基于通用引物的多重PCR對小圓胸小蠹的分子鑒定

黃衛(wèi)東，梁建鋒，彭 鋒，桑 文，陳曉勝，王興民*

(1.廣東省生物農藥創(chuàng)制與應用重點實驗室，生物防治教育部工程技術研究中心，廣州 510640；2.華南農業(yè)大學林學與風景園林學院，廣州 510640)

小圓胸小蠹EuwallaceafornicatusEichhoff,1868隸屬于鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae小蠹亞科Scolytinae方胸小蠹屬Euwallacea(Smithetal.,2019)。該蟲在我國分布廣泛，主要分布于福建、海南、廣東、廣西、臺灣、四川、云南、貴州等地，國外則分布于東南亞、澳洲、美洲的23個國家和地區(qū)(Rabagliaetal.,2006;Hulcretal.,2007;何華和伍蘇然,2016)。小圓胸小蠹是一種國際性的重大林木害蟲，也是近年國內外爆發(fā)成災的重大蛀干害蟲之一，其寄主植物十分廣泛，在全球范圍內包括63科342種(Cooperbandetal.,2016;李巧等,2018)。小圓胸小蠹主要通過蟲、菌結合來危害寄主植物，成蟲在寄主植物體內羽化后，即開始鉆蛀到新寄主植物枝干內進行產卵。在成蟲鉆蛀的過程中，其體表攜帶的真菌孢子散落在蛀道內，并開始生長。菌絲的過度生長會阻塞寄主植物的維管束，影響樹體水分傳輸，與該蟲共同危害樹木(Walgama,2012;何華和伍蘇然,2016;李巧等,2018)。

對害蟲進行快速、準確地鑒定是實施害蟲防治的基礎和關鍵。目前，對于農業(yè)害蟲的鑒定大都采用傳統(tǒng)的形態(tài)學方法，但昆蟲形態(tài)學鑒定主要是以成蟲為研究對象，而昆蟲的卵、幼蟲和蛹的形態(tài)特征很難辨認。因此，利用以分子生物學手段為基礎的DNA條形碼技術對害蟲進行分子鑒定，能夠在很大程度上彌補形態(tài)學鑒定中的不足。Hebert等(2003)首次提出DNA條形碼的概念，即利用線粒體細胞色素氧化酶亞基I(mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I,COI)約658 bp的分子片段對物種進行快速鑒定。目前，該技術已廣泛應用于象甲科昆蟲的新種描述和物種鑒定等領域，并展現出了極大的應用潛力(Skuhrovecetal.,2018;Cognatoetal.,2020)。除序列COI外，在鞘翅目昆蟲DNA條形碼研究中涉及的分子片段還包括核基因的28S rDNA(28S)、18S rDNA(18S)、延長因子EF-1α等，線粒體基因的16S rDNA(16S)、12S rDNA(12S)、COII等(張媛等,2011)。

多重PCR(multiplex PCR)是指在一次PCR反應體系中同時加入多對引物，從而產生多條目的片段的技術，最早由Chamberlain等(1988)提出。目前，多重PCR技術主要應用于病原微生物的快速檢測：如Potrykus等(2014)利用多重PCR成功檢測了歐洲馬鈴薯SolanumtuberosumL.上侵染的Pectobacterium病原菌；Kim等(2015)則利用多重PCR成功檢測了感染人類的5種Vibrio病原菌。該技術目前也被應用于節(jié)肢動物物種的鑒定中，如王彥坤等(2020)利用COI和16S的通用引物結合雙重PCR技術對3綱8目14科的14種節(jié)肢動物物種進行了鑒定，結果顯示雙重PCR技術不僅可以保證物種鑒定的高準確率，還可以明顯減少時間與DNA樣本量的消耗。然而，關于使用多重PCR技術(即在一個反應體系內同時擴增3個或3個以上的分子標記)對昆蟲進行快速鑒定仍未見報道，其可行性需要進一步探究。

本研究選擇在鞘翅目分子鑒定中常用的COI、16S和28S三個分子片段，利用多重PCR的方法開展小圓胸小蠹的分子鑒定。目的在于：一方面探究多重PCR在昆蟲分子鑒定中的可行性，另一方面建立小圓胸小蠹的分子鑒定方法，以期為開展小圓胸小蠹的有效、準確鑒定及綜合防治等提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 標本采集

小圓胸小蠹成蟲樣本采自于廣東省潮州市潮安區(qū)鳳凰鎮(zhèn)(緯度:23.851108;經度:116.632647;海拔:539.32 m)。田間采集后，至于無水乙醇中保存，帶回實驗室至于-20℃低溫貯存?zhèn)溆?。成蟲的形態(tài)鑒定主要依據Gomez等(2018)和Smith等(2019)的文獻描述。

1.2 基因組DNA的提取

血液/組織/細胞基因組織提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit)用于目標昆蟲DNA的提取。選擇小圓胸小蠹后足組織用于DNA的提取，詳細的提取步驟嚴格按照試劑盒的說明書進行。提取后的DNA至于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增及測序

