幾種土壤真菌對煙粉虱的生物活性研究

古開平，吳 偉，2，胡瓊波*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，廣州 510642；2.浙江宜葆現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技有限公司，浙江嘉善314199)

煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)是一種世界性害蟲，其生物型B型和Q型于上世紀(jì)九十年代和本世紀(jì)初入侵我國，嚴(yán)重為害果樹、蔬菜與花卉類作物，可刺吸植物汁液造成直接危害，并分泌蜜露引發(fā)煤污病，最主要的是傳播多種植物病毒造成巨大的間接危害，從而造成植物減產(chǎn)甚至絕收，自2000年煙粉虱在我國爆發(fā)以來，其分布范圍不斷擴(kuò)大，在多省市爆發(fā)成災(zāi)(Renetal.,2001;王艷秋等,2016;王雨蒙等,2020)。

煙粉虱體表密被臘質(zhì)，世代重疊嚴(yán)重，繁殖速度快，化學(xué)藥劑難以防治，煙粉虱的防治面臨著巨大的挑戰(zhàn)。目前已對多種化學(xué)藥劑產(chǎn)生高抗性，防治煙粉虱所需藥劑的濃度越來越高，對環(huán)境造成了巨大的壓力(Jiaetal.,2017;景亮亮等,2020)。化學(xué)農(nóng)藥不僅容易造成環(huán)境污染、生態(tài)平衡的破壞以及危害人類和其他生物安全等不良后果，而且化學(xué)防治的效果有限，已不能滿足當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)需要。因此對煙粉虱開展綠色防控技術(shù)研究意義重大(Islametal.,2010)。

蟲生真菌是煙粉虱的重要病原微生物，在煙粉虱的防控中具有較高的潛在應(yīng)用價值(Cuthbertsonetal.,2005)。研究表明，爪哇棒束孢菌Isariajavanica對非洲菊Gerberajamesonii上的煙粉虱致病力高，且大田防治效果好(張志春等,2020)；蠟蚧輪枝菌Verticilliumlecanii對甜瓜Cucumismelo上煙粉虱有較好的防效(謝文等,2020)；玫煙色棒束孢菌Isariafumosorosea可在溫室和大田的煙粉虱種群中引起流行病(Brunner-Mendozaetal.,2016)；球孢白僵菌Beauveriabassiana可應(yīng)用于防治大田和園林植物上的煙粉虱(Weietal.,2020;Sayedetal.,2021)。此外，蟲生真菌對化學(xué)農(nóng)藥難以防治的植物病毒也有不錯的防治效果，如殺蟲真菌爪哇棒束孢菌I.javanica不僅對煙粉虱具有直接致病力，還能有效地降低煙粉虱的病毒傳播能力，減少病毒對生產(chǎn)作物的影響(肖燕等,2001)。已記載的蟲生真菌有100多個屬，1 000余種，近年來陸續(xù)有發(fā)現(xiàn)新種的報道(Wangetal.,2017)。蟲生真菌具有應(yīng)用期長、不傷害天敵、安全有效和可反復(fù)侵染等優(yōu)勢，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上蟲生真菌的開發(fā)利用具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和生態(tài)意義(李增智,2015;陳中琴等,2020)。

本文利用課題組分離得到的真菌，測定其對煙粉虱的室內(nèi)致病力，為開發(fā)防控?zé)煼凼恼婢苿┨峁┖蜻x菌種資源，為今后利用蟲生真菌防控?zé)煼凼峁┗镜睦碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

試驗所用菌株均從不同環(huán)境的土壤中分離獲得，共計20株(表1)。

表1 供試菌株信息Table 1 Information of test strains

1.2 供試煙粉虱與飼養(yǎng)

B型煙粉虱為飼養(yǎng)繁殖多代的種群。用吸蟲器從養(yǎng)蟲小棚內(nèi)的植株(一品紅Euphorbiapulcherrima、扶桑Hibiscusrosa-sinensis)上捕捉粉虱成蟲，釋放到60 cm×60 cm×60 cm的養(yǎng)蟲籠中，養(yǎng)蟲籠內(nèi)置盆栽健壯無病蟲害的扶桑苗，已剪除老葉，留下約10片左右新葉。按每片葉子50對釋放蟲量。在光照14 ∶10(L ∶D)、溫度25±1℃、相對濕度70%±10%條件下，讓煙粉虱成蟲在籠中產(chǎn)卵1 d，而后驅(qū)走全部煙粉虱成蟲。繼續(xù)培養(yǎng)，觀察煙粉虱卵孵化情況，待發(fā)育到2齡若蟲期時(約7 d)進(jìn)行試驗。

