基于生物信息學(xué)探討miRNA調(diào)控骨質(zhì)疏松性椎體骨折的分子機(jī)制

張逢樂，楊輝

（廣州市荔灣區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州510000）

骨質(zhì)疏松性椎體骨折被認(rèn)為是老年人群面臨的一個重大健康問題。骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致的骨折幾乎占所有骨折病例的一半，對健康相關(guān)的生活質(zhì)量有很大影響[1]。然而，這一估計可能低估了它們的真實患病率，考慮到只有四分之一的人得到了臨床關(guān)注，要么是由于缺乏放射學(xué)關(guān)注，要么是因為缺乏公認(rèn)的經(jīng)典癥狀[2]，以及他們的診斷不足[3]。令人擔(dān)憂的是，在最初的椎體骨折持續(xù)后，繼發(fā)性椎體骨折的比例高得驚人。據(jù)報道，在第一次脊椎骨折后的第一年，再次獲得脊椎骨折的風(fēng)險高達(dá)20%[4]。相關(guān)研究表明，首次骨折后繼發(fā)椎體骨折的風(fēng)險高達(dá)4-7倍，隨著先前椎體骨折的數(shù)量的增加呈正相關(guān)性增加[5-6]。

位于美國馬里蘭州貝塞斯達(dá)國立衛(wèi)生研究院的校園內(nèi)的GEO數(shù)據(jù)庫存儲了高通量測序等基因組數(shù)據(jù)，其由NCBⅠ建立和維護(hù)。近幾十年來，基因組水平的基因突變篩選廣泛借助微陣列技術(shù)和生物信息學(xué)分析，這有助于幫助我們識別與椎體骨折發(fā)生發(fā)展相關(guān)的差異表達(dá)基因和功能通路[7-8]。因此，本研究從GEO數(shù)據(jù)庫下載骨質(zhì)疏松性椎體骨折miRNA微陣列數(shù)據(jù)集，并對其進(jìn)行分析，以獲得骨質(zhì)疏松性椎體骨折和健康人群之間的差異表達(dá)miRNA；通過GO富集、KEGG富集和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，探討骨質(zhì)疏松性椎體骨折發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 基因芯片信息NCBⅠ-GEO被視為一個免費的基因芯片/基因圖譜公共數(shù)據(jù)庫，我們從中獲得了健康人群和骨質(zhì)疏松性椎體骨折的miRNAs表達(dá)譜GSE93883，其包括6例健康患者血漿樣本（GSM2464440、GSM2464441、GSM2464442、GSM2464443、GSM2464444、GSM2464445）和6例椎體骨折患者血漿樣本（GSM2464452、GSM2464453、GSM2464454、GSM2464455、GSM2464456、GSM2464457）。

1.2 miRNA-mRNA調(diào) 控 網(wǎng) 絡(luò) 構(gòu) 建TargetScan[9]、miRDB[10]兩個在線數(shù)據(jù)庫被應(yīng)用于差異miRNA靶基因的預(yù)測，其交集的預(yù)測基因作為差異miRNA的靶基因。為了構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，我們借助cytoscape 3.7.0軟 件[11]，miRNA和mRNA作為節(jié)點，miRNA和mRNA的相互關(guān)系為連線，類三角形代表3個差異最明顯的miRNA，橢圓形代表靶基因。

1.3 PPⅠ網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和集簇模塊分析PPⅠ網(wǎng)絡(luò)信息通過在線工具STRⅠNG（檢索相互作用基因的檢索工具）進(jìn)行分析[12]，篩選條件medium confidence＞0.9，然后應(yīng)用Cytoscape v3.7.0軟件構(gòu)建差異表達(dá)基因的PPⅠ網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape軟件是一款開源生物信息學(xué)軟件，可以對分子相互作用網(wǎng)絡(luò)可視化。集簇模塊分析借助MCODE插件完成[13]。其篩選條件為：Degree CUTOFF:2，Node Score Cutoff:0.2，Max Depth:100，K-Core:2。

