miRNA-mRNA 雙重表達(dá)譜在前列腺癌分子調(diào)控機(jī)制中的作用

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常見(jiàn)的癌癥之一，也是西方男性癌癥死亡的第2 大原因。有資料顯示

，我國(guó)70 歲以上人群前列腺癌的發(fā)生率高達(dá)25%。早期前列腺癌不易被發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)前列腺癌患者初診時(shí)已經(jīng)發(fā)生癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，失去治愈的機(jī)會(huì)。在過(guò)去的幾十年中，雖然前列腺癌的診斷技術(shù)已經(jīng)得到了顯著提高，而且前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）也被認(rèn)為有助于提高前列腺癌的診斷率，但當(dāng)前也有很多研究認(rèn)為應(yīng)用PSA 診斷前列腺癌并不完全成功。有研究表明，相比PSA，堿性磷酸酶（ALP）在評(píng)估治療反應(yīng)上的準(zhǔn)確性更高

。miRNA（microRNA）是由18～25 個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

。研究認(rèn)為

，體液中miRNA 表達(dá)差異與前列腺癌患者的預(yù)后相關(guān)，可能成為評(píng)估前列腺癌患者預(yù)后的分子標(biāo)記物。本文通過(guò)對(duì)前列腺癌的mRNA 和miRNA的雙重表達(dá)譜的生物信息學(xué)分析，探討miRNA 和mRNA 在前列腺癌中的分子調(diào)控機(jī)制并構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 前列腺癌的miRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)及差異表達(dá)分析通過(guò)GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取前列腺癌的miRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)平臺(tái)為GSE8126，該數(shù)據(jù)中包括60 個(gè)前列腺癌組織樣本和15 個(gè)正常前列腺組織樣本。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的預(yù)處理（中心化，對(duì)數(shù)變換和標(biāo)準(zhǔn)化），獲得326 個(gè)miRNA的表達(dá)值。采用matlab 生物信息工具箱中的

檢驗(yàn)篩選差異表達(dá)的miRNA，定義差異表達(dá)的miRNA為：

＜0.05 且FDR＜0.01，其中Fold_change＞1.5 認(rèn)為該miRNA 是上調(diào)的，F(xiàn)old_change ＜1/1.5 認(rèn)為該miRNA 是下調(diào)的。

上一秒還好得跟一個(gè)人似的，下一秒就掐起來(lái)，是田朵和小寧的常態(tài)。田朵和小寧都是獨(dú)生子，在家里被寵慣了，雖然兩個(gè)人結(jié)婚快兩年了，可是他們的脾氣一點(diǎn)也沒(méi)收斂，經(jīng)常為雞毛蒜皮的小事吵架，吵急了的時(shí)候，還會(huì)把離婚掛在嘴邊。

1.2 前列腺癌的mRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)及差異表達(dá)分析通過(guò)GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取前列腺癌的mRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)平臺(tái)為GSE6956，該數(shù)據(jù)中包括60 個(gè)前列腺癌組織樣本和15 個(gè)正常前列腺組織樣本。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的預(yù)處理（中心化，對(duì)數(shù)變換和標(biāo)準(zhǔn)化），獲得13 787 個(gè)mRNA的表達(dá)值。差異表達(dá)mRNA的篩選標(biāo)準(zhǔn)為

＜0.05且FDR＜0.01；其中Fold_change＞1.5 認(rèn)為該mRNA是上調(diào)的，F(xiàn)old_change＜1/1.5 認(rèn)為該mRNA 是下調(diào)的。

1.3.2 基于廣義典則相關(guān)分析的miRNA-mRNA 調(diào)控 采用改進(jìn)的廣義典則相關(guān)分析篩選出所有上調(diào)和下調(diào)的miRNA 和mRNA，探討miRNA 和mRNA的調(diào)控關(guān)系并構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。提取前10 個(gè)miRNA和前20 個(gè)mRNA 作為前列腺癌的特征生物標(biāo)記，采用R 軟件的mixOmics 軟件包（http://r-project.org）進(jìn)行分析。

2.3 miRNA 和mRNA的調(diào)控關(guān)系

2.1 miRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)的差異表達(dá)分析 共發(fā)現(xiàn)117 個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中有15 個(gè)差異表達(dá)的miRNA 是下調(diào)的，如miR-521 和miR-527 等；有20個(gè)差異表達(dá)的miRNA 是上調(diào)的，如miR-511 和miR-526a 等。將上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行雙向?qū)哟尉垲悾?jiàn)圖1。

