MicroRNA-744 調(diào)控PRKACA 和FGF2 對(duì)皮膚燒傷愈后瘢痕形成的影響

燒傷（burn）是導(dǎo)致皮膚損傷的主要原因之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)

，全世界每年有近30 萬(wàn)人死于燒傷。在嚴(yán)重?zé)齻^(guò)程中，細(xì)胞和血管均受到損傷，分子代謝出現(xiàn)異常調(diào)控，進(jìn)一步導(dǎo)致各種非編碼RNA 和細(xì)胞因子等分子調(diào)控出現(xiàn)紊亂

。有研究表明

，微小RNA（microRNA）參與了皮膚燒傷后的分子調(diào)控代謝過(guò)程，其中microRNA-744 在皮膚燒傷具有重要調(diào)控作用。蛋白激酶cAMP 激活催化亞基α（PRKACA）是參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要分子之一

。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）是組織穩(wěn)態(tài)和癌癥中的關(guān)鍵有絲分裂原，F(xiàn)GF2 在皮膚燒傷愈后的分子機(jī)制中也具有重要作用

。本研究主要探討microRNA-744 調(diào)控PRKACA 和FGF2 對(duì)皮膚燒傷愈后疤痕形成的影響和分子間的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和動(dòng)物 30 只健康新西蘭大白兔由騰新生物技術(shù)有限公司提供（許可證號(hào)：SCX2021-0004），體重2.0～2.5 kg，雌雄各半。清潔級(jí)動(dòng)物室適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，在制備燒傷動(dòng)物模型前24 h 禁食不禁水，實(shí)驗(yàn)方案獲佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。microRNA 提取分離試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；cDNA 第一鏈合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；qRT-PCR 檢測(cè)試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；microRNA 檢測(cè)引物U6（北京天根生化科技有限公司）；microRNA檢測(cè)引物miR-744（天根生化科技有限公司）；RNase-Free 雙蒸水（北京天根生化科技有限公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）、瓊脂糖凝膠電泳儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)、反轉(zhuǎn)錄PCR（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）、-80 ℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Scientific 公司）、蛋白凝膠成像儀（美國(guó)Wealtec 公司）、超凈工作臺(tái)（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）、4 ℃低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）等。

1.3 方法

1.3.1 燒傷模型和組織樣本收集 提前24 h 由耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉，麻醉后行頸內(nèi)靜脈和頸動(dòng)脈穿刺置管備用，將兔背部涂抹10%硫代鈉脫毛，燒傷面積為總體表面積的30%。體表面積公式：A（m

）=R×W2/3，A 為體表面積（m

），W 為體重（kg），經(jīng)計(jì)算燒傷面積約為514 cm

。根據(jù)燒傷時(shí)間和常用燒傷動(dòng)物模型制作方法進(jìn)行分組，分別為對(duì)照組、燒傷組、愈后組，每組10 例。組織樣本離體后迅速冷凍至液氮中，直至MicroRNA 提取。

1.3.4 ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRKACA 和FGF2 每孔加入100 μl 標(biāo)準(zhǔn)品、空白樣品或樣品；棄掉每個(gè)孔的液體，然后不要洗，向每孔加入100 μl 檢測(cè)試劑A 工作溶液；用微量加樣槍吸出每個(gè)孔并洗滌，重復(fù)3次，總共洗滌3 次；每孔加入100 μl Detection Reagent B 作溶液，蓋上一個(gè)新的密封板，在37 ℃孵育1 h；重復(fù)抽吸/洗滌5 次；每孔加入90 μl 底物溶液，蓋上新的Plate 密封劑，在37 ℃下孵育15～30 min，避光；每孔加入50 μl 終止液，如果顏色變化不均勻，輕輕敲打板確保充分混合；確定每個(gè)孔的光密度到450 nm，使用酶標(biāo)儀一次測(cè)定；根據(jù)酶標(biāo)儀的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

從圖1可以看出，一對(duì)一類(lèi)型占有對(duì)應(yīng)要素的一半以上，由此可見(jiàn)在共同表達(dá)的要素中，大部分要素是存在映射關(guān)系的，這也是軍民基礎(chǔ)地理信息分類(lèi)代碼標(biāo)準(zhǔn)融合的一個(gè)基礎(chǔ)。

