亞致死濃度吡蟲啉和毒死蜱對(duì)柑橘木虱成蟲組織蛋白酶基因表達(dá)的影響

舒本水，鄒 燕，張婉瑩，馮 杰，吳仲真，林進(jìn)添

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院/廣州市亞熱帶果樹重大疫情控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510225)

柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama屬于半翅目Hemiptera木虱科Psyllidae昆蟲，是一種全球性的重要柑橘害蟲。其為害柑橘的方式多種多樣，其中最主要的為害方式是作為韌皮部桿菌屬類細(xì)菌-柑橘黃龍病菌Candidatusliberibacterspp.的傳播媒介，引起柑橘黃龍病(Huanglongbing)在柑橘植株間的傳播與流行，對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失(Bové,2006)。柑橘木虱高齡若蟲及成蟲取食帶毒植株韌皮部汁液后均能獲取黃龍病菌，且病原菌能夠在柑橘木虱體內(nèi)進(jìn)行繁殖(Arpetal.,2016;江宏燕等,2018)。成蟲帶毒后轉(zhuǎn)株為害時(shí)將黃龍病菌通過口針注入健康植株韌皮部，導(dǎo)致病菌在植株間傳播(陳夢(mèng)瑤等,2019;王飛鳳等,2020)。黃龍病菌侵染植物后初期樹冠新梢葉片出現(xiàn)黃化、班駁等癥狀，隨后植物生長(zhǎng)勢(shì)衰退，水果品質(zhì)下降，產(chǎn)量銳減，壽命縮短，最終整株死亡(Kishketal.,2017;烏天宇等,2020)。此外，柑橘木虱還能通過直接取食植物韌皮部汁液造成植物營(yíng)養(yǎng)丟失；排泄蜜露于植物葉片誘發(fā)霉菌生長(zhǎng)及阻礙植物光合作用等方式影響柑橘的正常生長(zhǎng)發(fā)育(舒本水等,2020)。由于尚未發(fā)現(xiàn)針對(duì)柑橘黃龍病菌特效藥，因此通過控制柑橘木虱種群數(shù)量以減緩黃龍病的傳播是當(dāng)前全球范圍內(nèi)防治柑橘黃龍病最主要的方法之一(Grafton-Cardwelletal.,2013)。而目前控制柑橘木虱數(shù)量發(fā)生最為直接有效的方法是化學(xué)防治。生產(chǎn)上最常用的化學(xué)殺蟲劑包括有機(jī)磷類、新煙堿類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、阿維菌素類及一些生物源農(nóng)藥(田發(fā)軍等,2018)。在殺蟲劑的施用過程中，除直接殺死靶標(biāo)害蟲外，由于害蟲個(gè)體接觸藥劑劑量的差異、時(shí)間推移及環(huán)境因素引起的農(nóng)藥降解導(dǎo)致部分存活個(gè)體表現(xiàn)出亞致死效應(yīng)，其在生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖以及抗藥性等方面均會(huì)發(fā)生顯著變化(宋亮等,2003;李志雄等,2020)。在農(nóng)藥亞致死濃度脅迫下，害蟲常通過調(diào)控自身的生理生化反應(yīng)等策略進(jìn)行響應(yīng)(張莉婭等,2021)。