1.4 GO和KEGG分析 基因本體論分析（GO）是定義基因及其RNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的常用方法，以確定基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的生物學(xué)特性。KEGG是一組處理生物途徑、疾病、藥物和化學(xué)物質(zhì)的數(shù)據(jù)庫集合。為了分析靶基因的作用機(jī)制，本研究使用R軟件、clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2包進(jìn)行生物學(xué)分析和可視化。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSE93883芯片集處理利用R軟件對GSE93883芯片集進(jìn)行熱圖可視化（圖1），差異表達(dá)的miRNA包 括hsa-miR-205-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-4666a-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-4775、hsa-miR-4508、hsamiR-1273a、hsa-miR-1253、hsa-miR-4459、hsa-miR-1273f、hsa-miR-665、hsa-miR-4739、hsa-miR-4505、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-4522等。

圖1 GSE93883富集熱圖

2.2 DEmiRNA-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 對于預(yù)測的靶基因，本研究把Degree大于5作為進(jìn)一步篩選的條件。通過本地軟件Cytoscape對miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化（圖2）。

圖2 miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

hsa-miR-205-5p的 靶 基 因 有YES1、YAP1、ⅤTⅠ1B、ⅤEGFA、TNRC6B、THBS1、TGFA、TAOK1、STON2、SORBS1、SMAD4、SMAD1、SⅠAH1、SH3GL3、SALL4、RPS6KA3、RNF4、RARA、RAP2B、RAB9B、RAB14、QKⅠ、PTPRJ、PTEN、PSMA4、PRKCE、PRKCA、PPP3R1、PLCB1、PJA2、PⅠCALM、PHC2、PAFAH1B1、NSF、NOTCH2、NECAP1、MPRⅠP、MGRN1、MGAT4A、MED13L、MED1、MDM4、LRP6、LPAR1、LAMC1、KMT2A、ⅠNSR、HERC3、H2AFJ、GCC2、GATA3、FBXO22、EZR、EREG、ERBB4、ERBB3、E2F1、DDX5、CSF1、CREB1、CNⅠH1、CLTC、CENPO、CENPF、CDK19、CDC27、CALU、AXⅠN2、ACTB、AAK1。

hsa-miR-660-5p的 靶 基 因 有YWHAH、YES1、UBE2H、TRⅠM71、TRAF6、STX16、SMARCA5、SKP1、SGⅠP1、SEC22C、SDC1、SAA1、RHOH、RAB33B、RAB11A、PPARGC1A、NR3C1、NCOR1、MEX3C、MED8、MDM2、LAMC2、KLHL11、KⅠF3A、KBTBD8、ⅠTGA1、ⅠRS1、HⅠP1、HⅠF1A、GOSR2、GORASP1、ETS1、EPAS1、DNAJC3、CUL5、COG6、CEP63、CENPM、CD47、ASB5、APP、APLP2、ANAPC5、AGO1。

hsa-miR-155-5p的靶基因有YWHAZ、YWHAE、XⅠAP、ⅤAⅤ3、TSPAN14、TRⅠM32、TLE4、TCF7L2、TAB2、SUFU、SPⅠ1、SOCS6、SOCS5、SOCS1、SMARCA4、SMAD2、SMAD1、SGⅠP1、SCG2、S1PR1、RPS6KB1、RPS6KA3、RNF123、RGP1、REPS2、RELA、RAP1B、RAB5C、RAB3B、QKⅠ、PTPRJ、PⅠCALM、PⅠAS1、NRG3、MAP3K7、KSR1、KRAS、KⅠF3A、HⅠF1A、HERC4、GRⅠP1、GATA3、FXR1、FOS、FBXO30、FBXO22、FBXO11、ETS1、E2F2、DYNC1Ⅰ1、DET1、DCUN1D3、CSF1R、COPS3、CNⅠH1、CKAP5、CHD9、CEBPB、CBL、BPⅠFB2、BDNF、ARRB2、APC、AGO4、ADAM10、ACⅤR1、ACTA1、AAK1。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPⅠ本研究借助String數(shù)據(jù)庫對靶基因完成蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析（PPⅠ），接著利用Cytoscape3.7.0軟件對蛋白網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化（圖3）。該網(wǎng)絡(luò)含有371個節(jié)點，1175條邊。