2.2 各組PRKACA 和FGF2 表達(dá)量比較 燒傷組和愈后組PRKACA 表達(dá)水平低于對(duì)照組，且愈后組低于燒傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05）；燒傷組和愈后組FGF2 表達(dá)水平高于對(duì)照組，且愈后組高于燒傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05），見(jiàn)表1。

1.3.2 血液樣本收集 用不含抗凝劑的試管釆集外周靜脈血0.5 ml，室溫下3000 r/min 離心15 min，去除血細(xì)胞，收集上層血清，然后將收集血清在4 ℃，3000 r/min 離心15 min，進(jìn)一步除去殘留血細(xì)胞；小心吸取上層血清至新的離心管，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1 各組microRNA-744 表達(dá)比較 燒傷組和愈后組microRNA-744表達(dá)量分別為（6.901±1.031）、（7.583±1.067），均高于對(duì)照組的（4.671±1.012），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05）。

1.3.5 Western Blot 檢測(cè)組織PRKACA 和FGF2 蛋白表達(dá) 組織加入裂解液，4 ℃裂解1 h 后，12 000 g，4 ℃離心30 min，取上清，放于-80 ℃冰箱中，每次電泳之前進(jìn)行蛋白測(cè)定，使用蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，然后進(jìn)行一抗、二抗反應(yīng)，最后再進(jìn)行顯色反應(yīng)和凝膠圖象分析。

2 結(jié)果

針對(duì)不同的需求可以選擇各種優(yōu)化方法。余剛珍[1]、何雨松[2]結(jié)合ANSYS結(jié)構(gòu)拓?fù)鋬?yōu)化技術(shù)，優(yōu)化了各自零件性能并將零件減重；劉基岡[3]等人基于有限元進(jìn)行了液壓機(jī)的結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計(jì)，優(yōu)化結(jié)果設(shè)計(jì)的液壓機(jī)結(jié)構(gòu)最大應(yīng)力減小23%,剛強(qiáng)度性能滿足設(shè)計(jì)要求；詹威[4]、張東生[5]、潘鋒[6]等結(jié)合模態(tài)分析對(duì)各自零件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，最大限度地減輕了共振頻率對(duì)產(chǎn)品運(yùn)行的影響。由于連桿架本身尺寸不大，而且其端面上存在支撐板，拓?fù)鋬?yōu)化已不適用，因此選取尺寸參數(shù)優(yōu)化。通過(guò)簡(jiǎn)化建模，結(jié)合有限元采用參數(shù)化分析，選用 Screening篩選優(yōu)化方法，最終得到3種優(yōu)選方案，結(jié)合模態(tài)分析得到最終方案。

1.3.3 qRT-PCR 檢測(cè)MicroRNA-744 表達(dá) 首先進(jìn)行樣本microRNA 提取分離，合成microRNA cDNA第一鏈，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)cDNA（圖1），然后再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，反轉(zhuǎn)錄程序包括：①RNA加尾反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42 ℃，60 min；②酶失活反應(yīng)95 ℃，3 min。microRNA 熒光定量檢測(cè)：按實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量計(jì)算各試劑總量，分裝到反應(yīng)管中，然后加入引物和microRNA cDNA，再加入樣本的cDNA，混勻，離心，設(shè)置反應(yīng)程序，進(jìn)行檢測(cè)，然后觀察結(jié)果。樣本microRNA 使用核酸定量?jī)x測(cè)定RNA 濃度和純度，光密度A260/A280 均在1.8～2.0 間表明RNA無(wú)降解。microRNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA 后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。運(yùn)用qRT-PCR 檢測(cè)各組樣本時(shí)，如果溶解曲線分析未見(jiàn)雜峰，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，表明沒(méi)有非特異性擴(kuò)增。用U6 為內(nèi)參，反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算Ct值。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到microRNA-744 和U6的Ct值，通過(guò)公式計(jì)算ΔCt（ΔCt=CtmicroRNA-744-CtU6），運(yùn)用2

