雙氫青蒿素對大鼠燒傷創(chuàng)面愈合及ERK/JNK信號通路的影響

王 瑞，湯志水，周 林，賈 晶

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形美容頜面外科，西安 710061)

燒傷是由火焰、熱液、強酸等物理化學(xué)因素造成的創(chuàng)傷類疾病[1]，其疼痛程度、致殘率、致死率較高，容易給患者心理和身體造成極大傷害[2]。皮膚燒傷嚴(yán)重的情況下，經(jīng)常會出現(xiàn)炎癥、水腫、出血、疼痛等癥狀，往往造成創(chuàng)面愈合緩慢、治療周期長、治療費用高等現(xiàn)狀，給社會帶來嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[3]。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路中的重要組成部分，參與調(diào)控炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、氧化應(yīng)激等反應(yīng)[4,5]。雙氫青蒿素是青蒿素的一種衍生物，有較好的抗炎、抑菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機體免疫等功效，其水溶性、吸收和治療皮膚炎性疾病效果較好，且毒性較低、易代謝，是一種治療潛力較大的化合物[6,7]。本研究通過構(gòu)建大鼠燒傷模型，觀察雙氫青蒿素對大鼠燒傷創(chuàng)面愈合的作用，并探究其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(230±20)g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXY(粵)2018-0002。

1.2 主要試劑與儀器

雙氫青蒿素(純度≥98%)購于廣州茵格潤化工原料廠(B21182-20 mg)；磺胺嘧啶銀(SS)乳膏購于昆明華潤圣火藥業(yè)有限公司(國藥準(zhǔn)字H20057720)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒(PT516、PI303、PI328、S0131M、S0101M、S0051)購于上海碧云天生物技術(shù)公司；兔抗ERK1/2(ab184699)、兔抗p-ERK1/2(ab201015)、兔抗JNK(ab199380)、兔抗p-JNK(ab47337)、兔抗GAPDH(ab9485)、山羊抗兔IgG(ab6721)購于Abcam公司。

TGL-16B高速離心機購于上海安亭科學(xué)儀器廠；ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購于美國BIO-RAD公司。

1.3 大鼠燒傷模型構(gòu)建及給藥

參照陳華等[8]的方法，采用金屬砝碼燒傷法進(jìn)行大鼠燒傷模型構(gòu)建。燒傷模型構(gòu)建成功的大鼠隨機分組：模型組、雙氫青蒿素低、中、高劑量組、SS組，每組10只。另隨機選取10只大鼠作為假手術(shù)組(sham組)，將金屬砝碼置于37 ℃溫水中，其余按燒傷模型構(gòu)建相同方法處理大鼠。將雙氫青蒿素溶解在無水乙醇中，按照無水乙醇與橄欖油1 ∶1的比例加入橄欖油，配制成含雙氫青蒿素的橄欖油和無水乙醇混懸液，雙氫青蒿素低、中、高劑量組給藥劑量分別為25,50,100 mg/kg[7]，涂抹在大鼠創(chuàng)面，每天1次；sham組和模型組大鼠創(chuàng)面涂抹等量的橄欖油和無水乙醇混懸液，每天1次；SS組大鼠涂抹SS乳膏2.0 g，每天1次[9]，至大鼠創(chuàng)面愈合。

1.4 大鼠創(chuàng)面愈合情況及愈合率計算

在藥物處理3，7，14，21 d時，觀察并拍照記錄大鼠創(chuàng)面愈合情況。采用Image-Pro Plus圖像分析軟件測定大鼠創(chuàng)面面積，計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.5 樣品獲取

藥物處理21 d時，麻醉后摘取眼球取血2 ml/100 g，血液離心(3 000 r/min，10 min)后取上清液，放入-20 ℃保存。之后處死大鼠，切下創(chuàng)面全層皮膚，一部分加入生理鹽水，用于制備組織勻漿；一部分放入多聚甲醛中固定，用于創(chuàng)面病理變化檢測；一部分放入-80 ℃保存，用來檢測ERK1/2、JNK的蛋白表達(dá)及其磷酸化水平。