圖3 PPⅠ網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 重要基因的集簇模塊 通過MCODE插件對PPⅠ網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，我們得出靶基因的集簇模塊（圖4）。集簇模塊1得分23.00，包含23個節(jié)點，253條邊；集簇模塊2得分9.52，包含26個節(jié)點，119條邊；集簇模塊3得分6.00，包含18個節(jié)點，51條邊；集簇模塊4得分5.89，包含19個節(jié)點，53條邊（表1）。通過集簇模塊得出重要的靶基因為：KLHL11、SⅠAH1、FBXO11、FBXO22、HERC4、HERC3、UBE2H、DET1、MGRN1、RNF4、CUL5、CDC27、ANAPC5、SKP1、FBXO30、KBTBD8、ASB5、PJA2、MEX3C、TRⅠM71、TRⅠM32、SOCS1、RNF123。

圖4 排名前4的集簇模塊

表1 集簇模塊所含的靶基因

2.5 GO富集分析和KEGG富集分析GO富集分析顯示，差異表達(dá)miRNA通過靶基因作用于椎體骨折的分子機(jī)制包括以下，其中生物過程為：翻譯后的蛋白質(zhì)修飾、髓系細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)造血作用、積極調(diào)節(jié)分解代謝過程、有絲分裂細(xì)胞周期相變的調(diào)控、類固醇激素反應(yīng)、肌肉組織發(fā)展、細(xì)胞周期相變的調(diào)節(jié)等；細(xì)胞成分為：轉(zhuǎn)錄因子復(fù)雜、核染色質(zhì)、有被小泡、谷氨酸的突觸、運輸囊泡、突觸前、RNA聚合酶ⅠⅠ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、主軸等；分子功能為：泛素樣蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、生長因子受體結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶活性、核激素受體結(jié)合、激素受體結(jié)合等；Pathway信號通路為：PⅠ3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路、人類乳頭瘤病毒感染、小分子核糖核酸在癌癥、蛋白聚糖在癌癥、人類t細(xì)胞白血病病毒1感染等（表2、表3和圖5）。

圖5 GO和KEGG pathway富集分析

表2 GO富集分析結(jié)果

表3 KEGG pathway富集分析結(jié)果

3 討論

microRNA（miRNA）是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)骨細(xì)胞中的多種細(xì)胞過程。由于最佳的miRNA靶向功能對其功能至關(guān)重要，因此miRNA（miRSNPs）或mRNA（PolymiRTS）基因座內(nèi)或附近的單核苷酸多態(tài)性（SNP）可能會破壞miRNA-mRNA的相互作用，從而導(dǎo)致骨骼代謝改變和骨質(zhì)疏松癥。最近的人類使用miRNA分析進(jìn)行的骨骼特征研究，全基因組關(guān)聯(lián)研究和功能研究開始破譯復(fù)雜的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些研究表明，miRNA可能是有前途的骨標(biāo)志物[14]。它們通過與目標(biāo)mRNA（mRNA）分子堿基配對而獲得生物活性，從而在3'非翻譯區(qū)引導(dǎo)蛋白質(zhì)復(fù)合物（稱為RⅠSC）。RⅠSC與mRNA序列的結(jié)合會導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制[15]。本研究得出重要的miRNA分別為miR-205-5p、miR-660-5p、miR-155-5p。Roland Kocijan等通過多元分析證實miR-155-5p可作為骨質(zhì)疏松癥脆性骨折的miRNA生物標(biāo)志物[16]。研究證明骨質(zhì)疏松癥樣品中miR-205-5p上調(diào)，RUNX2的過表達(dá)可顯著減弱miR-205-5p對成骨細(xì)胞標(biāo)志物的作用，表明miR-205-5p可能通過靶向RUNX2抑制成骨細(xì)胞分化[17]。其中hsa-miR-205-5p的靶基因有YES1、YAP1、ⅤTⅠ1B、ⅤEGFA、TNRC6B等，hsa-miR-660-5p的靶基因有YWHAH、YES1、UBE2H、TRⅠM71、TRAF6等，hsa-miR-155-5p的 靶 基 因 有YWHAZ、YWHAE、XⅠAP、ⅤAⅤ3、TSPAN14等。本研究得出的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可以成為后續(xù)研究的對象，為闡明骨質(zhì)疏松性椎體骨折后續(xù)更深入的研究提供依據(jù)。