1.3.1 基于Pearson 相關(guān)的miRNA-mRNA 反向調(diào)控從MicroCosm Targets 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/）下載篩選出的 Fold_change 最大的上調(diào)的 miRNA 和Fold_change 最小的下調(diào)的miRNA的靶基因，計(jì)算它們與靶基因的Person 相關(guān)系數(shù)并分析這兩個(gè)miRNA 和它們的靶基因的反向調(diào)控關(guān)系。

1.3.3 miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 基于廣義典則相關(guān)分析，確定典則相關(guān)系數(shù)的cutoff 值并根據(jù)cutoff值，保留獲得的miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系，根據(jù)該調(diào)控關(guān)系構(gòu)建相應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的miRNA 如果調(diào)控的mRNA的數(shù)目較多，稱為該miRNA 具有較高的度，為網(wǎng)絡(luò)中的hub miRNA，認(rèn)為其是與前列腺癌相關(guān)的重要生物標(biāo)記。

2 結(jié)果

經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)收斂性是指在封閉的經(jīng)濟(jì)條件下，對(duì)于一個(gè)有效經(jīng)濟(jì)范圍的不同經(jīng)濟(jì)單位，初期的靜態(tài)指標(biāo)和其經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)速度之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，即落后地區(qū)比發(fā)達(dá)地區(qū)有更高的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)率 （劉強(qiáng)，2001）［21］。將其應(yīng)用于能源領(lǐng)域，β收斂是指某地區(qū)能源強(qiáng)度的增長(zhǎng)速度與其能源強(qiáng)度的初始水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，分為絕對(duì)收斂和條件收斂?jī)煞N。絕對(duì)β收斂是假設(shè)不同地區(qū)具有相同的外部條件，如經(jīng)濟(jì)發(fā)展程度、技術(shù)水平、產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)等，隨著時(shí)間的推移，所有地區(qū)的能源強(qiáng)度都將收斂于相同水平；條件β收斂是將外界因素納入到模型中，探討外界因素對(duì)能源強(qiáng)度收斂的影響。因而，本文通過(guò)建立條件β收斂的模型來(lái)探討產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)移對(duì)能源強(qiáng)度收斂的影響。

2.3.2 基于廣義典則相關(guān)的miRNA-mRNA 調(diào)控 對(duì)于提取出的全部差異表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)的miRNAmRNA 雙重表達(dá)譜數(shù)據(jù)集采用改進(jìn)的廣義典則相關(guān)分析，結(jié)果顯示，該法可以有效區(qū)分前列腺癌樣本和正常人群樣本，見(jiàn)圖3。根據(jù)第一主成分的權(quán)系數(shù)，提取出與前列腺癌相關(guān)度最高的前10 個(gè)miRNA 和前20 個(gè)mRNA，見(jiàn)圖4A、圖4B。在這些提取的miRNA 和mRNA 中，有些miRNA 和mRNA 被已有報(bào)道證實(shí)是與前列腺癌相關(guān)的，如發(fā)現(xiàn)MED13L的第一主成分權(quán)系數(shù)在前列腺癌患者中最高。有研究發(fā)現(xiàn)MED 家族的基因，如MED12的體細(xì)胞突變會(huì)導(dǎo)致前列腺癌的發(fā)生

。對(duì)于miRNA，其中miR-29b和miR-29b-1*的第一主成分權(quán)系數(shù)在正常人群中最高。此外，miR-488*的第一主成分權(quán)系數(shù)在前列腺癌患者中最高。按照典則相關(guān)系數(shù)的cutoff 為0.9的標(biāo)準(zhǔn)，保留了所有典則相關(guān)系數(shù)大于0.9的miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系，繪制miRNA 和mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，其中miR-29b 和miR-29b-1*是網(wǎng)絡(luò)中度最高的兩個(gè)結(jié)點(diǎn)（度=21），這兩個(gè)miRNAs 在網(wǎng)絡(luò)中調(diào)控的基因數(shù)最多，見(jiàn)圖5。

1.3 miRNA 和mRNA的調(diào)控關(guān)系

納入標(biāo)準(zhǔn)：既往未行脊柱融合術(shù)；全脊柱X線片冠狀面上Cobb角＞ 80°且bending位上柔韌度＜ 30%，或矢狀面上Cobb角＞ 70°；自愿接受本研究治療方案且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有頸椎不穩(wěn)、寰樞椎脫位等不能耐受牽引的患者；嚴(yán)重藥物依賴性疾病、心理疾病、嚴(yán)重脊柱外傷或脊髓損傷、心肺功能嚴(yán)重障礙等不能耐受治療的患者；其他不適合因素。

