當歸補血湯促進大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合及調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 通路作用研究

李 暢，范 榮，李東波，周 威，黃玉娥

（三亞市中醫(yī)院急診骨外科，海南 三亞 572000）

骨質(zhì)疏松性骨折是目前臨床中常見的疾病，主要與年齡、性別、營養(yǎng)攝入及基礎(chǔ)疾病有關(guān)[1]?；颊哂捎趦?nèi)分泌疾病、腎功能疾病及長期使用激素類藥物等多種原因?qū)е鹿琴|(zhì)疏松，隨著病情進展，患者由于非外傷或外傷發(fā)生骨折的風險顯著增加，且預后較差，導致患者長期活動受限，進而引發(fā)全身感染性疾病[2]。研究[3]表明，Wnt/β-catenin 通路及相關(guān)蛋白水平的降低與骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，曹燕明等[4]研究證實，β-catenin 蛋白水平的降低與骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生密切相關(guān)；王斌等[5]研究表明，Wnt 及β-catenin 蛋白水平的降低誘導并加重骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生及進展。當歸補血湯是以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)，由當歸、黃芪等中藥材組成的中藥制劑，具有補血功效，常用于治療血虛陽浮等病癥。近年來，現(xiàn)代醫(yī)學研究表明當歸補血湯對于骨質(zhì)疏松及骨折的愈合均有顯著的改善作用，謝青等[6]研究表明，當歸補血湯能夠顯著改善骨折患者的隱形失血，減少并發(fā)癥，加速骨關(guān)節(jié)功能的恢復；陳煥杰[7]研究發(fā)現(xiàn)，當歸補血湯能夠顯著改善骨折患者踝關(guān)節(jié)及膝關(guān)節(jié)功能狀態(tài)，緩解患者疼痛狀態(tài)，促進骨折愈合，由此可見當歸補血湯對于骨折愈合有較好的促進作用，然而，當歸補血湯對于骨質(zhì)疏松性骨折愈合的促進作用及對Wnt 及β-catenin 通路的調(diào)節(jié)作用目前尚未見明確報道。本研究通過探討當歸補血湯對大鼠骨質(zhì)疏松性骨折的修復作用及其作用機制，為當歸補血湯的藥理作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 72 只雌性SD 大鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量180～200 g，購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0011，飼養(yǎng)于實驗動物房，溫度22～25 ℃，相對濕度40%～70%，自然光照，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.2 藥品及試劑 當歸補血湯由黃芪30 g（貨號：191017），當歸6 g（貨號：190911）組成，藥材飲品購自北京同仁堂藥業(yè)有限公司，將藥材飲品置于1 500 mL 蒸餾水中浸泡2 h，煎煮45 min，過濾后將藥材殘渣置于1 000 mL 水中，再次煎煮45 min 后，過濾，合并2 次濾液，蒸發(fā)濃縮，制成生藥含量為1 g/mL 的制劑；骨組織蛋白提取試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，貨號：HR0117）；阿侖膦酸鈉（石藥集團歐意藥業(yè)有限公司，規(guī)格：10 mg，批號：20190809）；Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin、GAPDH 單克隆抗體（艾博抗貿(mào)易有限公司，貨號：ab219412、ab109416、ab236639、ab32572、ab181602）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（碧云天生物科技有限公司，貨號：P0012、A0208）；RNA 提取試劑盒、cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：R1200、K1672、G1120）；PCR 引物設(shè)計及合成（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3 設(shè)備與儀器 EXA -3000 雙能X 線骨密度檢測儀（澳思托醫(yī)療器械有限公司）；HY -0350 萬能生物力學試驗機（上海衡翼精密儀器有限公司）；5427 R 臺式高速冷凍離心機（艾本德中國有限公司）；SpectraMax iD5 酶標儀（美谷分子儀器有限公司）；MyGo Pro PCR 儀（英國IT-IS 公司）；IX83 熒光倒置顯微鏡（奧林巴斯有限公司）；E-Gel Imager 凝膠成像儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.4 分組、造模及給藥 72 只大鼠隨機分為正常對照組（12 只）及造模組（60 只），參照文獻[8]方法，將造模組大鼠麻醉后從背部作切口，去除雙側(cè)卵巢，正常對照組大鼠只做切口但不摘除卵巢，消毒并逐層縫合后，給予70 mg/kg 的頭孢呋辛預防感染，12 周后，測定大鼠骨密度，以造模組大鼠骨密度顯著低于正常對照組視為造模成功。在造模組大鼠右后肢外側(cè)作一切口，將股骨中段橫行鋸斷，使用直徑為1 mm 的克氏針固定后縫合。將造模組大鼠隨機分為骨質(zhì)疏松性骨折組、當歸補血湯低、中、高劑量組及阿侖膦酸鈉組，12 只/組。當歸補血湯低、中、高劑量組分別按照2.5、5、10 g/kg[9]（以生藥含量計）的劑量灌胃給予大鼠當歸補血湯，阿侖膦酸鈉組按照0.5 mg/kg[10]灌胃給予大鼠阿侖膦酸鈉，正常對照組及骨質(zhì)疏松性骨折組大鼠灌胃給予生理鹽水，每日1 次，連續(xù)給藥8周[11]。