GO富集分析與KEGG pathway富集分析有助于更深入地認(rèn)識并識別出miRNA靶向基因的功能和機(jī)制。本研究篩選出骨質(zhì)疏松性椎體骨折的重要信號通路包括PⅠ3K-Akt信號通路、Ras信號通路和MAPK信號通路等。其中PⅠ3K-Akt通路與骨質(zhì)疏松性椎體骨折有著密切的聯(lián)系，PⅠ3K/AKT信號的激活轉(zhuǎn)導(dǎo)上調(diào)成骨細(xì)胞分化標(biāo)記基因的表達(dá)，包括BMP-2和ALP，從而促進(jìn)OB的增殖、分化[18]。OB中PⅠ3K/Akt信 號 通 路 的 特 異 性 抑 制 劑LY294002可以阻斷PⅠ3K的激活，從而抑制OB增殖、鈣積累、ALP活性，還能抑制OCN，Osterix和Runx2 mRNA的表達(dá)[19]。PⅠ3K/Akt信號通路通過促進(jìn)OB增殖、分化和骨形成從而參與OP的抑制。Rap1是調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞粘附，細(xì)胞-基質(zhì)粘附和肌動蛋白重排的小型GTPase，在細(xì)胞擴(kuò)散和內(nèi)皮屏障功能過程中保持動態(tài)協(xié)調(diào)[21]。Rap1/MAPK信號通路可促進(jìn)OB增殖分化并抑制其凋亡[21]。鍶可以通過激活Ras/MAPK信號通路和下游轉(zhuǎn)錄因子Runx2促進(jìn)MSC的成骨分化[22]。成骨前細(xì)胞的ECM礦化和BMP-2誘導(dǎo)的多能間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過MAPK信號傳導(dǎo)途徑的微調(diào)來控制。此外，MEK-1抑制劑可用于促進(jìn)骨形成，延遲骨折愈合的治療或骨折愈合后局部骨質(zhì)疏松改變的進(jìn)展[23]。

miRNA對其靶基因調(diào)控的研究在miRNA研究中尤為重要。本研究最終篩選出重要的靶基因包括SKP1、CBL、ANAPC5、FBXO30、KBTBD8、ASB5、SOCS1、KLHL11、FBXO11、FBXO22。SCF泛 素 連 接 酶 由Skp1，Cdc53，Hrt1和F-box蛋 白（FBP）組成[24]。磷酸化的β-連環(huán)蛋白被Skp1/Cul1/F-box（SCF）復(fù)合物識別，并被泛素化以被蛋白酶體降解[25]。CbL是銜接蛋白和E3連接酶，在影響各種細(xì)胞功能的幾種信號傳導(dǎo)途徑中起正負(fù)作用。廢除Cbl-PⅠ3K相互作用可增加骨形成和成骨細(xì)胞增殖[26]。AnapC5是ⅠL-17信號通路的新型銜接子和負(fù)調(diào)節(jié)劑，AnapC5沉默增強(qiáng)了ⅠL-17誘導(dǎo)的基因表達(dá)[27]。F-box蛋白與各種生物學(xué)過程相關(guān)，例如胚胎發(fā)育，成年骨形成和腫瘤發(fā)生[28]。miR-155通過SAPK/JNK途徑靶向SOCS1，從而調(diào)節(jié)TNF-α調(diào)控的成骨分化[29]。研究表明miR-433-3p是長鏈非編碼RNA SNHG14的直接靶標(biāo)，并且直接靶向僅F-box蛋 白22（FBXO22）。敲 低FBXO22和SNHG14以及miR-433-3p的過度表達(dá)均能顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，但誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miR-433-3p抑制劑減弱了SNHG14抑制對骨肉瘤細(xì)胞增殖，侵襲和遷移的抑制作用。SNHG14通過充當(dāng)miR-433-3p的ceRNA來調(diào)節(jié)FBXO22的表達(dá)來促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展，表明SNHG14可能成為治療骨肉瘤的潛在靶點[30]。

目前miRNA在骨折的研究較少[31]。本研究通過篩選骨質(zhì)疏松性椎體骨折差異miRNA及其調(diào)控的靶基因深入研究，將有助于探索骨質(zhì)疏松性椎體骨折的診斷和治療提供新的研究思路，并為骨質(zhì)疏松性椎體骨折治療藥物的研發(fā)提供較為可靠的信號通路和作用靶點。然而，本研究尚存在一些不足之處，仍需要結(jié)合大量臨床樣本并進(jìn)行相關(guān)的基礎(chǔ)實驗進(jìn)一步驗證，方能完全明確這些差異miRNA和靶基因在骨質(zhì)疏松性椎體骨折中的具體作用機(jī)制。