2.3.1 基于Pearson 相關(guān)的miRNA-mRNA 反向調(diào)控Fold_change 最小的下調(diào)miRNA 為miR-137，在MicroCosm Targets 數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了其對(duì)應(yīng)的1991個(gè)靶向基因，其中上調(diào)的基因?yàn)镠OXC4、NPIPL3 和WSB1。miR-137 和HOXC4的相關(guān)系數(shù)為

=-0.5566，

=2.15E-07；miR-137 和NPIPL3的相關(guān)系數(shù)為

=-0.7366，

=4.98E-04；miR-137 和WSB1的相關(guān)系數(shù)為

=-0.7959，

=1.44E-17；miR-137 和這3 個(gè)基因呈反向調(diào)控關(guān)系。Fold_change 最大的上調(diào)miRNA為miR-367，在MicroCosm Targets 數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)其對(duì)應(yīng)的2045 個(gè)靶向基因，其中下調(diào)的基因分別為MEFA 和TNFAIP6。miR-367 和MEFA的相關(guān)系數(shù)為

=-0.7840，P=8.99E-17，miR-367 和TNFAIP6的相關(guān)系數(shù)為

=-0.7627，

=1.85E-15；miR-367 和MEFA 及TNFAIP6 呈反向調(diào)控關(guān)系。

2.2 mRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)的差異表達(dá)分析 共識(shí)別出9054 個(gè)差異表達(dá)的mRNA，其中有35 個(gè)差異表達(dá)的mRNA 是下調(diào)的，有36 個(gè)差異表達(dá)的mRNA 是上調(diào)的。雙向?qū)哟尉垲惤Y(jié)果見(jiàn)圖2，mRNA 表達(dá)譜能夠很好的區(qū)分不同組織起源的樣本。

3 討論

前列腺癌是男性生殖系最常見(jiàn)的惡性腫瘤，研究表明分子調(diào)控機(jī)制在前列腺癌的預(yù)后和診斷中有著非常重要的作用。本研究對(duì)前列腺癌的mRNA 和miRNA的雙重表達(dá)譜進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，采用了差異表達(dá)分析提取了與前列腺癌相關(guān)的上調(diào)和下調(diào)的miRNA 和mRNA，并通過(guò)Pearson 相關(guān)分析和廣義典則相關(guān)分析探討了miRNA 和mRNA的分子調(diào)控機(jī)制。廣義典則相關(guān)分析可用于特征降維，特征融合和相關(guān)分析等。將廣義典則相關(guān)分析應(yīng)用于特征miRNA 和mRNA的提取，其中特別結(jié)合了miRNA 和mRNA的靶向失調(diào)關(guān)系作為預(yù)設(shè)矩陣，并根據(jù)miRNA 或mRNA 在第一個(gè)成分的權(quán)系數(shù)提取與前列腺癌相關(guān)的特征miRNA 和特征mRNA。

本病案對(duì)患者進(jìn)行了綜合性治療，尤其對(duì)基礎(chǔ)病進(jìn)行有效干預(yù)，患者加用胰島素治療，使血糖維持在相對(duì)正常的水平，提高了機(jī)體抗感染能力，為我們后續(xù)治療提供了保障。

除了對(duì)病毒分離培養(yǎng)與鑒定方法之外，還可以采用免疫電鏡法，這種檢測(cè)方法擁有簡(jiǎn)便、直觀、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但是由于檢測(cè)過(guò)程中需要使用價(jià)格昂貴的電鏡設(shè)備，所以診斷費(fèi)用比較高。此種方法不適合進(jìn)行大規(guī)模的診斷。免疫電鏡法就是可以通過(guò)電鏡能夠清晰的觀察到病毒結(jié)構(gòu)、形態(tài)以及立體結(jié)構(gòu)等特征，然后可以對(duì)疾病作出判斷。將患病仔豬的小腸或者病毒細(xì)胞培養(yǎng)物用固定液進(jìn)行固定，然后用機(jī)器切成超薄的切片，在電鏡下進(jìn)行觀察病毒的結(jié)構(gòu)、形態(tài)。這種方法能夠有效區(qū)別豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒，因?yàn)槊庖唠婄R法不僅可以用已知的豬流行性腹瀉病毒高免血清檢測(cè)未知抗體，而且還能夠借助已知的豬流行性腹瀉病毒抗原檢測(cè)未知抗體[3]。