法對(duì)各組樣本microRNA的表達(dá)水平。

式中，sinφ和cosφ分別對(duì)應(yīng)LP11a模和LP11b模；r、φ分別為模場(chǎng)軸向和角向坐標(biāo)，ξ可表示為

2.3 各組PRKACA 和FGF2 蛋白表達(dá)量比較 燒傷組和愈后組PRKACA 蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，且愈后組低于燒傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05）；燒傷組和愈后組FGF2 蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，且愈后組高于燒傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05），見(jiàn)圖2、圖3、表2。

2.4 MicroRNA -744 和 PRKACA、FGF2的關(guān)系Pearson 相關(guān)性分析顯示，microRNA-744 和PRKACA 呈負(fù)相關(guān)（

=-0.821，

＜0.05），與FGF2 呈正相關(guān)（

=0.773，

＜0.05）。

“我們下一步正在推進(jìn)寬帶鄉(xiāng)村、高清瀘州的工程建設(shè)，推進(jìn)5G商用和IPV6（互聯(lián)網(wǎng)協(xié)議第6版 ）規(guī)模部署，建設(shè)高速、移動(dòng)、安全、泛在的信息基礎(chǔ)設(shè)施。同時(shí)瀘州市還要深度拓展智慧應(yīng)用，實(shí)施‘互聯(lián)網(wǎng)+’行動(dòng)計(jì)劃，推動(dòng)公益互聯(lián)網(wǎng)平臺(tái)建設(shè)，持續(xù)開(kāi)展‘萬(wàn)企上云’的活動(dòng)?！眲⒋罕硎?。

3 討論

MicroRNA 是參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控非常重要的非編碼RNA，且其可間接影響相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)

。目前，已經(jīng)有很多研究表明

，microRNA 與燒傷的分子調(diào)控機(jī)制密切相關(guān)，大多數(shù)microRNA 有抑制相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的作用，但是microRNA-744 在皮膚燒傷愈后瘢痕形成中的具體分子機(jī)制仍尚未明確。

FGF2 是一種多功能蛋白，在傷口愈合、組織修復(fù)和再生中具有重要作用。這種治療性蛋白質(zhì)廣泛用于燒傷治療，因?yàn)槠淇纱碳ぜ?xì)胞增殖和分化、血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)重塑

。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，燒傷組和愈后組microRNA-744 表達(dá)量高于對(duì)照組（

＜0.05）；燒傷組和愈后組PRKACA 表達(dá)水平及蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，且愈后組低于燒傷組（

＜0.05）；燒傷組和愈后組FGF2 表達(dá)水平及蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，且愈后組高于燒傷組（

＜0.05）；Pearson 相關(guān)性分析顯示，microRNA-744 和PRKACA 呈負(fù)相關(guān)（

＜0.05），與FGF2 呈正相關(guān)（

＜0.05），提示microRNA-744 表達(dá)可以通過(guò)抑制PRKACA 間接促進(jìn)FGF2的表達(dá)，且在燒傷及愈后的發(fā)生發(fā)展中，microRNA-744的先降低和再升高導(dǎo)致PRKACA、FGF2 表達(dá)量發(fā)生改變，因此在燒傷及愈后發(fā)生發(fā)展中，microRNA-744 可以調(diào)控PRKACA、FGF2 表達(dá)，進(jìn)而可以作為預(yù)測(cè)燒傷輕重程度及愈后發(fā)展的分子指標(biāo)。

EPDM彩色顆粒塑膠地面是在按要求鋪設(shè)好的石油瀝青路面基層上，涂刷一層單組份聚氨酯膠水，當(dāng)聚氨酯底涂料逐步滲入瀝青基礎(chǔ)的表面空隙后，即可在表面形成密封狀的薄膜，從而起到防水作用，也使基礎(chǔ)和塑膠面層的粘合力得到增強(qiáng)。

綜上所述，microRNA-744 通過(guò)影響PRKACA和FGF2 含量變化，從而從分子水平實(shí)現(xiàn)影響調(diào)控?zé)齻坝蟀l(fā)生發(fā)展的作用。

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