1.5 大鼠骨密度的測定 大鼠使用10%水合氯醛麻醉后置于雙能X 線骨密度檢測儀，檢測各組大鼠右后肢股骨密度。

1.6 大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平測定 每組取6 只大鼠，麻醉后取仰臥位，腹主動脈取血至干凈離心管中，4℃靜置1 h 后，置于4℃離心機中，8 000 r/min，離心10 min，取上清，使用TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒測定大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平。

1.7 大鼠血清ALP、OC 水平測定 每組取6 只大鼠，眼眶靜脈叢取血至干凈離心管中，4℃靜置1 h 后，置于4 ℃離心機，6 000 r/min，離心10 min，取上清液，使用大鼠ALP 及OC 檢測試劑盒測定大鼠血清ALP、OC 水平。

1.8 大鼠股骨彈性模量、最大應(yīng)力、最大承受力測定 每組取6 只大鼠，頸椎脫臼法處死后分離右后肢股骨，使用萬能生物力學試驗機檢測大鼠股骨彈性模量、最大應(yīng)力、最大承受力等生物力學指標。

1.9 大鼠股骨病理學檢查 每組取6 只大鼠，頸椎脫臼法處死大鼠后，分離右側(cè)股骨，在4%中性甲醛中固定48 h，然后在10%乙二胺四乙酸中脫鈣2 周，使用石蠟包埋機包埋后，進行5 μm 切片，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色后，在顯微鏡下進行組織病理學檢查。

1.10 大鼠股骨Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin mRNA 水平測定 每組取6 只大鼠，頸椎脫臼法處死大鼠后，分離右側(cè)股骨，在液氮中研磨，使用RNA 提取試劑盒提取總RNA，并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，根據(jù)引物序列，使用PCR 試劑盒，測 定Wnt3a、DKK1、Runx2、β-catenin 及GAPDH mRNA 水平，結(jié)果以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各基因表達水平。PCR 引物序列：Wnt3a，正向引物5’-GCAGCTGTGAAGTGAAGAC-3’，反向引物5’-GGTGTTTCTCTACCACCATCTC-3’；DKK1，正向引物5’-AGTGGGAACCGAAGAAGAAG-3’，反向引物5’-GACGGGAACTGACTGGATGAAC-3’；Runx2，正向引物5’-GTGTGTGAAAAGCCCGTGTC-3’，反向引物5’-GCACAAGGTTCTGGCAGTTG-3’；β-catenin，正向引物5’-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3’，反向引物5’-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3’；GAPDH，正向引物5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，反向引物5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。

1.11 大鼠股骨Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin 蛋白水平測定 每組取6 只大鼠，頸椎脫臼法處死大鼠后，分離右側(cè)股骨，在液氮中研磨，使用骨組織蛋白提取試劑盒提取總蛋白，使用BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白含量后，取相當于50 μg 蛋白的股骨組織樣品，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，使用封閉液室溫封閉1 h，分別用Wnt3a、DKK1、Runx2、β-catenin 及GAPDH 兔單克隆抗體（1: 1 000 稀釋）在4℃條件下孵育過夜，使用含吐溫的磷酸鹽緩沖液清洗3 次，每次5 min，使用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1: 2 000 稀釋）室溫孵育2 h，再次用含吐溫的磷酸鹽緩沖液清洗3 次，滴加超敏化學發(fā)光液，置于凝膠成像儀中拍照，并使用ImageJ 1.8.0 進行灰度值分析，計算各蛋白相對表達量。

1.12 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 進行處理和分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，符合正態(tài)分布且方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 當歸補血湯對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨密度的影響 與正常對照組比較，骨質(zhì)疏松性骨折組大鼠骨密度顯著降低（P＜0.05）；與骨質(zhì)疏松性骨折組比較，當歸補血湯低、中、高劑量組及阿侖膦酸鈉組大鼠骨密度顯著升高（P＜0.05），且隨著當歸補血湯劑量的增加，大鼠骨密度逐漸升高。見表1。

2.2 當歸補血湯對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠血清TNF-α、IL-1β 的影響 與正常對照組比較，骨質(zhì)疏松性骨折組大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平顯著升高（P＜0.05），與骨質(zhì)疏松性骨折組比較，當歸補血湯低、中、高劑量組及阿侖膦酸鈉組大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平顯著降低（P＜0.05），且隨著當歸補血湯劑量的增加，大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平逐漸降低。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平比較 pg/mL

