二區(qū)近紅外熒光顯像技術(shù)在外科領(lǐng)域的應(yīng)用進展

宓嘉輝 周健 楊帆

熒光顯像技術(shù)是生物實時顯像領(lǐng)域非常重要的技術(shù)手段。與傳統(tǒng)的放射顯像技術(shù)相比，熒光顯像因其具有更高的安全性和分辨率而具有突出優(yōu)勢[1]。對于熒光顯像技術(shù)而言，需要其具備對深部結(jié)構(gòu)的成像能力以及更高的信背比(signal-to-background ratio,SBR)才能更好地協(xié)助外科醫(yī)師在術(shù)中實時識別特定目標組織結(jié)構(gòu)[2]。然而，光子在穿過人體組織的過程中會發(fā)生吸收和散射現(xiàn)象，對于波長較短的可見光(400～700 nm)，光子很難穿過人體組織從而導(dǎo)致無法實現(xiàn)深部組織結(jié)構(gòu)的實時顯像[3]。此外，人體組織本身存在自發(fā)熒光現(xiàn)象，當(dāng)組織自發(fā)熒光與目標組織結(jié)構(gòu)的熒光信號相互重合覆蓋時，會導(dǎo)致SBR明顯降低。這些因素使得采用可見光波段實現(xiàn)術(shù)中實時顯像存在一定限制[4]。相較于可見光，近紅外熒光由于其具有更長的波長，光子在人體組織中的吸收和散射有所降低。雖然已有相關(guān)研究表明，一區(qū)近紅外(near-infrared-Ⅰ window,NIR-Ⅰ,700～900 nm)熒光可以更好地穿透生物組織，如皮膚和脂肪等，但NIR-Ⅰ熒光顯像對深層組織的成像質(zhì)量仍需進一步提高[5]。

二區(qū)近紅外(near-infrared-Ⅱ window,NIR-Ⅱ,1 000～1 700 nm)熒光顯像技術(shù)被認為可以進一步提升熒光顯像的穿透深度以及分辨率[6]。隨著銦砷化鎵(InGaAs)相機的快速發(fā)展，NIR-Ⅱ熒光顯像的效果有了顯著的提高，為臨床轉(zhuǎn)化提供了幫助[7]。此外，除了傳統(tǒng)熒光染料吲哚菁綠(indocyanine green,ICG)已被證實適用于NIR-Ⅱ熒光顯像，一系列新型NIR-Ⅱ熒光探針也已經(jīng)被開發(fā)并利用，其中包括有機小分子，單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes,SWCNTs)，稀土納米顆粒(rare-earth-doped nanoparticles,RENPs)，半導(dǎo)體量子點(quantum dots,QDs)以及共軛聚合物等各類材料[3]。該技術(shù)可以進行術(shù)中目標組織結(jié)構(gòu)的實時準確識別定位，促進外科手術(shù)朝著更加精準化的方向發(fā)展。本文將圍繞NIR-Ⅱ熒光顯像技術(shù)在外科領(lǐng)域的應(yīng)用進行綜述，并對該技術(shù)的下一步發(fā)展前景展開討論。

一、實體腫瘤顯像

在外科領(lǐng)域，NIR-Ⅱ熒光應(yīng)用最廣泛的是實體腫瘤的術(shù)中實時顯像。實現(xiàn)實體腫瘤NIR-Ⅱ熒光顯像的熒光探針主要分為兩類，一類是以ICG為代表的可以在腫瘤位置發(fā)生聚集，從而實現(xiàn)實體瘤實時顯像的非特異性熒光染料；另一類是根據(jù)不同腫瘤特異性表達靶點，采用與之相對應(yīng)的靶向受體與NIR-Ⅱ熒光染料相結(jié)合所構(gòu)成的NIR-Ⅱ靶向熒光探針[8]。

