基于生物信息學(xué)方法探究潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵基因和通路

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以結(jié)直腸黏膜連續(xù)性、彌漫性炎癥表現(xiàn)為特點(diǎn)的慢性非特異性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床很難根治。UC 主要癥狀為腹痛、腹瀉、黏液膿血便等，癥狀輕重不等，但多為反復(fù)發(fā)作的慢性病程，嚴(yán)重影響患者的心理、經(jīng)濟(jì)狀況和生活質(zhì)量

。目前UC 以藥物治療為主，常用藥物有氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等，但這些藥物存在一定的不良反應(yīng)，患者依從性低，治療效果也不理想

。因此，尋求新的藥物治療靶點(diǎn)，開發(fā)新的高效、低毒的UC 治療藥物成為研究熱點(diǎn)。近年來，隨著高通量測序平臺及研究方法在疾病基因表達(dá)分析的應(yīng)用，各種疾病的相關(guān)機(jī)制逐漸從基因和分子層面被闡明

。本研究采用基于Affymetrix 芯片平臺的GSE42911 數(shù)據(jù)集，探究潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的發(fā)病機(jī)制，為其早期診斷和治療藥物的開發(fā)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)獲取 以“Ulcerative Colitis”為關(guān)鍵詞，在Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫中檢索與UC 相關(guān)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)。選擇GSE42911 芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，該研究是基于GPL15207 平臺（affymetrix human gene expression array）的芯片，由Kellermayer R 提交。由10 個樣本構(gòu)成，分別為GSM1053271、GSM1053272、GSM1053273、GSM1053274、GSM1053277、GSM1053268、GSM1053269、GSM1053270、GSM1053275、GSM1053276。其中，前5 個樣本來自5 例潰瘍性結(jié)腸炎患者，后5 個樣本來自5 名正常人。

1.2 篩選差異基因 GEO2R 是GEO 數(shù)據(jù)庫中以R語言為基礎(chǔ)的交互式在線分析工具，借助R 語言及Limma 包對GEO 樣品數(shù)據(jù)行基因差異表達(dá)分析

。本研究利用該工具篩選UC 患者和正常人大腸組織的差異基因（DEGs）。以基因倍數(shù)改變（fold change，F(xiàn)C）大于1.5，即|logFC|＞1.5 作為DEGs的篩選標(biāo)準(zhǔn)，以

＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，除去重復(fù)和無效基因，得到本芯片的DEGs

。采用R 語言繪制DEGs的熱圖和火山圖。

1.3 核心DEGs 篩選與生物學(xué)過程及信號通路分析將DEGs 導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)：combined score＞0.4，將分析數(shù)據(jù)以TSV 格式導(dǎo)出，再導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1 軟件中，然后使用軟件的NetworkAnalyzer 進(jìn)行分析。在網(wǎng)絡(luò)中，度值（Degree）表示某一節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)連接邊的數(shù)量

；中介中心度（betweenness centrality，BC）表示一個節(jié)點(diǎn)擔(dān)任其它兩個結(jié)點(diǎn)之間最短路的橋梁的次數(shù)。BC 值越大，表示節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中的樞紐程度越重要

。目前，網(wǎng)絡(luò)分析的主要方法是選擇節(jié)點(diǎn)Degree 值及BC 值高的作為網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)

。本研究也采用該分析方法，篩選BC＞0.01，Degree＞30的作為UC的核心DEGs。對大規(guī)?；蜻M(jìn)行功能注釋，包括基因功能富集分析（GO 基因本體論）和基因通路富集分析（KEGG）。GO 分析包括分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular components，CC）和生物學(xué)過程（biological process，BP）

。接著將核心DEGs 導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，并限定物種為人，進(jìn)行基因功能注釋分析和功能富集分析，然后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，對生物過程（

＜0.01）和信號通路（

＜0.05）進(jìn)行篩選，用R 語言對GO 和KEGG 富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將得到的核心DEGs 導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫繪制蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（protein-protein interaction，PPI），將分析數(shù)據(jù)以TSV 格式導(dǎo)出，導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1 軟件，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，并對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析；再利用“Generate style from statistics”工具對網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的大小和顏色進(jìn)行設(shè)置。網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)的大小、顏色及其深淺變化代表Degree 值的大小，邊的粗細(xì)反映了Combine Score的大小，從中篩選出Degree 值和接近中心度排名靠前的靶點(diǎn)。