2.3 當歸補血湯對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠血清ALP、OC的影響 與正常對照組比較，骨質(zhì)疏松性骨折組大鼠血清ALP、OC 水平顯著升高（P＜0.05），與骨質(zhì)疏松性骨折組比較，當歸補血湯低、中、高劑量組及阿侖膦酸鈉組大鼠血清ALP、OC 水平顯著降低（P＜0.05），且隨著當歸補血湯劑量的增加，大鼠血清ALP、OC 水平逐漸降低。見表3。

表3 各組大鼠血清ALP、OC 水平比較

2.4 當歸補血湯對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨生物力學的影響 與正常對照組比較，骨質(zhì)疏松性骨折組大鼠彈性模量、最大應(yīng)力及最大承受力顯著降低（P＜0.05），與骨質(zhì)疏松性骨折組比較，當歸補血湯低、中、高劑量組及阿侖膦酸鈉組大鼠彈性模量、最大應(yīng)力及最大承受力顯著升高（P＜0.05），且隨著當歸補血湯劑量的增加，大鼠彈性模量、最大應(yīng)力及最大承受力逐漸升高。見表4。

表4 各組大鼠彈性模量、最大應(yīng)力及最大承受力比較

2.5 當歸補血湯對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠股骨病理學的影響 正常對照組大鼠股骨組織結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病理學變化，與正常對照組比較，骨質(zhì)疏松性骨折組大鼠股骨組織骨小梁減少；與骨質(zhì)疏松性骨折組比較，當歸補血湯各劑量組阿侖膦酸鈉組大鼠骨小梁逐漸增多，空骨陷窩明顯減少，股骨組織骨質(zhì)疏松性病理組織變化明顯改善。見圖1。

圖1 大鼠股骨病理學檢查（HE，×200）

2.6 當歸補血湯對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin mRNA 水平的影響 與正常對照組比較，骨質(zhì)疏松性骨折組大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），與骨質(zhì)疏松性骨折組比較，當歸補血湯低、中、高劑量組及阿侖膦酸鈉組大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin mRNA 水平顯著升高（P＜0.05），且隨著當歸補血湯劑量的增加，大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin mRNA 水平逐漸升高。見表5。

表5 各組大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin mRNA 水平比較

2.7 當歸補血湯對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin 蛋白水平的影響 當歸補血湯對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2及β-catenin 蛋白水平的影響顯著降低（P＜0.05），與骨質(zhì)疏松性骨折組比較，當歸補血湯低、中、高劑量組及阿侖膦酸鈉組大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2及β-catenin 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），且隨著當歸補血湯劑量的增加，大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin 蛋白水平逐漸升高。見表6，圖2。

圖2 大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin 蛋白水平比較

表6 各組大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin 蛋白水平比較

3 討論

骨質(zhì)疏松主要發(fā)生在中老年人群中，由內(nèi)分泌疾病、慢性腎臟病及血液系統(tǒng)疾病等多種病因引起的骨密度及骨質(zhì)量下降，臨床中以骨微結(jié)構(gòu)破壞及骨脆性增加為主要病理特征。骨質(zhì)疏松患者骨脆性增加，骨折是骨質(zhì)疏松患者常見的并發(fā)癥，且骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生率高，預后差，進而導致患者活動受限，生活不能自理，增加患者肺部感染及褥瘡的發(fā)生風險，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[12]。

當歸補血湯載于中醫(yī)學著作《內(nèi)外傷辨惑論》，具有補氣生血的功效。方中黃芪具有滋陰補血、補脾益氣的功效，當歸則具有養(yǎng)血和營、浮陽秘斂的功效。近年來，研究發(fā)現(xiàn)當歸補血湯對于骨折愈合具有顯著的促進作用。焦明海[13]研究表明，當歸補血湯能夠顯著緩解骨折患者疼痛、腫脹等癥狀，減少患者疼痛的發(fā)生；吳興輝等[14]研究表明，當歸補血湯能夠顯著提高骨折術(shù)后患者的血紅蛋白及紅細胞比容，減輕患者貧血表現(xiàn)，促進骨折愈合；鄧海峰等[15]研究發(fā)現(xiàn)，當歸補血湯能夠顯著升高股骨粗隆間骨折術(shù)后患者血紅蛋白水平，并促進骨折術(shù)后的愈合；郭華洋等[16]研究表明，當歸補血湯能夠顯著提高骨折患者術(shù)后髖關(guān)節(jié)功能，降低患者隱性失血的發(fā)生風險。由此可見，當歸補血湯對于骨折的愈合具有顯著的促進作用。