1.3 活性測定

1.3.1分生孢子懸浮液制備

將供試斜面菌種接種于PDA平板上培養(yǎng)，25℃下培養(yǎng)14 d，刮取分生孢子，用0.02% Tween-80水溶液配制成1.0±108孢子/mL的孢子懸浮液備用。對照組為0.02% Tween-80水溶液。

1.3.2浸漬處理

采用FAO推薦的浸漬法(謝婷等,2020)，用剪刀將被煙粉虱2齡若蟲侵染的扶桑苗葉片剪下，保留其葉柄長約1 cm，在20個不同菌株的分生孢子懸浮液(濃度1.0±108孢子/mL)里浸漬20 s，取出后自然風(fēng)干葉片表面水分，用含有植物營養(yǎng)液的棉花包被葉柄，放入培養(yǎng)皿中，每皿1片葉，皿底鋪濾紙保濕，對照葉片浸蘸0.02% Tween-80溶液，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)設(shè)定條件為光照14 ∶10(L ∶D)、溫度25±1℃，相對濕度70%±10%。從第2天開始，每48 h在解剖鏡下檢查若蟲死亡情況(蟲尸長出菌絲的死蟲確認(rèn)為被真菌感染致死)。每個處理蟲數(shù)30頭，每處理重復(fù)3次，測定供試菌株對煙粉虱2齡若蟲的致病活性。

經(jīng)初步活性測定后，選取致病力較高的真菌菌株，進(jìn)一步測定其對煙粉虱的生物活性。配制分生孢子懸浮液濃度系列，以0.02% Tween-80水溶液同樣處理葉片作為對照。具體處理方法同上。

1.3.3侵染形態(tài)觀察

采用浸漬法進(jìn)行真菌生物毒力測定的同時，對13株真菌侵染煙粉虱進(jìn)行了觀察。觀察時間分別為浸漬孢子懸浮液后的侵染初期(4 d)和侵染后期(10 d)，在蔡司體式顯微鏡下觀察其侵染煙粉虱的形態(tài)特征，并拍照。

1.3.4數(shù)據(jù)分析

根據(jù)下式計算累計死亡率和校正死亡率，采用SPSS v.14.0(IBM,USA)軟件進(jìn)行方差分析和毒力回歸分析，采用鄧肯式新復(fù)極差法(DMRT法)比較平均數(shù)差異，Probit法構(gòu)建毒力回歸方程，并估算半致死濃度LC50與時間LT50。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株對煙粉虱的毒力

不同菌株對煙粉虱2齡若蟲的室內(nèi)測定結(jié)果顯示，不同菌株在同一時間上致死率存在差異，而同一菌株對煙粉虱的致死率隨侵染時間的延長而增加(表2)。浸漬處理4 d后，共計5個菌株的校正死亡率超過50%，其中PITS01的校正死亡率最高(60.38%)；浸漬處理6 d后，共計11個菌株的校正死亡率超過50%，其中菌株P(guān)ITS01和LpTS01已超過80%，其校正死亡率為80.23%和80.52%；浸漬處理8 d后，共計12個菌株的校正死亡率超過70%，其中5個菌株P(guān)lMS-15、BbH2802、AuTS02、LpTS01、PITS01超過80%；浸漬侵染10 d后，共計12個菌株的校正死亡率已超過80%，其中8個菌株IfGZ4304、MbGX33H05、IjH2702、BbH2802、PlMS-10、AuTS02、BbMS-25、LmMS-18的校正死亡率為80.22%～89.87%，其余4個菌株LpTS01、PlMS-15、PlMS-12、PITS01的校正死亡率均超過90%，其中PITS01(92.78%)菌株致死率最高。

