CDKN2A 基因突變與腎細(xì)胞癌藥物敏感性和預(yù)后的關(guān)系

腎透明細(xì)胞癌（kidney renal clear cell carcinoma）是泌尿系統(tǒng)腎細(xì)胞癌的一個(gè)獨(dú)特亞型，根治性切除是腎細(xì)胞癌的主要治療方法，其次是化療和靶向治療。然而，即使手術(shù)治療成功，仍有30%的患者可能出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

。不同基因突變的患者可能對(duì)不同的藥物治療產(chǎn)生耐藥性，因此對(duì)不同基因突變的患者進(jìn)行個(gè)體化治療更為重要

。因此，確定腎細(xì)胞癌進(jìn)展和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物和潛在相關(guān)分子機(jī)制是必要的，尋找潛在相關(guān)的靶向藥物對(duì)于個(gè)體化治療至關(guān)重要。Xu J等

研究證實(shí)，CDKN2A 啟動(dòng)子甲基化發(fā)生在支氣管細(xì)胞癌變的早期。Hayashi T等

研究了胃癌患者的腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)CDKN2A的失活通常是由5'CpG 島的純合缺失和高甲基化引起的，這在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。Wang L等

發(fā)現(xiàn)，在77 例平滑肌肉瘤患者中，22%的患者存在CDKN2A 基因啟動(dòng)子高甲基化，表明CDKN2A 啟動(dòng)子高甲基化及其蛋白表達(dá)缺失與預(yù)后不良密切相關(guān)。然而，CDKN2A 在腎細(xì)胞癌中的作用尚不確定

。CDKN2A 突變狀態(tài)可能影響某些腎細(xì)胞癌患者的病情進(jìn)展和治療。因此，探索CDKN2A 突變患者的一些相關(guān)信號(hào)通路將有助于進(jìn)一步了解腎細(xì)胞癌進(jìn)展的分子水平機(jī)制，并為患者的個(gè)體化治療策略提供指導(dǎo)。為了探索腎細(xì)胞癌預(yù)后和個(gè)體化治療反應(yīng)的機(jī)制，本研究對(duì)腎細(xì)胞癌的RNA 測序數(shù)據(jù)集以分析基因突變，研究泛癌和腎細(xì)胞癌中CDKN2A 突變的藥物敏感性。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從在線探索工具TCGA 數(shù)據(jù)庫下載（http://xena.ucsc.edu/）腎細(xì)胞癌基因表達(dá)譜（使用AgilentG4502A_07_3的腎細(xì)胞癌RNA 表達(dá)和突變基因）和臨床信息。采用開源網(wǎng)絡(luò)工具cBioPortal 分析Kaplan-Meier 圖和CDKN2A 突變（http://www.cbioportal.org/index.do）。BioPortal 數(shù)據(jù)庫（http：//www.cbioportal.org）整合了各種基因數(shù)據(jù)類型，包括TCGA、UCSC、GDAC 等，從cBioPortal 數(shù)據(jù)庫獲得600份腎細(xì)胞癌樣本，通過數(shù)據(jù)庫篩選選項(xiàng)，提取患者相關(guān)資料，篩選條件：①“Cancer Type：KIRC”；②“Gene：CDKN2A”；③“Data Type：mRNA”。應(yīng)用survival 選項(xiàng)分析600 份樣本中CDKN2A 突變情況與生存時(shí)間（總體生存和無疾病生存）關(guān)系圖，對(duì)3 種不同腎細(xì)胞癌研究中突變類型的mRNA 表達(dá)進(jìn)行比較。

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1.2 GDSC 數(shù)據(jù)庫分析 癌癥藥物敏感性基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（GDSC）（https://www.cancerrxgene.org/）是癌癥臨床研究中最常用的數(shù)據(jù)庫之一，收集了大量關(guān)于腫瘤細(xì)胞藥物敏感性的信息，進(jìn)入數(shù)據(jù)庫所有藥物的界面，將“CDKN2A”數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)與化合物敏感性相關(guān)聯(lián)，查看泛癌和腎細(xì)胞癌中CDKN2A 突變在藥物的細(xì)胞系IC

圖，并繪制和生成與相應(yīng)藥物敏感性的火山圖和散點(diǎn)圖。

1.3 基因集富集分析 基因集富集分析（GSEA）用于評(píng)估按表型相關(guān)性排序的基因列表中預(yù)定義基因集中的基因分布，以確定它們對(duì)表型的作用（http://software.org/gsea/下載.jsp）。應(yīng)用分子特征數(shù)據(jù)庫（MSigDB），基于標(biāo)稱