組織蛋白酶(Cathespins)是一類存在于溶酶體中的胞內(nèi)蛋白酶，最初以酶原的形式在核糖體合成，隨后被鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體并通過糖基化和磷酸化形成甘露糖-6-磷酸蛋白，然后被溶酶體上的甘露糖-6-磷酸特異性受體識(shí)別，轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體中，在酸性環(huán)境下水解成為具有活性的成熟組織蛋白酶(潘光照,2018)。根據(jù)活性中心氨基酸殘基可將組織蛋白酶分為3大類：半胱氨酸蛋白酶(包括組織蛋白酶B、F、H、L、K、O、S、T、V、X和W)，天冬氨酸蛋白酶(組織蛋白酶D和E)以及絲氨酸蛋白酶(組織蛋白酶A和G)(Sunetal.,2018)。目前在多種昆蟲中已鑒定出不同種類的組織蛋白酶，進(jìn)一步功能分析發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶屬于多功能蛋白酶系，在昆蟲蛋白降解、生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)不利刺激等多個(gè)生理過程中具有重要作用(Saikhedkaretal.,2015)。例如：黑腹果蠅Drosophilamelanogaster組織蛋白酶B在胚胎發(fā)育過程中參與卵黃蛋白的降解；而組織蛋白酶L可能參與食物蛋白消化(Medinaetal.,1988;Matsumotoetal.,1995)。棉鈴蟲Helicoverpaarmigera組織蛋白酶HaCat L被證實(shí)通過裂解激活Ha-caspase-1促進(jìn)中腸細(xì)胞凋亡，進(jìn)而參與棉鈴蟲變態(tài)發(fā)育過程幼蟲中腸降解以及蛹和成蟲中腸重建(Yangetal.,2017)。家蠶Bombyxmori化蛹過程中蛻皮激素20E上調(diào)組織蛋白酶BmCatB，BmCatD，BmCatL1和BmCatL2的表達(dá)，加速脂肪體的破壞(Guoetal.,2018)。家蠶和柞蠶Antheraeapernyi組織蛋白酶O參與對(duì)大腸桿菌Escherichiacoli的應(yīng)激反應(yīng)，推測(cè)其在兩種昆蟲的先天免疫系統(tǒng)中具有重要作用(Zhangetal.,2015;Sunetal.,2017)。

目前柑橘木虱中已鑒定出多種組織蛋白酶，如DcCath-B，DcCath-L，DcCath-L1和DcCath-O等。時(shí)空表達(dá)分析結(jié)果表明DcCathB在若蟲、成蟲期及腸道組織中高表達(dá)，推測(cè)其可能具有消化功能(Ferraraetal.,2015)。而DcCath-L和DcCath-O同樣被證實(shí)在中腸組織中高表達(dá)。采用熱殺死的兩種細(xì)菌(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus)及黃龍病菌CLas侵染木虱后DcCath-L和DcCath-O基因表達(dá)量顯著上調(diào)，推測(cè)兩種組織蛋白酶可能參與柑橘木虱免疫反應(yīng)(Yuetal.,2019)。DcCath-L1在卵中的表達(dá)量高于若蟲和成蟲，推測(cè)其可能參與胚胎發(fā)育。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)4種重組的柑橘半胱氨酸蛋白酶抑制劑中CsinCPI-2對(duì)DcCath-L1活性抑制效果最強(qiáng)(Ferraraetal.,2020)。吡蟲啉和毒死蜱是柑橘園中應(yīng)用較廣的殺蟲劑，目前尚未報(bào)道吡蟲啉和毒死蜱對(duì)柑橘木虱組織蛋白酶的影響相關(guān)研究。為明確農(nóng)藥亞致死濃度對(duì)柑橘木虱組織蛋白酶基因的影響，本研究選用吡蟲啉和毒死蜱作為供試藥劑，通過生物活性測(cè)定方法得到兩種藥劑的亞致死濃度，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定得到柑橘木虱組織蛋白酶家族基因，熒光定量PCR比較分析兩種藥劑亞致死濃度對(duì)柑橘木虱多種組織蛋白酶基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量的影響，為進(jìn)一步探究昆蟲組織蛋白酶基因功能提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試柑橘木虱成蟲

本實(shí)驗(yàn)使用的柑橘木虱成蟲為實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)種群，以九里香Murrayaexotica植株為其寄主植物進(jìn)行長(zhǎng)期飼養(yǎng)并未接觸化學(xué)藥劑，飼養(yǎng)條件：溫度25±1℃，相對(duì)濕度65%±5%，光周期12 h ∶12 h。

1.2 供試試劑及主要儀器

吡蟲啉原藥來源于佛山盈輝作物科學(xué)有限公司；毒死蜱原藥(97%)來源于浙江東風(fēng)化工有限公司；RNAiso plus購(gòu)于TaKaRa公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒FastKing RT Kit(With gDNase)購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；熒光定量PCR SuperMix購(gòu)于TransGen Biotech公司；人工氣候箱購(gòu)于上海莫托斯科學(xué)儀器有限公司，熒光定量PCR儀購(gòu)于Roche公司。