形聲字是現(xiàn)代漢字的主體，其中形符的表義功能，有助于留學(xué)生理解漢字的含義；聲符的示音功能，利于留學(xué)生了解讀音。對外漢語教師運(yùn)用形聲字的這些優(yōu)勢進(jìn)行教學(xué)，不僅可以減輕學(xué)生們的負(fù)擔(dān)，而且能夠增強(qiáng)他們的信心，激發(fā)他們學(xué)習(xí)漢字的熱情。

2 結(jié)果

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 將核心DEGs 上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫，PPI 網(wǎng)絡(luò)圖包含35 個節(jié)點(diǎn)和171條邊，平均節(jié)點(diǎn)Degree 值為9.77，富集

＜1.0E-16。將網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)以TSV 格式從STRING 數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)出，然后導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1 軟件中，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，Degree 排名前10的靶點(diǎn)包括RACK1、ACTG1、UBB、CCT8、HSPD1、SOD1、CDC42、PSMA6、CFL1、RPL7，見圖4。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料用χ2檢驗。

再次，建立健全存貨內(nèi)部控制管理制度，確保采購、驗收、入庫、保管、出庫等各個環(huán)節(jié)都有嚴(yán)格審批手續(xù)和監(jiān)督控制措施，明確規(guī)定各崗位的職責(zé)。

2.2 核心DEGs 篩選與生物學(xué)過程及信號通路分析共得到36 個UC的核心DEGs，包括：UBB、CYCS、GNB2L1、APP、CDC42、SOD1、ACTG1、ISG15、RHOA、ACTR2、B2M、CANX、ATP5B、TXN、ATP5A1、CCT8、PFDN5、RAB11A、RAB7A、HNRNPA2B1、NEDD8、HSPD1、PARK7、TFRC、SDHB、RPL7、PSMA6、PCBP1、ATP5O、ANXA2、RPS27、GDI2、RAC1、CFL1、FAU、PTGES3。功能注釋結(jié)果顯示：36 個UC 核心DEGs共在53 個（

＜0.01）GO term 上富集，其中BP18 個，CC24 個，MF11 個。BP 主要富集在Gtpase 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞或亞細(xì)胞成分的運(yùn)動、線粒體ATP 合成耦合質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)、ATP 合成耦合質(zhì)子運(yùn)輸、線粒體膜電位的調(diào)節(jié)等；CC 主要富集在胞外外體、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外間質(zhì)、局部粘連等；MF 主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、多聚RNA 結(jié)合、質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP 合成酶活性、谷胱甘肽酶活性、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性等，BP、CC、MF的COUNT 得分排名前5的結(jié)果見表1、圖2。KEGG 通路分析顯示：36 個UC 核心DEGs 共富集在25 條通路上，主要包括：吞噬體、黏著小帶、細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞、沙門氏菌感染、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、白細(xì)胞內(nèi)皮移動等，見表2、圖3。

2.1 差異基因篩選結(jié)果 共篩選出487 個差異基因，其中上調(diào)465 個，下調(diào)22 個。采用R 語言繪制火山圖，見圖1A；繪制前30 位上調(diào)基因和下調(diào)基因的熱圖，見圖1B。

3 討論

隨著高通量芯片技術(shù)發(fā)展，利用生物信息學(xué)方法可以更加快速、經(jīng)濟(jì)、高效地篩選出參與疾病發(fā)病機(jī)制的重要基因，為疾病的診斷、治療及藥物設(shè)計提供依據(jù)。本研究基于生物信息學(xué)分析篩選出UC的487 個DEGs，上調(diào)基因465 個，下調(diào)基因22 個，然后篩選得到36 個UC 核心DEGs。進(jìn)一步探究了核心DEGs的生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成，發(fā)現(xiàn)涉及的生物過程包括：GTP 酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞或亞細(xì)胞成分的運(yùn)動、線粒體ATP 合成耦合質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)、ATP 合成耦合質(zhì)子運(yùn)輸、線粒體膜電位的調(diào)節(jié)、胞外外體、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外間質(zhì)、局部粘連、蛋白質(zhì)結(jié)合、多聚RNA 結(jié)合、質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP 合成酶活性、谷胱甘肽酶活性、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性等，這些與UC的發(fā)生和發(fā)展都有一定的聯(lián)系。KEGG 通路分析顯示主要通路包括：吞噬體、黏著小帶、細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞、沙門氏菌感染、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、白細(xì)胞內(nèi)皮移動等。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，RACK1、ACTG1、UBB、CCT8、HSPD1、SOD1、CDC42、PSMA6、CFL1、RPL7等靶點(diǎn)是網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn)，推測它們是UC 發(fā)病的關(guān)鍵基因。目前研究顯示，RACK1 通過控制蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）介導(dǎo)的信號通路將蛋白錨定在特定亞細(xì)胞位置并調(diào)節(jié)活性，導(dǎo)致下游激酶的激活或失活，從而控制細(xì)胞極性，從動力學(xué)角度調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動力。此外，RACK1 基因的過表達(dá)，調(diào)節(jié)某些癌癥的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)多種不同腫瘤細(xì)胞的侵襲和擴(kuò)散