值和標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)（NES）分析路徑富集。根據(jù)CDKN2A 基因表達(dá)量分為兩組，通過GSEA4.1.0 分析CENPF 基因表達(dá)水平對(duì)各種生物通路基因集的影響，按照默認(rèn)富集加權(quán)統(tǒng)計(jì)方法，選擇MSigDB 數(shù)據(jù)庫的基因集（c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt）作為參照基因集，置換次數(shù)為1000 次，計(jì)算基因富集得分（enrichment score，ES）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Wilcoxon 試驗(yàn)比較突變型和野生型之間的CDKN2A mRNA 表達(dá)水平；采用Kaplan-Meier 法和Log rank 檢驗(yàn)，通過Graphpad 計(jì)算不同CDKN2A 組之間的臨床結(jié)果；edgeR 和GSEA中的FDR 分別采用Benjamini-Hochberg 程序進(jìn)行多次試驗(yàn)調(diào)整，以控制FDR。

＜0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 差異基因（DEGs）的鑒定與富集分析 使用R軟件包在微陣列數(shù)據(jù)中選擇-Log

（

value）＞2 且∣Log

（fold change）∣＜1的DEGs。由DAVID（http://david.ncifcrf.gov）對(duì)DEGs 進(jìn)行KEGG 途徑和GO 富集分析，其中FDR＜0.05，-LogFDR＞1.302的前幾個(gè)通路被認(rèn)為是顯著的。

2 結(jié)果

淀南新堤分洪工程位于劉李莊鎮(zhèn)辛莊，口門長400m。堤身素填土由壤土、砂壤土及黏土填筑而成，堤基下土體巖性為第四系全新統(tǒng)沖洪積的壤土及砂壤土，不良地質(zhì)現(xiàn)象，口門地基工程地質(zhì)條件較好。

2.2 CDKN2A 基因突變對(duì)腎細(xì)胞癌患者預(yù)后和藥物敏感性的影響 腎細(xì)胞癌患者的臨床特征見表1，生存分析顯示，具有CDKN2A 突變的腎細(xì)胞癌患者總體生存率和無病生存率較差（圖3），在泛癌和腎細(xì)胞癌中，CDKN2A 突變型可能比野生型增加對(duì)Tenovin-6 等藥物的耐藥性，并且Tenovin-6 對(duì)各種癌癥和腎細(xì)胞癌中的野生型具有選擇性（圖4）。

2.1 腎細(xì)胞癌中的CDKN2A 表達(dá)及突變 600 例腎細(xì)胞癌樣本中有5.00%的CDKN2A 突變病例，其余為野生型（圖1A）。CDKN2A 在腎細(xì)胞癌中的突變類型包括亞基突變、錯(cuò)義突變、截?cái)嗤蛔兒涂缭秸麄€(gè)基因的深度缺失（圖1B）。其中，3.00%為深度缺失，2.00%為錯(cuò)義突變、截?cái)嗤蛔兒蚷nframe 突變（圖2A）。CDKN2A 突變類型為深度缺失的mRNA 表達(dá)低于野生型（圖2B）；與突變型相比，野生型的CDKN2A 表達(dá)較高（圖2C）；CDKN2A 在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)高于正常腎組織。

無論是種間還是種內(nèi)，核型之間存在一定的區(qū)別和聯(lián)系。例如，同一物種不同倍性水平的材料進(jìn)行核型分析，與二倍體相比，同源四倍體不結(jié)球白菜染色體變異范圍稍大些［14］。另外，試驗(yàn)過程中會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞染色體數(shù)目與基數(shù)存在差異的現(xiàn)象，造成的原因可能是在染色體制片、配對(duì)與數(shù)據(jù)分析過程中，由于分析技術(shù)不同或某些人為因素導(dǎo)致，例如，鏡檢時(shí)染色體易發(fā)生重疊或者多個(gè)細(xì)胞染色體組合在一起等問題，都會(huì)造成細(xì)胞染色體數(shù)目不同，標(biāo)本的取樣數(shù)量、時(shí)間和地點(diǎn)等也可能是重要的誤差源。

2.3 基于GSEA的CDKN2A 突變信號(hào)通路分析GSEA 分析顯示，CDKN2A 突變信號(hào)通路主要富集在Wnt-catenin 信號(hào)、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、緊密連接、TGF-β 信號(hào)、磷脂酰肌醇信號(hào)、erbb 信號(hào)和粘附連接（圖5）。2.4 DEGs的鑒定和富集分析 共有350 個(gè)基因被鑒定為DEGs，包括170 個(gè)下調(diào)基因和180 個(gè)上調(diào)基因。DEGs的火山圖見圖6A。使用DAVID 對(duì)DEGs進(jìn)行富集分析，GO 分析結(jié)果表明，DEGs 主要富集于RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物和序列特異性DNA 結(jié)合的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控，見圖6B。KEGG 通路分析顯示，DEGs 主要富集于細(xì)胞周期、癌癥、慢性髓系白血病、癌癥中的microRNA 和p53 信號(hào)通路，見圖6C。

3 討論

CDKN2A 在各種腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化中突變類型包括純合缺失（HD）、雜合性缺失（LOH）、p16INK4a/p14ARF 基因啟動(dòng)子的突變和異常甲基化