1.3 室內(nèi)毒力測(cè)定

將兩種原藥采用丙酮進(jìn)行溶解，用含有0.05% Triton X-100的無菌水分別稀釋為6個(gè)濃度梯度(25，50，100，150，200和250 mg/L)。取新鮮的九里香枝條洗凈后侵入藥液中10 s后取出，室溫晾干1 h。將晾干的九里香枝條固定于9 cm培養(yǎng)皿中，采用吸水的棉花保濕并置于直徑約10 cm，高7.3 cm的圓形塑料盒中。然后再每盒接入50頭柑橘木虱成蟲，每個(gè)濃度進(jìn)行3次重復(fù)。24 h后體視鏡下檢查成蟲死亡情況，毛筆輕觸蟲體無活動(dòng)則視為死亡。采用Probit軟件進(jìn)行毒力曲線構(gòu)建并計(jì)算LC20和LC50值。

1.4 亞致死濃度處理柑橘木虱成蟲

具體處理方法同步驟1.3。采用吡蟲啉和毒死蜱LC20和LC50濃度處理柑橘木虱成蟲24 h，以含有0.05% Triton X-100的無菌水處理的九里香枝條飼喂的柑橘木虱成蟲作為對(duì)照。處理24 h后收集存活的成蟲至新的離心管中，液氮速凍后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 柑橘木虱組織蛋白酶基因鑒定及序列分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行柑橘木虱組織蛋白酶基因搜索，同時(shí)對(duì)柑橘木虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast比對(duì)，鑒定出柑橘木虱組織蛋白酶基因。采用DNAMAN軟件對(duì)鑒定得到的柑橘木虱組織蛋白酶基因蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.6 RNA提取及cDNA合成

將1.4中收集的成蟲采用組織研磨器進(jìn)行研磨后加入RNAiso plus試劑進(jìn)行裂解，然后根據(jù)RNA提取說明書進(jìn)行柑橘木虱成蟲總RNA提取。采用Nano-100超微量分光光度計(jì)(ALLSHENG公司)測(cè)定各個(gè)樣品總RNA純度和濃度。選取等量的總RNA，采用FastKing RT Kit(With gDNase)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在PCR管中配制基因組DNA去除體系混合液：5×gDNA Buffer 2.0 μL，總RNA 2.0 μg，加RNase-Free ddH2O補(bǔ)足10.0 μL。42℃孵育2 min后冰上放置。然后配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系混合液：10×King RT Buffer 2.0 μL，F(xiàn)astKing RT Enzyme 1.0 μL，Mix FQ-RT Primer Mix 2.0 μL，加RNase-Free ddH2O補(bǔ)足10.0 μL。混勻后將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系混合液加入基因組DNA去除體系混合液中混勻，置于PCR儀中42℃，15 min，95℃，3 min孵育。合成的cDNA置于-20℃保存。

1.7 熒光定量PCR

根據(jù)所得的8個(gè)柑橘木虱組織蛋白酶核苷酸序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物并送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行合成。具體引物序列詳見表1。以上述合成的cDNA稀釋5倍作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。于384微孔PCR板上配置10.0 μL反應(yīng)體系：TransStart Tip Green qPCR SuperMix 5.0 μL，cDNA 1.0 μL，基因上下游引物各0.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足10.0 μL，混勻并簡(jiǎn)短離心后置于熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。每個(gè)cDNA模板設(shè)置 3個(gè)技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)條件為：95℃變性3 min；95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s循環(huán)45次；最后熔解曲線范圍為65℃～95℃。選取柑橘木虱EF1α(XM_008479903.1)和RPL13(DQ675552.1)作為內(nèi)參基因?qū)晒舛縋CR結(jié)果進(jìn)行校正，采用2-ΔΔCt法分析兩種化學(xué)藥劑亞致死濃度脅迫下柑橘木虱成蟲8種組織蛋白酶轉(zhuǎn)錄水平變化。

表1 本研究所用的引物序列信息Table 1 Sequence information of primers used in this study

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)”表示。采用SPSS 17.0軟件對(duì)組織蛋白酶表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，多重檢驗(yàn)法(DMRT法)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 吡蟲啉和毒死蜱對(duì)柑橘木虱成蟲的亞致死濃度測(cè)定