試驗設計了4組多重PCR體系，(1)COI+28S+16S；(2)COI+16S；(3)COI+28S；(4)16S+28S；并且分別擴增了28S、16S和COI的單個片段。引物序列信息和參考文獻見表1。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

PCR擴增體系為50 μL：PCR Mix 24 μL(TransGen Biotech,Beijing)，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，然后使用無菌水補充至50 μL。反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃最終延伸5 min。最后將PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，經EB染色后，在紫外燈下照射，對符合目的片段長度的產物進行回收，并送至上海生工生物工程有限公司進行雙向測序。

1.4 序列分析

在軟件Geneious 7.1.4(Kearseetal.,2012)中將測序獲得的基因序列進行拼接和人工校準，去除兩端引物。然后將拼接完成的序列輸出文件格式為FASTA，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網站上進行BLAST序列同源性分析，以確認目的片段被擴增。使用軟件MEGA 7(Kumaretal.,2016)分別統(tǒng)計了小圓胸小蠹COI、16S和28S的堿基組成。為了計算種間的遺傳距離，本研究從數據庫中下載了部分小圓胸小蠹和其它方胸小蠹屬的分子序列，并利用MUSLE(Edgar,2004)對序列進行比對，然后使用MEGA 7分析各種間的遺傳距離(表2)。由于本研究擴增的小圓胸小蠹的28S片段與數據庫中小圓胸小蠹的28S片段不屬于同一區(qū)域，因此本研究中28S的擴增僅用于探究多重PCR的可行性而不用于后續(xù)的遺傳距離計算和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。

表2 本研究所用到的序列信息Table 2 Information of sequences used in this study

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構建

本研究分別基于單個分子片段使用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)和最大似然法(Maximum likelihood,ML)用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。NJ樹的構建實施于MEGA 7中，基于K2P(Kimura-2-parameter)雙參數模型。ML樹的構建實施于RAxML 8.2.8(Stamatakis,2014)中，同時使用自舉值重復1 000次以檢驗各節(jié)點的可信度。在ML樹構建之前，使用Modeltest(Posada and Crandall,1998)分別推算COI和16S數據集的最佳替換模型。ML分析在CIPRES Science Gateway上運行(Milleretal.,2010)。

2 結果與分析

2.1 通用引物的多重PCR檢測

基于通用引物的小圓胸小蠹的多重PCR檢測結果顯示：在包含COI、16S和28S的反應體系1中產生3條目的條帶，但COI條帶較弱。在包含COI和16S的體系2中，COI條帶也較弱，16S則產生明亮條帶。對比包含COI和28S的體系3中，COI和28S均產生明亮條帶。在包含16S和28S的反應體系4中，也產生了2條明亮條帶。此外，基于單個PCR反應的COI、16S和28S均產生了符合目的片段大小的明亮條帶(圖1)。

圖1 小圓胸小蠹成蟲生態(tài)照Fig.1 Ecological photograph of the adults of Euwallacea fornicatus

2.2 基因序列分析

將序列拼接完成、去除兩端引物后，擴增得到小圓胸小蠹的COI序列長度為658 bp，16S序列長度為302 bp，28S序列長度為908 bp。在GenBank中進行BLAST檢索顯示所獲得序列為目的序列。在COI的所有位點中，堿基A、T、G和C的含量分別為33.0%、33.1%、14.9%和19.0%，且A+T含量高于G+C含量。在16S的所有位點中，堿基A、T、G和C的含量分別為37.4%、39.0%、15.1%和8.5%，且A+T含量高于G+C含量。在28S的所有位點中，堿基A、T、G和C的含量分別為24.3%、21.8%、29.9%和24.0%，而A+T含量稍低于G+C含量。本研究新測序的分子序列均已上傳至GenBank中；COI登錄號為MT946291，16S登錄號為MT946906，28S登錄號為MT940909。

2.3 遺傳距離分析

基于COI的遺傳距離分析顯示本研究擴增獲取的序列與數據庫中小圓胸小蠹的COI序列的遺傳距離為0.009～0.014；而與其它方胸小蠹屬的遺傳距離為0.104～0.162(表3)?；?6S的遺傳距離分析顯示本研究擴增獲取的序列與數據庫中小圓胸小蠹的16S序列的遺傳距離為0.000～0.007；而與其它方胸小蠹屬的遺傳距離為0.081～0.114(表4)。

表3 基于COI基因的小圓胸小蠹與其它小蠹的遺傳距離分析Table 3 Genetic distance between Euwallacea fornicatus and other species of Euwallacea based on COI gene

表4 基于16S基因的小圓胸小蠹與其它小蠹的遺傳距離分析Table 4 Genetic distance between Euwallacea fornicatus and other species of Euwallacea based on 16S gene

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構建

系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明,無論是基于何種建樹方法還是不同的分子片段，本研究擴增的小圓胸小蠹的分子序列與數據庫中小圓胸小蠹的分子序列均聚為一支，且得到較高的支持率(圖2,圖3)。此外，小圓胸小蠹與其它方胸小蠹屬的物種區(qū)分明顯，表明COI和16S分子序列可作為小圓胸小蠹分子鑒定的依據。

圖2 小圓胸小蠹的多重PCR擴增結果Fig.2 Amplification result of Euwallacea fornicatus with multiplex PCR注：1，Marker 2000；2，COI+16S+28S；3，COI+16S；4，COI+28S；5，16S+28S；6，COI；7，16S；8，28S。

圖3 基于COI基因的小圓胸小蠹與其它小蠹構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Euwallacea fornicatus and other species of Euwallacea based on COI gene注：圖中節(jié)點旁邊為自舉值(左：NJ；右：ML)，紅色方形表示本研究中生成的序列。Note:Numbers at nodes represented bootstrap value for NJ (left) and ML (right).Red rectangle represented this sequence was new generated in this study.