本研究發(fā)現(xiàn)，MED 家族基因MED13L的第一主成分權(quán)系數(shù)在前列腺癌患者中最高。有研究發(fā)現(xiàn)，在局限性前列腺癌患者的異質(zhì)性腫瘤病灶中檢測(cè)到體細(xì)胞腫瘤變異，發(fā)現(xiàn)cfDNA 突變負(fù)荷與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。在cfDNA 中發(fā)現(xiàn)了體細(xì)胞組織的改變，其中就包括MED 家族中MED12的非同義變異

。此外，TRRAP 是本次識(shí)別的與前列腺癌高度相關(guān)的基因。TRRAP 曾在陰莖鱗狀細(xì)胞癌

和卵巢癌中檢測(cè)到突變

。在通過(guò)外顯子測(cè)序及Sanger 測(cè)序探索66 個(gè)家族中140 例患有前列腺癌的日本患者的生殖系變異研究中，除了已知的易感基因BRCA2 和HOXB13 外，還發(fā)現(xiàn)了TRRAP 變體以及BRCA2、HOXB13 和TRRAP的共同變體

。

了解癌癥中miRNA的調(diào)控機(jī)制對(duì)于理解其生理作用以及癌癥相關(guān)功能障礙和失調(diào)的影響至關(guān)重要

。近年來(lái)的研究表明，miRNAs的異常表達(dá)與前列腺癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。雖然已經(jīng)報(bào)道了許多miRNAs 可作為前列腺癌治療的新生物標(biāo)記物，但報(bào)告的數(shù)據(jù)不一致，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)

。因此，研究前列腺癌相關(guān)的miRNA 及其調(diào)控的靶向基因?qū)τ谧R(shí)別前列腺癌相關(guān)的生物標(biāo)記及這些生物標(biāo)記在前列腺癌的臨床應(yīng)用有著十分重要的價(jià)值。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-29b 與前列腺癌高度關(guān)聯(lián)，并在miRNA-mRNA 分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中調(diào)控的基因數(shù)最多。目前，已有文獻(xiàn)證實(shí)miR-29b 可以阻止前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展。Zhu C等

發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者腫瘤組織中miR-29b的表達(dá)明顯低于癌旁組織，有望成為前列腺癌診斷的新生物標(biāo)志物。Ivanovic RF等

研究認(rèn)為，恢復(fù)miR-29b 水平的治療可能是控制前列腺癌轉(zhuǎn)移的有效方案。Sur S等

在瘤內(nèi)注射模擬miR-29b，顯著抑制了裸鼠前列腺癌異種移植瘤的生長(zhǎng)，表明miR-29b 可以作為前列腺癌治療的潛在分子，為未來(lái)開發(fā)前列腺癌的藥物靶向提供幫助。Vladimir AV等

在年輕男性前列腺癌患者的分子特征研究中發(fā)現(xiàn)，miR-29b的表達(dá)與老年男性前列腺癌患者顯著不同，這項(xiàng)研究為前列腺癌亞型的分子機(jī)制提供了參考。Kato M等

的研究表明，miR-29b 與其他五種miRNA 協(xié)同調(diào)節(jié)促進(jìn)轉(zhuǎn)移的基因（LOXL2），揭示了前列腺癌發(fā)病機(jī)制的新分子機(jī)制。此外，miR-488 是本研究中發(fā)現(xiàn)的與前列腺癌相關(guān)度最高的前10 個(gè)miRNA。miR-488 在多種腫瘤中作為抑癌基因發(fā)揮作用，如乳腺癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌等

。Wang J等

研究發(fā)現(xiàn)，miR-488 在前列腺癌患者腫瘤組織中的表達(dá)低于正常組織，其通過(guò)靶向PFKFB3 可以抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和糖酵解，因此可能會(huì)作為潛在的前列腺癌新的治療靶點(diǎn)。本研究也存在一定的局限性。如數(shù)據(jù)庫(kù)中的前列腺癌相關(guān)的miRNA-mRNA 雙重表達(dá)譜數(shù)據(jù)集相對(duì)很少，因此不能保證分析結(jié)果的穩(wěn)定性；此外，本研究結(jié)果是基于miRNA-mRNA 雙重表達(dá)譜數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，識(shí)別出的特征miRNA 和mRNA 還需要應(yīng)用分子生物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，MED 家族基因MED13L的第一主成分權(quán)系數(shù)在前列腺癌患者中最高，TRRAP 是與前列腺癌高度相關(guān)的基因；miR-29b 與前列腺癌高度關(guān)聯(lián)，并在miRNA-mRNA 分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中調(diào)控的基因數(shù)最多，而miR-488 是與前列腺癌相關(guān)度最高的前10 個(gè)miRNA。

[1] 羅于杰,藍(lán)建華,黃國(guó)華.miR-29a 過(guò)表達(dá)對(duì)人前列腺癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制研究[J].中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2021,24(1):15-20.