室內(nèi)毒力測(cè)試結(jié)果表明，吡蟲啉對(duì)柑橘木虱成蟲24 h的LC20和LC50值分別為14.19 mg/L和97.88 mg/L；毒死蜱對(duì)柑橘木虱成蟲的LC20和LC50值分別為3.73 mg/L和47.94 mg/L(表2)。

表2 吡蟲啉和毒死蜱對(duì)柑橘木虱成蟲的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果Table 2 Toxicity of imidacloprid and chlorpyrifos against Diaphorina citri adults

2.2 柑橘木虱組織蛋白酶氨基酸序列比對(duì)及發(fā)育進(jìn)化分析

通過Blast比對(duì)，本研究于柑橘木虱成蟲轉(zhuǎn)錄組及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中得到8個(gè)組織蛋白酶基因，分別為DcCath-B，DcCath-F，DcCath-H，DcCath-K，DcCath-L，DcCath-L1，DcCath-O和DcCath-W，均屬于半胱氨酸蛋白酶。其中DcCath-H來源于柑橘木虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，其他7個(gè)基因來源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)。序列分析發(fā)現(xiàn)7個(gè)組織蛋白酶基因均包含完整的編碼區(qū)，僅DcCath-W為部分序列。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明DcCath-B，DcCath-F，DcCath-H，DcCath-K，DcCath-L，DcCath-L1及DcCath-O均含有不同長(zhǎng)度的信號(hào)肽。同時(shí)7種組織蛋白酶均含有保守的組氨酸活性位點(diǎn)，且Cys-His-Asn(C-H-N)催化三聯(lián)體的氨基酸殘基在所有的組織蛋白酶中均高度保守(圖1)。

2.3 吡蟲啉亞致死濃度對(duì)柑橘木虱成蟲組織蛋白酶表達(dá)量的影響

吡蟲啉LC20和LC50濃度處理柑橘木虱成蟲24 h后檢測(cè)8種組織蛋白酶轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量變化。吡蟲啉亞致死濃度脅迫后，柑橘木虱成蟲4種組織蛋白酶DcCath-H，DcCath-K，DcCath-O和DcCath-W基因表達(dá)水平無顯著變化；而DcCath-B，DcCath-F，DcCath-L和DcCath-L1基因表達(dá)量顯著降低。其中LC20處理24 h后DcCath-B，DcCath-L和DcCath-L1表達(dá)量分別下調(diào)72.64%，18.67%和13.53%。LC50濃度處理柑橘木虱成蟲24 h后DcCath-B，DcCath-F，DcCath-L和DcCath-L1表達(dá)量分別下調(diào)64.65%，36.84%，15.27%和37.59%(圖2)。

圖2 吡蟲啉亞致死濃度對(duì)柑橘木虱成蟲組織蛋白酶基因表達(dá)水平的影響Fig.2 Effect of imidacloprid with sublethal concentration treatments on the mRNA expression level of eight cathepsins in Diaphorina citri adults注：CK，對(duì)照組；Im-LC20，吡蟲啉LC20濃度處理組；Im-LC50，吡蟲啉LC50濃度處理組。Note:CK,Control group;Im-LC20,Imidacloprid treatment group under LC20 concentration;Im-LC50,Imidacloprid treatment group under LC50 concentration.

2.4 毒死蜱亞致死濃度對(duì)柑橘木虱成蟲組織蛋白酶表達(dá)量的影響

毒死蜱LC20和LC50濃度處理柑橘木虱成蟲24 h后對(duì)8種組織蛋白酶mRNA水平表達(dá)量變化進(jìn)行檢測(cè)。毒死蜱亞致死濃度對(duì)柑橘木虱成蟲5種組織蛋白酶DcCath-F，DcCath-H，DcCath-K，DcCath-L1和DcCath-O基因水平表達(dá)量無顯著影響；而DcCath-B，DcCath-L和DcCath-W基因表達(dá)量顯著下調(diào)。其中LC20處理24 h后DcCath-B，DcCath-L和DcCath-WmRNA水平表達(dá)量分別下調(diào)73.47%，24.23%和34.37%。LC50濃度處理柑橘木虱成蟲24 h后DcCath-B表達(dá)量下調(diào)69.51%(圖3)。

圖3 毒死蜱亞致死濃度對(duì)柑橘木虱成蟲組織蛋白酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.3 Effect of chlorpyrifos with sublethal concentration treatments on the mRNA expression level of eight cathepsins in Diaphorina citri adults注：CK，對(duì)照組；Ch-LC20，毒死蜱LC20濃度處理組；Ch-LC50，毒死蜱LC50濃度處理組。Note:CK,Control group;Ch-LC20,Chlorpyrifos treatment group under LC20 concentration;I Ch-LC50,Chlorpyrifos treatment group under LC50 concentration.