骨密度是評價骨質(zhì)疏松的重要指標，骨密度降低提示骨質(zhì)疏松發(fā)生或其發(fā)生風險增加[17]。本研究結(jié)果表明，與正常對照組比較，骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨密度顯著降低，提示造模成功，與骨質(zhì)疏松性骨折大鼠比較，當歸補血湯各劑量組大鼠骨密度呈劑量依賴性顯著升高，促進骨質(zhì)疏松的恢復。彈性模量、最大應(yīng)力及最大承受力是評價骨生物力學的重要指標，彈性模量、最大應(yīng)力及最大承受力降低表明骨組織生物力學顯著降低及骨組織功能減退[18]。本研究結(jié)果表明，與正常對照組比較，骨質(zhì)疏松性骨折大鼠彈性模量、最大應(yīng)力及最大承受力均顯著降低，給予大鼠不同劑量的當歸補血湯后，大鼠彈性模量、最大應(yīng)力及最大承受力隨當歸補血湯劑量的增加而逐漸升高，提示當歸補血湯能夠呈劑量依賴性的顯著修復骨質(zhì)疏松性骨折大鼠的骨組織功能，恢復大鼠骨生物力學指標，促進骨折大鼠的修復。

血清ALP、OC在骨組織損傷恢復中發(fā)揮重要作用，李希寧等[19]研究表明ALP、OC 水平的升高是導致骨質(zhì)疏松及骨組織損傷的重要因素，并能夠抑制成骨細胞的組織分化，抑延緩骨組織的愈合速度；陳洪燕等[20]研究表明，降低大鼠ALP、OC 水平能夠促進新骨的形成，升高骨密度水平。本研究結(jié)果表明，給予骨質(zhì)疏松性骨折大鼠不同劑量的當歸補血湯后，大鼠血清ALP、OC 水平呈劑量依賴性顯著降低，提示當歸補血湯能夠呈劑量依賴性顯著調(diào)節(jié)骨代謝，促進大鼠骨組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復。TNF-α、IL-1β 水平對于骨折的愈合有較大影響，劉明等[21]研究表明，TNF-α、IL-1β水平的升高會減緩大鼠骨折愈合速度。本研究結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松性骨折大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平顯著升高，給予大鼠當歸補血湯后，骨質(zhì)疏松性骨折大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平呈劑量依賴性顯著降低，提示當歸補血湯能夠呈劑量依賴性顯著降低骨質(zhì)疏松性骨折大鼠的炎癥反應(yīng)，緩解大鼠體內(nèi)炎癥狀態(tài)，促進骨折的愈合。

Wnt/β-catenin 通路與細胞增殖、生長及代謝有關(guān)，近年來，研究表明Wnt/β-catenin 通路及相關(guān)蛋白水平異常與骨折的發(fā)生及愈合有關(guān)，史巖等[22]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)骨髓間充質(zhì)干細胞Wnt/β-catenin 通路相關(guān)蛋白水平，能夠顯著促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化，對骨折愈合有顯著的促進作用；丁徐等[23]研究表明，雞血藤能夠通過提高骨質(zhì)疏松性骨折大鼠Wnt/β-catenin 通路蛋白水平，提高大鼠骨密度，促進大鼠最大載荷及抗彎強度等骨生物力學的恢復；黃曉文等[24]研究表明，升高Wnt/β-catenin 通路相關(guān)蛋白水平能夠顯著促進脛骨骨折大鼠骨組織愈合，提高大鼠骨組織愈合評分，并緩解大鼠體內(nèi)炎癥水平，促進大鼠骨折的恢復，由此可見調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 通路及相關(guān)蛋白水平可能是促進骨折恢復及治療骨質(zhì)疏松性骨折的有效途徑和方法。本研究探討不同劑量當歸補血湯對骨折大鼠的修復作用，發(fā)現(xiàn)與正常對照組比較，骨質(zhì)疏松性骨折組大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2 及β-catenin mRNA 水平降低，與骨質(zhì)疏松性骨折組比較，當歸補血湯低、中、高劑量組及阿侖膦酸鈉組大鼠Wnt3a、DKK1、Runx2及β-catenin mRNA 水平升高，提示當歸補血湯能夠呈劑量依賴性的顯著提高骨質(zhì)疏松性骨折大鼠的Wnt/β-catenin 通路相關(guān)蛋白水平，激活骨組織Wnt/β-catenin通路，促進骨質(zhì)疏松性骨折大鼠的恢復。

綜上所述，當歸補血湯能夠顯著提高骨質(zhì)疏松性骨折大鼠的骨密度，改善大鼠骨生物力學指標，調(diào)節(jié)骨代謝水平，其機制可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 通路有關(guān)。