長鏈非編碼RNA SRGAP3-AS2異常表達(dá)通過Janus激酶信號調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌侵襲和遷移

李新 蓋慧榮 宋蕾 張忠法

長鏈非編RNA(long noncoding RNA,LncRNA)與包括肺癌的多種腫瘤發(fā)生發(fā)展，侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，發(fā)揮重要致癌或抑癌作用[1-2]。SRGAP3反義RNA 2(SRGAP3 antisense RNA 2,SRGAP3-AS2)是一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA分子，Yang等[3]通過芯片分析發(fā)現(xiàn),肺腺癌組織中SRGAP3-AS2表達(dá)缺失，提示其在肺癌進(jìn)展中可能發(fā)揮積極作用，但SRGAP3-AS2在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的功能未知。Janus激酶/轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)信號通路持續(xù)激活可促進(jìn)腫瘤惡性轉(zhuǎn)化[4]。調(diào)控JAK/STAT軸可調(diào)控NSCLC腫瘤活性[5-7]。但SRGAP3-AS2是否通過JAK/STAT信號通路影響NSCLC進(jìn)程尚未知。本研究擬分析過表達(dá)SRGAP3-AS2介導(dǎo)JAK/STAT信號對NSCLC增殖、遷移和侵襲的影響。

對象與方法

一、對象

取2019年1月～2021年12月在我院經(jīng)外科手術(shù)治療的63例NSCLC病人的腫瘤組織及癌旁組織。人正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B和人NSCLC細(xì)胞株(H1650、H1975、H1299、A549和H23)均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。試劑：LipofectamineTM 3000轉(zhuǎn)染試劑(美國賽默飛公司)；qRT-PCR熒光定量試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自大連寶生物有限公司；MTT試劑盒和蛋白定量試劑盒均購自南京曼夫特生物科技有限公司；兔源一抗GAPDH、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotinase,MMP-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Janus激酶2(Janus kinase,JAK2)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription,STAT3)和HRP標(biāo)記的二抗均購自美國Abcam公司；SRGAP3-AS2過表達(dá)載體(通用生物技術(shù)有限公司)；JAK2激活劑Coumermycin A1(美國MCE公司)。

二、方法

1.細(xì)胞分組：構(gòu)建SRGAP3-AS2過表達(dá)載體pcDNA3.1-SRGAP3-AS2。取H23，將空載、過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞，即對照組、SRGAP3-AS2過表達(dá)組和SRGAP3-AS2過表達(dá)+JAK2激活劑組。

2.MTT實驗：酶標(biāo)儀測定細(xì)胞轉(zhuǎn)染0 小時、24 小時、48 小時和72 小時，吸光度值(OD490)。

3.劃痕實驗：記錄各組24 小時細(xì)胞劃痕。

4.Transwell小室實驗：記錄各組24 小時的侵襲細(xì)胞數(shù)。

5.qRT-PCR實驗：以qRT-PCR檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理48 小時的JAK通路相關(guān)因子RNA。SRGAP3-AS2：上游5'-CGTCATCCACACCACAGATCAG-3'，下游5'-TTGTTGGAGCCATCACAGCAC-3'。MMP-2：上游5'- TCTCCTGACATTGACCTTGGC-3'，下游5'- CAAGGTGCTGGCTGAGTAGATC-3'。Bcl-2：上游5'-TCGCCCTGTGGATGACTGAG-3'，下游5'-CAGAGTCTTCAGAGACAGCCAGGA 3'。GAPDH：上游5'-GCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'，下游5'-ACGACCAAATCCGTTGACTC-3'。

6.Western blot：以Western blot檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理48 小時的MMP-2、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

1.SRGAP3-AS2表達(dá)比較：癌旁組織SRGAP3-AS2表達(dá)為1.000±0.087，NSCLC組織為0.531±0.052，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.SRGAP3-AS2表達(dá)與NSCLC臨床病理特征關(guān)系見表1。以肺癌組織SRGAP3-AS2的中位表達(dá)水平為1.401，將病人分為SRGAP3-AS2低表達(dá)組和高表達(dá)組，結(jié)果表明，NSCLC組SRGAP3-AS2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P<0.05) 。

表1 SRGAP3-AS2表達(dá)與NSCLC臨床病理特征關(guān)系(例)

3.SRGAP3-AS2在NSCLC細(xì)胞表達(dá)：SRGAP3-AS2在H1650的表達(dá)為0.87±0.03，H1975的表達(dá)為0.78±0.04，H1299的表達(dá)為0.61±0.03，A549的表達(dá)為0.49±0.03，H23的表達(dá)為0.41±0.02，與BEAS-2B細(xì)胞表達(dá)(1.00±0.03)比較，均呈低表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。選擇H23細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

4.SRGAP3-AS2轉(zhuǎn)染驗證：對照組SRGAP3-AS2為1.028±0.063，過表達(dá)組為52.417±0.503，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