3 結(jié)論與討論

柑橘木虱是柑橘黃龍病的主要傳播媒介，其種群擴(kuò)散對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重威脅。目前化學(xué)防治是防治柑橘木虱的主要手段之一(曹旭等,2020)。有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類、新煙堿類等廣譜性殺蟲劑以及應(yīng)用于滴灌及樹干施用的殺蟲劑是目前田間防控柑橘木虱的常用藥劑(Liuetal.,2020)。本研究采用新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉和有機(jī)磷類殺蟲劑毒死蜱對(duì)柑橘木虱成蟲進(jìn)行毒力測(cè)定,結(jié)果表明吡蟲啉對(duì)柑橘木虱成蟲的室內(nèi)毒力較毒死蜱差，可能與藥劑作用方式及調(diào)查統(tǒng)計(jì)時(shí)間較短(24 h)有關(guān)。

組織蛋白酶是生命有機(jī)體溶酶體中重要的水解酶系，在哺乳動(dòng)物和人中的研究較為透徹，但到目前為止僅有少數(shù)昆蟲組織蛋白酶基因得到充分鑒定。例如：通過對(duì)家蠶SilkDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，共鑒定得到13條組織蛋白酶基因，進(jìn)一步分析結(jié)果表明這些基因分別屬于Cath-B，Cath-F，Cath-L，Cath-K和Cath-O5種組織蛋白酶基因類型(李懿等,2015)。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)合克隆方法在二化螟Chilosuppressalis中鑒定得到8個(gè)組織蛋白酶基因，序列分析發(fā)現(xiàn)其分別屬于Cath-B，Cath-F，Cath-L和Cath-O基因類型(Geetal.,2014)。Martynovetal.(2015)通過基因組結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析在黃粉蟲Tenebriomolitor和赤擬谷盜Triboliumcastaneum中分別鑒定得到29和25個(gè)組織蛋白酶基因,其中黃粉蟲組織蛋白酶基因分屬于Cath-B，Cath-F，Cath-L和Cath-O，而在赤擬谷盜中除上述4種類型基因外還鑒定得到1個(gè)Cath-K基因(Martynovetal.,2015)。目前柑橘木虱中已報(bào)道的組織蛋白酶基因僅有4種，分別為DcCath-B，DcCath-L，DcCath-L1和DcCath-O。本研究通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)Blast比對(duì)共得到8個(gè)柑橘木虱組織蛋白酶基因，其中具有完整編碼區(qū)的7個(gè)蛋白均含有保守的Cys-His-Asn(C-H-N)催化三聯(lián)體的氨基酸殘基以保證功能的保守性。這為后續(xù)進(jìn)一步深入探究柑橘木虱組織蛋白酶信息及功能，并以其作為農(nóng)藥新靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育、消化、繁殖、變態(tài)及免疫防御等生命過程中發(fā)揮重要作用(Saikhedkaretal.,2015)。通過RNAi等技術(shù)抑制或干擾組織蛋白酶基因的表達(dá)導(dǎo)致昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育異常及死亡等現(xiàn)象發(fā)生。例如家蠶中沉默BmCath-B或BmCath-D均會(huì)導(dǎo)致變態(tài)過程中的化蛹延遲或異常(Guietal.,2006;Wangetal.,2010)。甜菜夜蛾Spodopteraexigua5齡幼蟲經(jīng)dsRNA-SeCath-D處理后化蛹出現(xiàn)異常且死亡率高達(dá)25%(Kangetal.,2017)。植物介導(dǎo)的RNAi對(duì)桃蚜Myzuspersicae組織蛋白酶基因MpCath-L進(jìn)行沉默后桃蚜成蟲死亡率達(dá)到80%，同時(shí)成蟲繁殖率顯著降低且若蟲發(fā)育延緩(Raufetal.,2019)。在后期的防治中，可通過RNAi等技術(shù)對(duì)柑橘木虱各組織蛋白酶基因進(jìn)行人為的干預(yù)，通過抑制其活性來改變柑橘木虱的生長(zhǎng)發(fā)育等生理過程，進(jìn)而達(dá)到防治效果。