3 結論與討論

DNA條形碼鑒定的前提是DNA條形碼間隙(barcode gap)的存在，即種間遺傳距離大于種內遺傳距離(Hebertetal.,2003;2004;Puillandreetal.,2012;Taylor and Harris,2012)。Hebert等(2004)指出種間遺傳距離分化至少應大于種內遺傳分化的10倍；然而，后續(xù)的研究表明遺傳距離閾值對于不同類群來說是不一致的(Havermansetal.,2011;Songetal.,2018)。例如，2%～3%被表明適用于膜翅目、蜉蝣目、襀翅目和毛翅目部分類群的種類鑒定(Monaghanetal.,2005;Zhouetal.,2010;Webbetal.,2012;Schmidtetal.,2015)；3%～5%適用于一些雙翅目和鞘翅目物種的種類鑒定(Linetal.,2015;Nzeluetal.,2015;Huangetal.,2020)；而6%～8%則適用于毛翅目紋石蛾科Hydropsychidae的物種鑒定(Paulsetal.,2010)。在本研究中，基于COI基因的遺傳距離分析表明本研究擴增的小圓胸小蠹的DNA條形碼序列與數據庫中的序列差異小于2%，而和其它方胸小蠹屬的序列差異則為10.4%～16.2%。同樣地，在基于16S基因的遺傳距離分析中也揭示了本研究擴增的小圓胸小蠹的16S序列與數據庫中小圓胸小蠹的16S序列具有極高的相似性。目前，一些研究表明基于COI單個分子的物種鑒定結果經常被一些偏差所影響，包括假基因的存在、不完全譜系選擇和基因滲透(Funk and Omland,2003;Dupuisetal.,2012;Talaveraetal.,2013;Huangetal.,2020)。因此，為了增加分子鑒定的可信度，其它的基因片段，如12S、16S、18S和28S被提出作為互補的分子片段用于物種鑒定(Lerayetal.,2013;Elbrechtetal.,2016)。本研究中，利用多個分子片段同時用于小圓胸小蠹的分子鑒定，遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育分析的結果表明COI和16S分子片段可用于小圓胸小蠹的快速、準確鑒定,同時也強調了使用多個分子片段在準確鑒定物種方面的重要性。

圖4 基于16S基因的小圓胸小蠹與其它小蠹構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Euwallacea fornicatus and other species of Euwallacea based on 16S gene注：圖中節(jié)點旁邊為自舉值(左：NJ；右：ML)，紅色方形表示本研究中生成的序列。Note:Numbers at nodes represented bootstrap value for NJ (left) and ML (right).Red rectangle represented this sequence was new generated in this study.

在本研究中，首次使用3對通用引物來開展小圓胸小蠹的分子鑒定，并探究多重PCR在昆蟲中應用的可行性。結果表明，在設置的4個多重PCR反應體系中均可以產生符合目的片段大小的單一條帶。但在體系1和體系2中，COI產生的條帶則較暗，通過比較體系3和體系4中的引物配置，推測由于體系1和體系2中包含了16S的擴增引物，從而影響了COI的擴增效果。引物的選擇與優(yōu)化被認為是影響多重PCR效果的最主要因素(Elnifroetal.,2000)。由于COI和16S同屬于線粒體基因，且大多數昆蟲線粒體基因組排列與昆蟲線粒體基因組原始排列順序一致(Cameron,2014)，因此這兩個片段的引物可能會發(fā)生相互干擾。由于本研究中的多重PCR反應體系為50 μL，使得仍可以通過膠回收獲取足量的COI擴增產物以滿足測序的要求。為解決在多重PCR反應中部分條帶較弱的問題，一些研究提出在反應體系中增加對應引物的量，可以有效的增加引物與模板結合的概率(Elnifroetal.,2000;郝少東等,2015)。

本研究證實了多重PCR應用于昆蟲分子鑒定的可行性。在一個PCR反應體系中產生的多條分子序列，不僅提高了物種鑒定的準確率，而且節(jié)省了PCR反應所需時間和模板的消耗；在樣品材料十分珍貴的情況下，這兩點顯得尤為重要。此外，通過COI、16S和28S提供的序列信息和多重PCR方法，建立了小圓胸小蠹的分子鑒定方法，為開展小圓胸小蠹的準確鑒定及綜合防治等奠定了基礎?？紤]到當前數據庫豐富的分子序列和引物設計的便捷，建議在研究不同類群時挑選合適的基因和不同的引物組合，采用多重PCR開展物種的鑒定工作，以增加物種鑒定的準確性。