5.SRGAP3-AS2通過JAK信號抑制NSCLC細(xì)胞增殖：與對照組比較，SRGAP3-AS2過表達(dá)組細(xì)胞活力減弱(48 h和72 h，P<0.05)；與SRGAP3-AS2過表達(dá)比，SRGAP3-AS2過表達(dá)+JAK2激動劑組細(xì)胞活力增強(48 小時和72 小時，P<0.05)。見表2。

表2 SRGAP3-AS2通過JAK信號抑制NSCLC細(xì)胞增殖

6.SRGAP3-AS2通過JAK信號抑制肺癌細(xì)胞的遷移：對照組細(xì)胞劃痕愈合率為(78.67±3.26)%，SRGAP3-AS2過表達(dá)組為(45.20±2.43)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SRGAP3-AS2過表達(dá)+JAK2激動劑組細(xì)胞劃痕愈合率為(81.47±3.81)%，與SRGAP3-AS2過表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 SRGAP3-AS2通過JAK信號抑制H23細(xì)胞的遷移(×100)

7.SRGAP3-AS2通過JAK信號抑制肺癌細(xì)胞的侵襲：對照組細(xì)胞侵襲數(shù)為285.33±5.36，SRGAP3-AS2過表達(dá)組為112.67±6.49，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SRGAP3-AS2過表達(dá)+JAK2激動劑組為281.33±5.78，與SRGAP3-AS2過表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

A.對照組;B.SRGAP3-AS2過表達(dá)組;C.SRGAP3-AS2過表達(dá)+JAK2激動劑組圖2 SRGAP3-AS2通過JAK信號抑制H23細(xì)胞的侵襲(結(jié)晶紫染色×100)

8.SRGAP3-AS2影響JAK通路相關(guān)因子表達(dá)：與對照組比較，SRGAP3-AS2過表達(dá)組MMP-2和Bcl-2的mRNA及蛋白、JAK2和STAT3的蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；與SRGAP3-AS2過表達(dá)比，SRGAP3-AS2過表達(dá)+JAK2激動劑組MMP-2和Bcl-2的mRNA及蛋白、JAK2和STAT3的蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) 。見表3。

表3 SRGAP3-AS2影響JAK通路相關(guān)因子表達(dá)

討論

NSCLC的預(yù)后較差，5年總生存率(overall survival,OS)僅為19.8%[8-9]。目前，關(guān)于NSCLC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的確切分子機(jī)制尚不清楚，了解NSCLC潛在分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及鑒定潛在治療靶標(biāo)和預(yù)后生物標(biāo)志物對延長病人生存至關(guān)重要[10-11]。LncRNA可作為生物標(biāo)志物在包括NSCLC在內(nèi)的各種惡性腫瘤的診治和預(yù)后中發(fā)揮重要作用。盡管已有LncRNA在NSCLC作用的相關(guān)報道，然而NSCLC中LncRNA的功能和表達(dá)相對較少。

本研究顯示，NSCLC組織中SRGAP3-AS2呈低表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，同時SRGAP3-AS2在不同的NSCLC細(xì)胞株均呈低表達(dá)。與文獻(xiàn)報道一致[3]。Jin等[12]通過整合GEO數(shù)據(jù)庫中兩個數(shù)據(jù)集(GSE70880和GSE113852)，構(gòu)建競爭性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)，識別肺腺癌中潛在診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)SRGAP3-AS2處于網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的關(guān)鍵中心節(jié)點，具有較高的肺腺癌診斷預(yù)測價值。本研究顯示過表達(dá)SRGAP3-AS2顯著促進(jìn)了H23細(xì)胞增殖、侵襲與遷移，抑制了Bcl-2和MMP-2的mRNA及蛋白表達(dá)，同時抑制JAK2和STAT3表達(dá)。

報道顯示，22%～65%的 NSCLC病人STAT蛋白受到JAK激活發(fā)生磷酸化[13]。JAK/STAT信號通路通過激活關(guān)鍵促轉(zhuǎn)移基因，促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。在正常細(xì)胞中，STAT激活受到限制，但當(dāng)STAT被激活，可誘發(fā)相關(guān)調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、運動、血管生成和免疫逃逸基因異常表達(dá)，影響NSCLC進(jìn)展，提示增強SRGAP3-AS2表達(dá)明顯抑制JAK2/STAT3信號軸活性[14]。進(jìn)一步，SRGAP3-AS2過表達(dá)+JAK2激活劑Coumermycin A1處理H23細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均強于SRGAP3-AS2過表達(dá)處理組，Bcl-2和MMP-2上調(diào)，說明JAK2激活劑逆轉(zhuǎn)了SRGAP3-AS2過表達(dá)對H23細(xì)胞增殖、遷移和侵襲產(chǎn)生的抑制作用，SRGAP3-AS可介導(dǎo)JAK/STAT抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

綜上，NSCLC組織SRGAP3-AS2呈低表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，過表達(dá)SRGAP3-AS2可抑制JAK2/STAT3信號，抑制NSCLC細(xì)胞H23增殖、遷移和侵襲。