另外，作為一類多功能酶系，昆蟲組織蛋白酶同樣參與昆蟲對(duì)外界壓力的響應(yīng)(Saikhedkaretal.,2015;吳凡等,2017)。研究表明高溫脅迫誘導(dǎo)昆蟲組織蛋白酶上調(diào)表達(dá)。例如，家蠶5齡幼蟲高溫(28℃)處理后化蛹過程明顯快于對(duì)照組(23℃)，northern blot結(jié)果表明高溫處理組Bm-Cath-D表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，推測(cè)Bm-Cath-D在高溫脅迫下對(duì)家蠶加速化蛹過程具有重要作用(Kimetal.,2011)。柑橘木虱成蟲受高溫(40℃)脅迫時(shí)組織蛋白酶DcCath-B，DcCath-F，DcCath-L轉(zhuǎn)錄水平同樣顯著上調(diào)表達(dá)(Shuetal.,2020)。此外，昆蟲組織蛋白酶在病毒侵染昆蟲過程中具有重要作用。登革熱病毒(DENV)侵染埃及伊蚊Aedesaegypti過程中，唾液腺和中腸AaCath-L的表達(dá)量與登革熱病毒DENV2效價(jià)呈負(fù)相關(guān)，而在埃及伊蚊3個(gè)品系(Cali-S，Cali-MIB及Rockefeller)中采用dsRNA干擾AaCath-B的表達(dá)則能夠顯著降低DENV2侵入的埃及伊蚊比例(Caicedoetal.,2019;Oliveiraetal.,2020)。再者，昆蟲組織蛋白酶參與昆蟲對(duì)殺蟲劑的響應(yīng)。例如蘇云金芽孢桿菌BacillusthuringiensisBerliner(Bt)亞致死濃度處理松墨天牛MonochamusalternatusHope 20 h后組織蛋白酶基因MaCath-L下調(diào)表達(dá)(Linetal.,2016)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Bt產(chǎn)生的Cry毒素通過促進(jìn)桃蚜組織蛋白酶MpCath-B的活性發(fā)揮毒性(Zhaoetal.,2020)。而印楝素A飼喂桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis7 d中腸組織蛋白酶基因BdCath-D，BdCath-F和BdCath-L則顯著上調(diào)表達(dá)，推測(cè)3種組織蛋白酶可能在印楝素誘導(dǎo)桔小實(shí)蠅中腸組織細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用(Zhaoetal.,2019)。本研究通過室內(nèi)毒力測(cè)定得到吡蟲啉和毒死蜱對(duì)柑橘木虱成蟲的亞致死濃度LC20和LC50，并采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)組織蛋白酶在亞致死濃度下mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明部分組織蛋白酶基因在吡蟲啉和毒死蜱亞致死濃度脅迫下轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量顯著下調(diào)，其中DcCath-B轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量受亞致死濃度吡蟲啉和毒死蜱影響最大，推測(cè)兩種藥劑可能扮演DcCath-B抑制劑調(diào)控組織蛋白酶的變化，從而發(fā)揮對(duì)柑橘木虱成蟲的毒性。

綜上，本研究通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出8種柑橘木虱組織蛋白酶基因，為設(shè)計(jì)以組織蛋白酶為新作用靶標(biāo)的柑橘木虱防控新型農(nóng)藥創(chuàng)制提供相應(yīng)的序列信息。同時(shí)本研究從轉(zhuǎn)錄水平探究了亞致死濃度吡蟲啉和毒死蜱脅迫對(duì)柑橘木虱成蟲組織蛋白酶基因表達(dá)的影響。以上研究結(jié)果為探究亞致死濃度吡蟲啉和毒死蜱對(duì)柑橘木虱的毒理機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。具體柑橘木虱組織蛋白酶在柑橘木虱響應(yīng)亞致死濃度吡蟲啉和毒死蜱過程中的功能仍需進(jìn)一步研究。