時間上采用半數(shù)致死時間(LT50)即致死中時表示20株菌株對煙粉虱若蟲的致死效果及速度，如表2所示，各菌株在同一濃度下(1.0×108孢子/mL)處理煙粉虱2齡若蟲，致死中時大約為3～9 d。5個菌株P(guān)ITS01、BbTS03、AuTS01、LpTS01、AuTS02的半數(shù)致死時間為3～4 d，其中PITS01、BbTS03、AuTS01、LpTS01四個菌株的半致死時間最短且接近，約為3.5 d；6個菌株LmMS-18、PlMS-15、IjH2702、BbMS-25、IfGZ4304、PlMS-12的半數(shù)致死時間為4～6 d；其余9個菌株的半數(shù)致死時間均超過6 d，其中PlGD02菌株的最長約為9 d。

蟲生真菌侵染煙粉虱2齡若蟲后的形態(tài)特征具體見圖1。各菌株侵染初期(4 d)，菌絲突出體壁向外生長，在蟲體表面大量增殖，體態(tài)逐漸干癟，體色由綠色向褐色轉(zhuǎn)變；菌株侵染后期(10 d)，若蟲密被蟲生真菌的菌絲體，部分菌絲已產(chǎn)生分生孢子，大部分若蟲干癟、體色變枯黃，小部分若蟲體表雖未長出菌絲體，但其生長發(fā)育的速率明顯減慢。

圖1 煙粉虱2齡若蟲受侵染后的形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes following infestation with the 2nd instar nymphs of Bemisia tabaci注：1為菌株侵染4 d，2為菌株侵染10 d。A1、A2，PITS01；B1、B2，LpTS01；C1、C2，AuTS02；D1、D2，IfGX70A01；E1、E2，IfGX21G01；F1、F2，PlH2802；G1、G2，IfGX33H05；H1、H2，IfGZ4206；I1、I2，IfGZ4304；J1、J2，PlFJ02；K1、K2，IjH2702；L1、L2，IfGD02；M1、M2，IcGX32S01。Note:The odd number showed that nymphs were infested for 4 days and the even number showed that nymphs were infested for 10 days.

2.2 菌株P(guān)ITS01和LpTS01對煙粉虱的毒力

不同孢子濃度的PITS01和LpTS01孢子懸浮液處理煙粉虱若蟲后，總體上，處理濃度越高，煙粉虱的病死率越高，不同孢子濃度處理后的病死率差異顯著；且處理后時間越長，煙粉虱的病死率越高(表3)。在濃度9.0×107孢子/mL時，兩種菌對煙粉虱若蟲均有良好的致病力，PITS01藥后2、4、6、8和10 d累計校正死亡率分別達(dá)到18.43%、59.63%、78.45%、90.07%和92.31%，LpTS01藥后2、4、6、8和10 d累計校正死亡率分別達(dá)到18.28%、56.54%、79.17%、88.41%和91.09%。

表3 菌株P(guān)ITS01和LpTS01對煙粉虱2齡若蟲累計校正死亡率Table 3 Calibrated mortality of the 2nd instar nymphs of Bemisia tabaci infected with PITS01 and LpTS01

PITS01和LpTS01菌株的毒力回歸分析顯示(表4)，P值均大于0.15，表明擬合的方程符合要求。PITS01和LpTS01菌株的LC50值隨著處理時間的延長而逐漸減小，處理4 d后分別為2.8×107孢子/mL，3.6×107孢子/mL；處理6 d后分別為1.7×106孢子/mL，3.6×105孢子/mL。

表4 兩種真菌對煙粉虱2齡若蟲的LC50回歸方程和LC50值Table 4 LC50 regression equation and LC50 value of two fungi to second instar nymphs of Bemisia tabaci

兩種菌株LT-P回歸分析結(jié)果表明(見表5)，LT50值隨著孢子濃度的增加而逐漸減少，孢子濃度為1.0×107孢子/mL時，PITS01和LpTS01菌株LT50值分別為4.4 d和4.2 d。

表5 兩種真菌對煙粉虱2齡若蟲LT50回歸方程和LT50值Table 5 LT50 regression equation and LT50 value of two fungi to second instar nymphs of Bemisia tabaci