1.6 大鼠創(chuàng)面病理變化檢測

將大鼠創(chuàng)面皮膚在多聚甲醛中固定24 h，使用乙醇脫水后，進(jìn)行石蠟包埋，切成5 μm厚度切片。經(jīng)HE染色后，通過光學(xué)顯微鏡觀察創(chuàng)面組織病理變化情況。

1.7 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測

將大鼠凍存血清快速解凍后，使用ELISA試劑盒分別檢測TNF-α、IL-1β、IL-6水平。操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行。

1.8 大鼠創(chuàng)面組織MDA水平和SOD、CAT活性檢測

將大鼠創(chuàng)面皮膚使用生理鹽水制備組織勻漿，使用試劑盒分別檢測MDA水平和SOD、CAT活性。操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行。

1.9 大鼠創(chuàng)面組織ERK/JNK信號通路相關(guān)蛋白(ERK1/2、JNK)表達(dá)檢測

取1.5中凍存皮膚組織制成組織勻漿，使用RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒提取蛋白并定量。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，半干轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入ERK1/2兔單克隆抗體(1 ∶1 000)、p-ERK1/2兔單克隆抗體(1 ∶1 000)、JNK兔單克隆抗體(1 ∶1 000)、p-JNK兔多克隆抗體(1 ∶1 000)、GAPDH兔多克隆抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜；加入二抗(1 ∶5 000)，室溫下孵育1 h。完成后滴加發(fā)光液，使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image Lab軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 雙氫青蒿素對大鼠燒傷創(chuàng)面愈合情況及愈合率的影響

參與造模的大鼠出現(xiàn)明顯的燒傷創(chuàng)面，說明模型建立成功。大鼠藥物處理3 d時，除雙氫青蒿素高劑量組創(chuàng)面出現(xiàn)較明顯紅色外，其余各組間未觀察到明顯差異(見圖1)。藥物處理7 d時，模型組大鼠創(chuàng)面出現(xiàn)明顯滲出，并伴有結(jié)痂現(xiàn)象；雙氫青蒿素各劑量組和SS組創(chuàng)面相對干燥，未觀察到明顯滲出，有結(jié)痂，且結(jié)痂有脫痂趨勢(見圖1)。藥物處理14 d時，各組創(chuàng)面面積均縮小，尤其是雙氫青蒿素高劑量組；模型組創(chuàng)面仍有滲出，且脫痂趨勢不明顯；雙氫青蒿素各劑量組和SS組創(chuàng)面滲液極少，脫痂明顯，可觀察到創(chuàng)面處有新生背毛，雙氫青蒿素各劑量組相較于SS組更加明顯(見圖1)。藥物處理21 d時，模型組創(chuàng)面仍未完全干燥，結(jié)痂未完全脫落，創(chuàng)面仍然明顯；SS組新生背毛明顯，結(jié)痂也未完全脫落，創(chuàng)面雖也明顯縮小，但依然清晰可見；雙氫青蒿素各劑量組結(jié)痂基本完全脫落，創(chuàng)面被新生背毛覆蓋，皮膚恢復(fù)良好，且恢復(fù)程度有一定劑量效應(yīng)關(guān)系(見圖1)。

藥物處理3，7 d時，各組大鼠創(chuàng)面愈合率無明顯差異(P>0.05，見表1)。藥物處理14，21 d時，雙氫青蒿素低、中、高劑量組和SS組創(chuàng)面愈合率明顯高于模型組(P<0.05，見表1)。雙氫青蒿素對大鼠創(chuàng)面愈合效果具有劑量依賴性，且雙氫青蒿素低、中、高劑量組創(chuàng)面愈合率均高于SS組。

2.2 雙氫青蒿素對大鼠創(chuàng)面組織病理變化的影響

藥物處理21 d時，模型組大鼠創(chuàng)面多數(shù)趨于愈合狀態(tài)，但仍存在炎性細(xì)胞浸潤、組織結(jié)構(gòu)完整度較差、上皮細(xì)胞分化生長不佳等情況。雙氫青蒿素各劑量組創(chuàng)面完全愈合，無炎性細(xì)胞浸潤且上皮細(xì)胞生長良好，新生膠原纖維排列整齊，與正常皮膚組織基本接近。SS組創(chuàng)面基本愈合，中間部位上皮細(xì)胞完整覆蓋，但膠原纖維排列不規(guī)則，與正常皮膚組織還存在一定差異性(見圖2)。