ICG作為一種已被批準用于臨床的非特異性靶向熒光染料，表現(xiàn)出了優(yōu)越的實體腫瘤顯像效果[9]。Hu等[10]首次將NIR-Ⅱ熒光應(yīng)用于肝癌手術(shù)實時顯像,結(jié)果顯示，NIR-Ⅱ熒光對于肝癌主病灶的顯像效果較傳統(tǒng)顯像方法有明顯提升，并且利用NIR-Ⅱ熒光顯像可以在術(shù)中發(fā)現(xiàn)術(shù)前未明確診斷的額外微小肝癌病灶。該研究還證實了NIR-Ⅱ熒光在生物組織中的穿透能力顯著提升。此外，一些新型的非特異性NIR-Ⅱ熒光探針也被成功制備并被證明可以在實體腫瘤顯像中取得相較于ICG更好的顯像效果[11-12]。

一般認為，采用非特異性熒光染料進行實體腫瘤術(shù)中顯像是通過腫瘤組織的高通透性和滯留(enhanced permeability and retention，EPR) 效應(yīng)所實現(xiàn)[13-14]，即腫瘤區(qū)域新生的血管結(jié)構(gòu)完整性較差，淋巴引流受損而導(dǎo)致大分子物質(zhì)可以順利地在腫瘤組織中富集[15]。然而，最新的研究提示，大分子在腫瘤區(qū)域的富集可能不僅僅是由于EPR效應(yīng)所導(dǎo)致[16]。在臨床實踐中也可以觀察到，采用非特異性熒光染料實現(xiàn)NIR-Ⅱ熒光顯像，雖然可以對絕大部分實體瘤展現(xiàn)出良好的顯像效果，但其對于某些腫瘤顯像效果不佳，甚至有可能出現(xiàn)假陽性的顯像結(jié)果[10]，而NIR-Ⅱ靶向熒光探針有可能進一步解決以上問題。

尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(urokinase plasminogen activator receptor,uPAR) 已被證實在膠質(zhì)母細胞瘤中存在過表達的現(xiàn)象[17]。Kurbegovic等[18]利用uPAR特異性多肽(AE105)與NIR-Ⅱ熒光團相結(jié)合制作出了新型NIR-Ⅱ靶向熒光探針，實現(xiàn)了膠質(zhì)母細胞瘤的特異性實時顯像。通過這種方法，外科醫(yī)師可以在術(shù)中實時觀測腫瘤的位置，并且可以根據(jù)熒光顯像情況明確腫瘤的邊界從而保證腫瘤的完整切除。目前，已有多種針對不同腫瘤高表達物質(zhì)為目標而設(shè)計的NIR-Ⅱ靶向熒光探針實現(xiàn)了優(yōu)異的NIR-Ⅱ熒光顯像效果[19-20]。

二、前哨淋巴結(jié)示蹤

前哨淋巴結(jié)(sentinel lymph nodes,SLN)是指區(qū)域淋巴引流區(qū)中最先接受腫瘤淋巴引流并發(fā)生轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)[21]。術(shù)中準確識別前哨淋巴結(jié)并對其性質(zhì)進行判斷可以指導(dǎo)下一步手術(shù)及治療方案[22]。在臨床實踐中，外科醫(yī)師需要借助特別的顯影劑或染料實現(xiàn)前哨淋巴結(jié)術(shù)中顯像。以往使用的以放射性元素標記的探針雖然可以有效地實現(xiàn)前哨淋巴結(jié)顯像[23]，但放射性元素發(fā)出的輻射會對病人及醫(yī)護人員造成傷害，并且不同醫(yī)院對放射性物質(zhì)的使用與管理模式不同，也使其應(yīng)用受限。亞甲藍等染料雖然價格便宜且不具有放射性[24]，但對前哨淋巴結(jié)檢測的敏感性較低，術(shù)中也難以協(xié)助外科醫(yī)師定位深部前哨淋巴結(jié)[25]。盡管采用NIR-Ⅰ熒光進行前哨淋巴結(jié)顯像可以在一定程度上解決以上問題[26-27],但NIR-Ⅰ熒光由于對組織的穿透深度有限，通常需要外科醫(yī)師盡可能清除表面組織才能明確地觀察到前哨淋巴結(jié)[28]。