3 結(jié)論與討論

煙粉虱屬于剌吸式口器害蟲，Bt、細(xì)菌與昆蟲病毒等“胃毒”性的微生物殺蟲劑對其沒有毒殺作用，而蟲生真菌可從表皮侵入昆蟲體內(nèi)，具有類似“觸殺作用”，所以利用蟲生真菌防治煙粉虱具有獨特優(yōu)勢。國內(nèi)外報道過的對煙粉虱具有活性的蟲生真菌種類雖然比較多，但實際應(yīng)用種類主要是球孢白僵菌、玫煙色棒束孢、蠟蚧菌等少數(shù)幾個種，我國只有球孢白僵菌產(chǎn)品登記用于防治煙粉虱(http://www.chinapesticide.org.cn/)，美國和歐洲等國家與地區(qū)則有球孢白僵菌、玫煙色棒束孢和蠟蚧菌產(chǎn)品登記與應(yīng)用(https://www.epa.gov/)(https://ec.europa.eu/food/plant/)(謝文等,2020)。本研究的9種20株分布于全國各地土壤中的蟲生真菌，全部對煙粉虱有一定生物活性，說明煙粉虱的病原真菌在自然界比較多見，可能對煙粉虱的自然種群有潛在的控制作用，為生物農(nóng)藥的開發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。

有研究表明球孢白僵菌JAB07和LCMAP3790對煙粉虱的卵和若蟲均有較高的致病性，用其孢子懸浮液處理后煙粉虱2齡若蟲后，死亡率分別為96.68%和97.74%，而球孢白僵菌IBCB66株的死亡率較差，為67.51%(Davidetal.,2019)。本實驗中的白僵菌BbMS-25最高死亡率可達(dá)88.12%，經(jīng)對比說明其生物活性處于中等水平。而在沈祥祥的研究中，用孢子懸浮液對煙粉虱2齡若蟲處理后，死亡率較高的菌株有Bb84、Bb55，分別為80.6%、54.2%，其中菌株Bb84的LT50為3.68 d(沈祥祥,2019)；李茂業(yè)的研究中，篩出生防效果較好的菌株Mf96的死亡率最高，可達(dá)89.5%，LT50為3.65 d(李茂業(yè)等,2016)。本實驗中菌株P(guān)lMS-12、PITS01和LpTS01死亡率最高均超過90%，PITS01和LpTS01的致死中時最小，LT50為3.5 d，而PlMS-12的LT50較長為5.7 d，以上說明菌株P(guān)ITS01和LpTS01的生物活性較優(yōu)于已知生防菌Bb84、Bb55和Mf96。張召榮研究中一株蠟蚧菌菌株對煙粉虱2齡若蟲第8天的致死率為86.9%(張召榮等,2015)，與本實驗中刀孢蠟蚧菌LpTS01對比，其相同時間致死率為88.98%，這兩株蠟蚧菌的生物活性相差不大。以上比較結(jié)果說明菌株P(guān)ITS01和LpTS01對煙粉虱具有良好生防應(yīng)用潛力，值得進(jìn)一步研究。

本研究首次報道了環(huán)鏈棒束孢I.cateniannulata、球芽普可尼亞菌M.bulbillosa和淡紫紫孢菌P.lilacinum等3種對煙粉虱具有生物活性。有關(guān)環(huán)鏈棒束孢的研究不多，曾有報導(dǎo)該菌對葉螨和蝽象Aspongopuschinensis有生物活性(Rochaetal.,2011;Zhangetal.,2016;Zhangetal.,2018)，本研究拓寬了其潛在應(yīng)用范圍。關(guān)于球芽普可尼亞菌的研究也比較少，該菌曾歸類于普可尼亞屬，具有殺線蟲活性(Nicolaetal.,2014)。淡紫紫孢菌則是一個研究非常多見的真菌，被廣泛地用于植物線蟲病害防治(Niuetal.,2019)，其分布廣泛，易于加工生產(chǎn)成菌劑，可見其用于防治煙粉虱具有較好的潛力。

未來蟲生真菌的應(yīng)用范圍將更加廣泛，方法也將更加多樣，如何進(jìn)一步有效利用篩選出的高致病力的菌株成為研究的熱點。后續(xù)有必要研究生防菌與已知農(nóng)藥混配制成真菌制劑以提高防效(Cuthbertsonetal.,2005;Warietal.,2020)，實現(xiàn)農(nóng)藥的減量增效，為生防制劑的開發(fā)研究打下基礎(chǔ)。