圖1 各組大鼠燒傷創(chuàng)面愈合情況Figure 1 Burn wound healing of rats in each group

表1 各組大鼠燒傷創(chuàng)面愈合率

2.3 雙氫青蒿素對大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響

與sham組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，雙氫青蒿素低、中、高劑量組和SS組TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低(P<0.05)，且雙氫青蒿素各劑量組對TNF-α、IL-1β、IL-6的降低作用呈劑量依賴性。與雙氫青蒿素低劑量組比較，SS組TNF-α、IL-1β、IL-6水平無明顯差異(P>0.05)；與雙氫青蒿素中劑量組比較，SS組TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，IL-1β、IL-6水平差異不大(P>0.05)；與雙氫青蒿素高劑量組比較，SS組TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著增高(P<0.05，見表2)。

2.4 雙氫青蒿素對大鼠創(chuàng)面組織MDA水平和SOD、CAT活性的影響

與sham組比較，模型組大鼠創(chuàng)面組織中MDA水平明顯升高，SOD、CAT活性明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，雙氫青蒿素低、中、高劑量組和SS組MDA水平明顯降低，SOD、CAT活性明顯升高(P<0.05)，且雙氫青蒿素各劑量組間MDA水平和SOD、CAT活性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。SS組與雙氫青蒿素低劑量組比較，MDA水平和SOD、CAT活性無明顯差異(P>0.05)；與雙氫青蒿素中、高劑量組比較，SS組MDA水平顯著升高，SOD、CAT活性顯著降低(P<0.05，見表3)。

圖2 各組大鼠創(chuàng)面組織病理變化 (HE，×200)Figure 2 Pathological changes of wound tissue of rats in each group (HE, ×200)

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平

表3 各組大鼠創(chuàng)面組織MDA水平和SOD、CAT活性

2.5 雙氫青蒿素對大鼠創(chuàng)面組織ERK/JNK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與sham組比較，模型組大鼠p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，雙氫青蒿素低、中、高劑量組和SS組p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK明顯降低(P<0.05)，且雙氫青蒿素各劑量組間p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。SS組與雙氫青蒿素低劑量組比較，p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK無明顯差異(P>0.05)；與雙氫青蒿素中、高劑量組比較，SS組p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK明顯升高(P<0.05，見圖3，表4)。

1. sham組；2.模型組；3.雙氫青蒿素低劑量組；4.雙氫青蒿素中劑量組；5.雙氫青蒿素高劑量組；6.SS組圖3 各組大鼠創(chuàng)面組織p-ERK、ERK1/2、p-JNK、JNK蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of p-ERK, ERK1/2, p-JNK and JNK proteins in wound tissues of rats in each group

表4 各組大鼠創(chuàng)面組織p-ERK、ERK1/2、p-JNK、JNK蛋白表達(dá)

3 討論

燒傷是一種常見的外傷性損傷，具有很高的發(fā)病率和死亡率[2]。為了促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合，防止感染和傷口向更深的皮膚層發(fā)展，充分的燒傷創(chuàng)面護(hù)理是必要的[10]。因此，尋找有效的治療燒傷的藥物是極其重要的。