目前，研究人員嘗試利用具有更強穿透能力以及更高SBR的NIR-Ⅱ熒光顯像實現(xiàn)前哨淋巴結(jié)定位。Fan等[29]開發(fā)了一種新型有機納米探針(IDSe-IC2F)，并通過該探針進行了NIR-Ⅱ熒光顯像指導(dǎo)下的淋巴結(jié)顯像和切除。研究人員將IDSe-IC2F注射到小腸淋巴濾泡中，并在793 nm的激光照射下，根據(jù)組織發(fā)出的NIR-Ⅱ熒光信號實現(xiàn)了淋巴結(jié)和淋巴管的準確定位。該方法不僅可以明確前哨淋巴結(jié)的位置，還可以判斷淋巴結(jié)清除后是否存在殘留。此外，不同研究人員已開發(fā)出多種不同類型的NIR-Ⅱ熒光探針，均可實現(xiàn)對于前哨淋巴結(jié)準確且高效的顯像[19,30-32]。

三、血管的顯像

臨床上多使用術(shù)前影像學(xué)檢查以及術(shù)中探查判斷病人手術(shù)部位重要血管的位置和走向。但是，在腫瘤的壓迫或粘連導(dǎo)致無法準確判斷血管位置的情況下，醫(yī)源性血管損傷風(fēng)險會顯著增高。此外，傳統(tǒng)的注射造影劑后在X射線下進行血管顯像的方法仍存在諸多不足：首先，該方法需要在X線照射下完成，會使得病人及醫(yī)護人員長時間在輻射中暴露；其次，成像時間短、造影劑具有人體毒性等因素也導(dǎo)致該方法無法滿足外科手術(shù)需求。最新的研究結(jié)果顯示，采用近紅外熒光血管顯像技術(shù)可以很好地解決以上問題。

Carr等[33]通過向小鼠靜脈注射ICG的方法在動物模型上實現(xiàn)了NIR-Ⅱ熒光血管顯像。該研究發(fā)現(xiàn)，NIR-Ⅱ熒光可以清晰顯示腦血管在皮膚以及顱骨下的位置和走向，并且相較于傳統(tǒng)的NIR-Ⅰ熒光，NIR-Ⅱ熒光可以顯著提高血管顯像的SBR以及分辨率。通過制備新型的NIR-Ⅱ熒光探針，Sun等[34]進一步提升了NIR-Ⅱ熒光下血管顯像效果。而Wan等[35]制備的高亮度NIR-Ⅱ熒光探針甚至可以對直徑5～7 μm的血管實現(xiàn)清晰顯像。

Mi等[36]首次在人體內(nèi)使用NIR-Ⅱ熒光血管顯像技術(shù)成功實現(xiàn)了鎖骨下動靜脈的實時顯像，并且在該方法的幫助下完成了復(fù)雜縱隔腫瘤的完整切除。研究人員針對一例縱隔腫瘤與鎖骨下動靜脈關(guān)系緊密的病人，在術(shù)中經(jīng)病人左側(cè)橈靜脈內(nèi)注射25 mg(5 mg/ml)ICG，并采用NIR-Ⅱ熒光顯像設(shè)備對腫物與鎖骨下動靜脈進行顯像，結(jié)果顯示，鎖骨下靜脈和鎖骨下動脈分別在ICG注射后的3秒和17秒后開始清晰顯像。術(shù)者在NIR-Ⅱ熒光血管顯像的幫助下清晰地辨別了已經(jīng)偏離了正常解剖位置的鎖骨下動靜脈的走行與邊界，在完整切除腫瘤的同時避免了重要血管的損傷。

雖然使用ICG實現(xiàn)NIR-Ⅱ熒光血管顯像可以達到協(xié)助手術(shù)的目的，但ICG經(jīng)靜脈注射后在人體的半衰期仍然較短[37]。Li等[38]開發(fā)了一種新型的NIR-Ⅱ熒光探針(LZ-1105)，其在血液循環(huán)中的半衰期可達3.2小時，從而可以持續(xù)地保持血管的良好顯像。這對于需要長時間保持血管顯像的手術(shù)提供了可行的方案。

