深度缺失，2.00%為錯義突變、截斷突變和inframe 突變（圖2A）。CDKN2A 突變類型為深度缺失的mRNA 表達低于野生型（圖2B）；與突變型相比，野生型的CDKN2A 表達較高（圖2C）；CDKN2A 在腎細胞癌中的表達高于正常腎組織。

圖1 腎細胞癌中CDKN2A的突變

圖2 腎細胞癌中CDKN2A的突變表達

2.2 CDKN2A 基因突變對腎細胞癌患者預(yù)后和藥物敏感性的影響 腎細胞癌患者的臨床特征見表1，生存分析顯示，具有CDKN2A 突變的腎細胞癌患者總體生存率和無病生存率較差（圖3），在泛癌和腎細胞癌中，CDKN2A 突變型可能比野生型增加對Tenovin-6 等藥物的耐藥性，并且Tenovin-6 對各種癌癥和腎細胞癌中的野生型具有選擇性（圖4）。

圖3 CDKN2A 基因突變對腎細胞癌患者預(yù)后的影響

圖4 CDKN2A 基因突變對腎細胞癌患者藥物敏感性的影響

表1 腎細胞癌患者的臨床特征

2.3 基于GSEA的CDKN2A 突變信號通路分析GSEA 分析顯示，CDKN2A 突變信號通路主要富集在Wnt-catenin 信號、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、緊密連接、TGF-β 信號、磷脂酰肌醇信號、erbb 信號和粘附連接（圖5）。2.4 DEGs的鑒定和富集分析 共有350 個基因被鑒定為DEGs，包括170 個下調(diào)基因和180 個上調(diào)基因。DEGs的火山圖見圖6A。使用DAVID 對DEGs進行富集分析，GO 分析結(jié)果表明，DEGs 主要富集于RNA 聚合酶Ⅱ啟動子、轉(zhuǎn)錄、細胞核、細胞質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物和序列特異性DNA 結(jié)合的轉(zhuǎn)錄負調(diào)控，見圖6B。KEGG 通路分析顯示，DEGs 主要富集于細胞周期、癌癥、慢性髓系白血病、癌癥中的microRNA 和p53 信號通路，見圖6C。

圖5 腎細胞癌CDKN2A 突變的GSEA 富集分析

圖6 DEGs的鑒定和富集分析

3 討論

CDKN2A 基因位于染色體9p21 上，受調(diào)控的CDKN2A 蛋白包含156 個氨基酸，在細胞周期中調(diào)節(jié)細胞增殖并抑制腫瘤的產(chǎn)生，該基因的失活可導(dǎo)致細胞分離控制和惡性進展為腫瘤[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)，該基因在許多腫瘤中丟失或發(fā)生突變。CDKN2A基因失活的機制包括啟動子甲基化、純合缺失和點突變，平均頻率分別為33%、22%和15%；另外，研究還發(fā)現(xiàn)9p21 區(qū)域雜合性缺失與腫瘤發(fā)生有關(guān)[10]。

CDKN2A 在各種腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化中突變類型包括純合缺失（HD）、雜合性缺失（LOH）、p16INK4a/p14ARF 基因啟動子的突變和異常甲基化[11]。Ibrahim I等[12]研究了肺癌、卵巢癌和頭頸部鱗狀細胞癌的89 個細胞系中246 個位點的純合缺失，發(fā)現(xiàn)CDKN2A 基因的純合缺失最常見（26%），且與疾病預(yù)后的關(guān)系不同。本研究發(fā)現(xiàn)，腎細胞中約5.00%的患者攜帶CDKN2A 突變，包括亞基突變、錯義突變、截斷突變和跨越整個基因的深度缺失，其中3.00%為深度缺失，2.00%為錯義突變、截斷突變和近端突變。Thompson ED等[13]發(fā)現(xiàn)，CDKN2A的總突變率為93.3%，啟動子異常甲基化占46.7%，純合缺失占36.7%，突變占13.3%。

Ibrahim IS等[14]發(fā)現(xiàn)，CDKN2A 啟動子甲基化與直腸癌患者的復(fù)發(fā)和預(yù)后相關(guān)，表明CDKN2A 啟動子甲基化可作為預(yù)測直腸癌預(yù)后的指標。Potjer TP等[15]發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者的腫瘤組織中存在一種特殊的CDKN2A 突變，表明CDKN2A 突變可能被用作胰腺癌的標志物。本研究顯示，CDKN2A 突變的腎細胞癌患者總體生存率和無病生存率較差，這表明CDKN2A 突變可能有助于腎細胞癌的進展。除此之外，降低CDKN2A 表達水平已被證明可增加腫瘤細胞對化療或放療的耐受性[16]。因此，CDKN2A 可以作為新的抗癌治療策略的靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，CDKN2A 突變對Tenovin-6 等藥物的敏感性較低，這表明Tenovin-6 突變在治療上的預(yù)后較差，并且在各種癌癥和腎細胞癌中，Tenovin-6 對野生型具有顯著的選擇性。隨著組蛋白去乙酰化酶（HDAC）的發(fā)展，HDAC 抑制劑（HDACi）已成為抗腫瘤藥物的研究熱點[17]。Tenovin-6 是近年來開發(fā)的一種HDACi，是脫乙酰酶SIRT1的抑制劑，選擇性地抑制Ⅲ類HDACs 中最常見的SIRT1 和SIRT2，并激活P53，具有更大的臨床應(yīng)用價值。Tenovin-6 可以抑制腫瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡和周期阻滯[18]。這些研究為腎細胞癌患者個體化應(yīng)用特異性抗腫瘤藥物提供了額外證據(jù)，并為進一步研究提供了基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，腎細胞癌患者CDKN2A 突變信號通路主要富集Wnt-catenin 信號、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、緊密連接、TGF-β 信號、磷脂酰肌醇信號、erbb信號和粘附連接。已有研究證實[12]，CDKN2A 基因的負調(diào)控途徑是RB1 途徑。CDKN2A 蛋白包含四個連續(xù)的錨蛋白重復(fù)序列，它們與CDK4 和CDK6 結(jié)合，而CDK4 和CDK6 是一種雙周期依賴性蛋白激酶，作用于CDK4-6的非催化側(cè)，可抑制CDK 和細胞周期蛋白D1 復(fù)合物的催化活性[19]。CDKN2A 突變可能通過影響多種途徑促進腎細胞癌的進展，CDKN2A突變患者的腫瘤可能更容易進展和遠處轉(zhuǎn)移[20]。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，GO 分析中差異基因主要富集在RNA 聚合酶Ⅱ啟動子、轉(zhuǎn)錄的負調(diào)控中。

綜上所述，多個基因和通路途徑可能在CDKN2A 突變中起關(guān)鍵作用。本研究確定了與腎細胞癌中CDKN2A 突變相關(guān)的主要途徑，這可能通過制定腎細胞癌特定CDKN2A 突變亞型的治療策略來改善腎細胞癌的預(yù)后。另外，腎細胞癌中CDKN2A突變的機制和驗證仍需在臨床和分子生物學(xué)實驗中進一步研究。