皮膚在被燒傷后，創(chuàng)面部位會發(fā)生炎癥反應(yīng)，組織中出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，表面伴有炎性滲出液[11]。炎性滲出液對創(chuàng)面愈合有一定作用，它能夠稀釋創(chuàng)面組織中的致炎因子和毒素、帶走炎癥灶內(nèi)代謝物，并且滲出液中有抗體、溶菌素等物質(zhì)，幫助減少創(chuàng)面部位病原體或毒素，然而滲出液的主要成分是水，在創(chuàng)面部位長期存在會引起組織水腫，反而會加重?fù)p傷，影響愈合[12,13]。有報道稱，雙氫青蒿素具有較好的抗炎作用[6,7]。但是，目前尚無其在治療燒傷方面的研究。因此，本研究通過建立大鼠燒傷模型，觀察雙氫青蒿素對大鼠燒傷創(chuàng)面愈合的影響。結(jié)果顯示，燒傷大鼠創(chuàng)面在藥物處理14，21 d時，雙氫青蒿素低、中、高劑量組與模型組比較，大鼠創(chuàng)面部位基本無炎性滲出，脫痂明顯，且新生背毛生長趨勢良好，組織恢復(fù)速度明顯加快；另外，創(chuàng)面愈合率也顯著提高。這提示，雙氫青蒿素能夠幫助提高大鼠燒傷創(chuàng)面愈合的速度、縮短愈合時間，并且對創(chuàng)面愈合有促進(jìn)作用。

皮膚燒傷會導(dǎo)致組織細(xì)胞受損，而細(xì)胞受損會促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-6等大量炎癥介質(zhì)產(chǎn)生[14]，這些炎癥介質(zhì)又能反作用于細(xì)胞，激活炎癥信號通路，導(dǎo)致更多炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)，減緩創(chuàng)面愈合速度和時間[15]。皮膚燒傷會引起組織水腫，造成組織缺氧，引起細(xì)胞正常能量代謝失衡，大量自由基產(chǎn)生，促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生。過量自由基會破壞細(xì)胞正常組織，如活性氧能夠與細(xì)胞膜脂質(zhì)相結(jié)合，產(chǎn)生MDA等有毒物質(zhì)[16,17]。另外，氧化應(yīng)激反應(yīng)會抑制如SOD、CAT等抗氧化酶活性，引起氧化抗氧化失衡加重，促進(jìn)氧化應(yīng)激病理過程持續(xù)進(jìn)行[18]。炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)二者存在相輔相成、相互促進(jìn)的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，與sham組比較，模型組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高，創(chuàng)面組織MDA水平升高，SOD和CAT活性明顯降低；而與模型組比較，雙氫青蒿素低、中、高劑量組TNF-α等炎癥因子及MDA水平明顯降低，SOD和CAT活性明顯升高，這與雙氫青蒿素在小鼠銀屑病樣皮膚炎癥中的抗炎作用一致[19]。這提示，雙氫青蒿素能夠抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕組織損傷，促進(jìn)大鼠創(chuàng)面愈合。

MAPK是細(xì)胞最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、胞質(zhì)功能調(diào)控等方面均有重要作用[20,21]。ERK、JNK是MAPK的重要組成部分，研究顯示二者被激活與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激存在密切聯(lián)系[22,23]。磷酸化ERK1/2和JNK水平的下調(diào)有助于燒傷皮膚瘢痕疙瘩的形成[24]。本研究結(jié)果顯示，與sham組比較，模型組大鼠創(chuàng)面組織中ERK1/2和JNK磷酸化蛋白表達(dá)明顯升高；而雙氫青蒿素低、中、高劑量組與模型組比較，ERK1/2和JNK磷酸化蛋白表達(dá)明顯降低，這與上述研究一致。說明雙氫青蒿素可能通過減少ERK1/2和JNK磷酸化蛋白表達(dá)，抑制ERK/JNK通路激活，減少炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，減輕炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而利于燒傷創(chuàng)面愈合。然而，本研究僅初步探討了雙氫青蒿素能夠抑制ERK1/2和JNK的磷酸化水平，但其是否通過抑制ERK/JNK信號通路發(fā)揮治療作用還需進(jìn)一步研究，后續(xù)將通過通路激活劑的干預(yù)驗證本研究的結(jié)果。

綜上所述，雙氫青蒿素對大鼠創(chuàng)面愈合具有促進(jìn)作用，其可能的機制是：雙氫青蒿素能夠通過降低ERK1/2和JNK磷酸化蛋白表達(dá)，抑制ERK/JNK信號通路活化，從而減少TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，同時能夠提高SOD和CAT抗氧化酶活性，幫助維持氧化與抗氧化平衡，減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合。