四、輸尿管及膽管顯像

醫(yī)源性輸尿管損傷是盆腔手術(shù)中嚴重的并發(fā)癥，輸尿管損傷后會導(dǎo)致輸尿管瘺或狹窄，嚴重者可造成感染甚至腎功能衰竭[39-40]。特別是當(dāng)輸尿管緊鄰盆腔腫瘤或病人既往接受過盆腔手術(shù)及放射治療后，外科醫(yī)生很難準確識別輸尿管的位置，導(dǎo)致輸尿管損傷的可能性大大增加[41]。Du等[42]設(shè)計了一種聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aggregation-induced emission,AIE)物質(zhì)，通過向輸尿管內(nèi)注射該熒光物質(zhì)并通過NIR-Ⅱ熒光顯像，可以準確顯示出輸尿管的位置和走向。此外，如果出現(xiàn)輸尿管損傷，該方法還可以準確評估損傷位置，以便及時處理。

與輸尿管顯像類似，在肝膽外科領(lǐng)域，解剖變異或炎癥等因素同樣會導(dǎo)致醫(yī)生很難在術(shù)中準確識別膽管的位置[43]。有學(xué)者提出術(shù)前靜脈注射ICG實現(xiàn)術(shù)中NIR-Ⅰ熒光膽管顯像的方法[44-45]，但采用該方法肝臟的熒光背景會嚴重影響膽管的實時顯像[46]。Wu等[47]采用NIR-Ⅱ熒光對膽管進行實時顯像并與NIR-Ⅰ熒光進行對比，結(jié)果顯示，NIR-Ⅱ熒光可以顯著降低背景信號并具有更強的組織穿透能力。此外，NIR-Ⅱ熒光可以在小鼠膽管狹窄、穿孔以及橫斷模型中提供更多的組織結(jié)構(gòu)信息，進一步改善了膽管以及病變位置的顯像效果。

五、總結(jié)與展望

目前，NIR-Ⅱ熒光顯像技術(shù)已經(jīng)開始了從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的快速轉(zhuǎn)化。與傳統(tǒng)熒光顯像方法相比，NIR-Ⅱ熒光顯像在不同外科場景中不僅能實現(xiàn)更深的顯像深度，而且可以更好地減少背景干擾，提升顯像效果?？傮w來看，目前已經(jīng)應(yīng)用到臨床的NIR-Ⅱ熒光染料仍然是傳統(tǒng)的ICG。雖然ICG并不是NIR-Ⅱ熒光顯像的最佳顯影劑，但ICG通過第二發(fā)射峰同樣可以在NIR-Ⅱ熒光顯像中發(fā)揮很好的效果，這也極大地鼓舞了NIR-Ⅱ熒光顯像領(lǐng)域研究人員的信心[10]。迄今為止，已有許多研究團隊成功合成并制備了各類有機或無機NIR-Ⅱ熒光探針，盡管一部分新型NIR-Ⅱ熒光探針已被驗證可以在成功顯影的條件下保證生物安全性，但目前尚無被批準可應(yīng)用于臨床的新型NIR-Ⅱ熒光探針。相信隨著技術(shù)的發(fā)展與人體安全性實驗的不斷嘗試，在不久的將來一定會有新型NIR-Ⅱ熒光探針可以被廣泛應(yīng)用于臨床。除此之外，NIR-Ⅱ熒光作為既往傳統(tǒng)顯像方法的發(fā)展和延伸，可以將該方法與傳統(tǒng)顯像方法相結(jié)合，進一步實現(xiàn)多模態(tài)成像，為外科醫(yī)師提供更加全面且細致的生物學(xué)信息，使外科手術(shù)獲益?？傊?，NIR-Ⅱ熒光顯像作為一種新型的術(shù)中顯像方法已經(jīng)得到了越來越多基礎(chǔ)學(xué)科研究人員與外科醫(yī)師的關(guān)注與認可，其不斷的探索必將會促進整個外科手術(shù)領(lǐng)域的進一步發(fā)展。