。Ibrahim I等

研究了肺癌、卵巢癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的89 個(gè)細(xì)胞系中246 個(gè)位點(diǎn)的純合缺失，發(fā)現(xiàn)CDKN2A 基因的純合缺失最常見（26%），且與疾病預(yù)后的關(guān)系不同。本研究發(fā)現(xiàn)，腎細(xì)胞中約5.00%的患者攜帶CDKN2A 突變，包括亞基突變、錯(cuò)義突變、截?cái)嗤蛔兒涂缭秸麄€(gè)基因的深度缺失，其中3.00%為深度缺失，2.00%為錯(cuò)義突變、截?cái)嗤蛔兒徒送蛔?。Thompson ED等

發(fā)現(xiàn)，CDKN2A的總突變率為93.3%，啟動(dòng)子異常甲基化占46.7%，純合缺失占36.7%，突變占13.3%。

CDKN2A 基因位于染色體9p21 上，受調(diào)控的CDKN2A 蛋白包含156 個(gè)氨基酸，在細(xì)胞周期中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖并抑制腫瘤的產(chǎn)生，該基因的失活可導(dǎo)致細(xì)胞分離控制和惡性進(jìn)展為腫瘤

。目前研究發(fā)現(xiàn)，該基因在許多腫瘤中丟失或發(fā)生突變。CDKN2A基因失活的機(jī)制包括啟動(dòng)子甲基化、純合缺失和點(diǎn)突變，平均頻率分別為33%、22%和15%；另外，研究還發(fā)現(xiàn)9p21 區(qū)域雜合性缺失與腫瘤發(fā)生有關(guān)

。

故事二 先生游南鎮(zhèn)，一友指巖中花樹問曰：“天下無心外之物，如此花樹，在深山中自開自落，于我心亦何相關(guān)？”先生曰：“你未來看此花時(shí)，此花與汝心同歸于寂。你來看此花時(shí)，則此花顏色一時(shí)明白起來。始知此花不在你的心?！?/p>

Ibrahim IS等

發(fā)現(xiàn)，CDKN2A 啟動(dòng)子甲基化與直腸癌患者的復(fù)發(fā)和預(yù)后相關(guān)，表明CDKN2A 啟動(dòng)子甲基化可作為預(yù)測直腸癌預(yù)后的指標(biāo)。Potjer TP等

發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者的腫瘤組織中存在一種特殊的CDKN2A 突變，表明CDKN2A 突變可能被用作胰腺癌的標(biāo)志物。本研究顯示，CDKN2A 突變的腎細(xì)胞癌患者總體生存率和無病生存率較差，這表明CDKN2A 突變可能有助于腎細(xì)胞癌的進(jìn)展。除此之外，降低CDKN2A 表達(dá)水平已被證明可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療或放療的耐受性

。因此，CDKN2A 可以作為新的抗癌治療策略的靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，CDKN2A 突變對(duì)Tenovin-6 等藥物的敏感性較低，這表明Tenovin-6 突變在治療上的預(yù)后較差，并且在各種癌癥和腎細(xì)胞癌中，Tenovin-6 對(duì)野生型具有顯著的選擇性。隨著組蛋白去乙?；福℉DAC）的發(fā)展，HDAC 抑制劑（HDACi）已成為抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)

。Tenovin-6 是近年來開發(fā)的一種HDACi，是脫乙酰酶SIRT1的抑制劑，選擇性地抑制Ⅲ類HDACs 中最常見的SIRT1 和SIRT2，并激活P53，具有更大的臨床應(yīng)用價(jià)值。Tenovin-6 可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和周期阻滯

。這些研究為腎細(xì)胞癌患者個(gè)體化應(yīng)用特異性抗腫瘤藥物提供了額外證據(jù)，并為進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，腎細(xì)胞癌患者CDKN2A 突變信號(hào)通路主要富集Wnt-catenin 信號(hào)、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、緊密連接、TGF-β 信號(hào)、磷脂酰肌醇信號(hào)、erbb信號(hào)和粘附連接。已有研究證實(shí)

，CDKN2A 基因的負(fù)調(diào)控途徑是RB1 途徑。CDKN2A 蛋白包含四個(gè)連續(xù)的錨蛋白重復(fù)序列，它們與CDK4 和CDK6 結(jié)合，而CDK4 和CDK6 是一種雙周期依賴性蛋白激酶，作用于CDK4-6的非催化側(cè)，可抑制CDK 和細(xì)胞周期蛋白D1 復(fù)合物的催化活性

。CDKN2A 突變可能通過影響多種途徑促進(jìn)腎細(xì)胞癌的進(jìn)展，CDKN2A突變患者的腫瘤可能更容易進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，GO 分析中差異基因主要富集在RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控中。

綜上所述，多個(gè)基因和通路途徑可能在CDKN2A 突變中起關(guān)鍵作用。本研究確定了與腎細(xì)胞癌中CDKN2A 突變相關(guān)的主要途徑，這可能通過制定腎細(xì)胞癌特定CDKN2A 突變亞型的治療策略來改善腎細(xì)胞癌的預(yù)后。另外，腎細(xì)胞癌中CDKN2A突變的機(jī)制和驗(yàn)證仍需在臨床和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

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