[2] Wenter V,Herlemann A,Fendler WP,et al.Radium-223 for primary bone metastases in patients with hormone-sensitive prostate cancer after radical prostatectomy[J].Oncotarget,2017,8(27):2021-2026.

[3] Khan S,Ayub H,Khan T,et al.MicroRNA biogenesis,gene silencing mechanisms and role in breast,ovarian and prostate cancer[J].Biochimie,2019,167:12-24.

[4] McDonald AC,Vira M,Walter V,et al.Circulating microRNAs in plasma among men with low-grade and high-grade prostate cancer at prostate biopsy [J].Prostate,2019,79 (9):961-968.

[5] K?mpj?rvi K,Kim NH,Keskitalo S,et al.Somatic MED12 mutations in prostate cancer and uterine leiomyomas promote tumorigenesis through distinct mechanisms[J].The Prostate,2016,76(1):22-31.

[6] Chen E,Cario CL,Leong L,et al.Cell-Free DNA Detection of Tumor Mutations in Heterogeneous,Localized Prostate Cancer Via Targeted,Multiregion Sequencing [J].JCO precision oncology,2021,5:PO.20.00428.

[7] Wang Y,Wang K,Chen Y,et al.Mutational landscape of penile squamous cell carcinoma in a Chinese population[J].International Journal of Cancer,2019,145(5):1280-1289.

[8] Kang KT,Kwon YW,Kim DK,et al.TRRAP stimulates the tumorigenic potential of ovarian cancer stem cells [J].BMB Reports,2018,51(10):514-519.

[9] Takahide H,Hiroshi M,Hirofumi N,et al.Germline Variants of Prostate Cancer in Japanese Families [J].PLoS One,2017,11(10):e0164233.

[10] Zainab AS,Siu SS,Choijamts M,et al.Regulatory Mechanism of MicroRNA Expression in Cancer [J].International Journal of Molecular Sciences,2020,21(5):1273.

[11] Sharma N,Baruah MM.The microRNA signatures: aberrantly expressed miRNAs in prostate cancer [J].Clin Transl Oncol,2019,21(2):126-144.

[12] Zhu C,Hou X,Zhu J,et al.Expression of miR -30c and miR-29b in prostate cancer and its diagnostic significance[J].Oncology Letters,2018,16(3):3140-3144.

[13] Ivanovic RF,Viana NI,Morais DR,et al.miR-29b enhances prostate cancer cell invasion independently of MMP-2 expression[J].Cancer Cell International,2018,18(1):18.

[14] Sur S,Steele R,Shi X,et al.miRNA-29b Inhibits Prostate Tumor Growth and Induces Apoptosis by Increasing Bim Expression[J].Cells,2019,8(11):455.

[15] Vladimir AV,Rafael P,Beatriz AW,et al.microRNA Expression Profiling in Young Prostate Cancer Patients [J].Journal of Cancer,2020,11(14):4106-4114

[16] Kato M,Kurozumi A,Goto Y,et al.Regulation of metastasispromoting LOXL2 gene expression by antitumor microRNAs in prostate cancer [J].Journal of Human Genetics,2017,62(1):123-132.

[17] Masuda T,Shinden Y,Noda M,et al.Circulating Pre-microRNA-488 in Peripheral Blood Is a Potential Biomarker for Predicting Recurrence in Breast Cancer [J].Anticancer Res,2018,38(8):4515-4523.

[18] Guo JY,Wang XQ,Sun LF.MicroRNA-488 inhibits ovarian cancer cell metastasis through regulating CCNG1 and p53 expression[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2020,24(6):2902-2910.

[19] Deng X,Li D,Ke X,et al.Mir-488 alleviates chemoresistance and glycolysis of colorectal cancer by targeting PFKFB3[J].J Clin Lab Anal,2021,35(1):e23578.

[20] Wang J,Li X,Xiao Z,et al.MicroRNA-488 inhibits proliferation and glycolysis in human prostate cancer cells by regulating PFKFB3[J].FEBS Open Bio,2019,9(10):1798-1807.