。研究顯示

，UC 患者結(jié)腸黏膜中CDC42 水平較正常人顯著升高。CDC42是RhoGTP 酶蛋白家族中的一員，與GTP 結(jié)合后活化的CDC42 可以調(diào)控細(xì)胞黏附、細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞運(yùn)動和遷移、細(xì)胞膜蛋白物質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N生物學(xué)活動

。在T 細(xì)胞中，CDC42 過表達(dá)對細(xì)胞骨架的肌動蛋白和微管蛋白分極和遷移、分化均有影響

。CDC42 還會使癌細(xì)胞依附于血管壁上，從而使它們通過血液擴(kuò)散到身體的其他部位。因此，理論上抑制CDC42 蛋白可以使癌細(xì)胞無法依附于血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細(xì)胞上，從而減少其擴(kuò)散的機(jī)會，這在未來極有可能成為新的預(yù)防癌細(xì)胞擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。

綜上所述，RACK1、ACTG1、UBB、CCT8 等基因可能通過調(diào)控吞噬體、黏著小帶、細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞、沙門氏菌感染、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、白細(xì)胞內(nèi)皮移動等信號通路參與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展。

[1] 張雪瑩,單海燕,薄淑萍.隔藥灸神闕八陣穴聯(lián)合角調(diào)五音療法治療潰瘍性結(jié)腸炎伴焦慮抑郁狀態(tài)效果觀察[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2019(1):38-41.

[2] 中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會消化系統(tǒng)疾病專業(yè)委員會.潰瘍性結(jié)腸炎中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見（2017年）[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2018,26(2):105-111,120.

[3] 張玉潔,梁潔,吳開春.炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018年）潰瘍性結(jié)腸炎部分解讀[J].中華消化雜志,2018,38(5):312-314.

[4] 劉建軍,劉東,王希龍,等.北豆根對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的治療作用[J].中醫(yī)學(xué)報,2018,33(8):1476-1479.

[5] Laharie D.Towards therapeutic choices in ulcerative colitis[J].Lancet,2017,390(10090):98-99.

[6] Guo Y,Bao Y,Ma M,et al.Identification of key candidate genes and pathways in colorectal cancer by integrated bioinformatical analysis[J].Int J Mol Sci,2017,18(4):722.

[7] Li Y,Jiang Q,Ding Z,et al.Identification of a common different gene expression signature in ischemic cardiomyopathy[J].Genes (Basel),2018,9(1):56.

[8] 劉萌,段琪琪,王敏,等.基于生物信息學(xué)分析探究銀屑病關(guān)鍵基因和通路[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2019,33 (11):1232-1238.

[9] 馮春來,顧於梅,秦悅,等.基于模塊分解的生物網(wǎng)絡(luò)分析算法及其應(yīng)用[J].中成藥,2016,38(10):2227-2232.

[10] 朱敬成,劉輝,王倫文,等.基于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲睾隙鹊年P(guān)鍵節(jié)點(diǎn)識別方法[J].計算機(jī)應(yīng)用研究,2021,38(12):3581-3585.

[11] 王治,洪莉,李素廷,等.基于GEO 數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)方法分析子宮內(nèi)膜癌相關(guān)基因和候選通路[J].吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）,2020,46(4):904-808.

[12] 李寧,吳海明,耿榮鑫,等.基于生物信息學(xué)的糖尿病心肌病生物標(biāo)志物及關(guān)鍵通路的篩選[J].中華老年多器官疾病雜志,2019,18(5):321-326.

[13] 徐麗秀,李金秋,哈提拉·吐爾遜,等.RACK1 通過調(diào)控脂質(zhì)合成促進(jìn)子宮頸癌ME180 細(xì)胞侵襲、遷移及增殖[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2022(7):775-782.

[14] 祁代華.SLP-2 和CDC42 蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[D].鄭州:鄭州大學(xué),2019.

[15] 李晨.CDC42 對炎癥性腸病中Thl7 細(xì)胞作用的研究[D].廣州:南方醫(yī)科大學(xué),2015.

[16] 商浩,王萍,劉春霞,等.Rac1 和Cdc42 對橫紋肌肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移以及凋亡的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2020,55(3):379-384.