家蠶 BmChd64基因的克隆與表達定位分析

魏秋蘭，吳瓊芳，鄧惠敏，朱子丹

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，華南師范大學(xué)昆蟲科學(xué)與技術(shù)究所，廣東省昆蟲發(fā)育生物學(xué)與應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，廣州 510631)

昆蟲是陸地上種類最多、數(shù)量最大且分布最廣的生物。在長期自然演化過程中，昆蟲形成了蛻皮與變態(tài)這一特殊且重要的發(fā)育特征，而這一特征主要受到蛻皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(Juvenile hormone，JH)協(xié)同調(diào)控(Riddifordetal.,2003;Jindraetal.,2013)。20E與其受體復(fù)合物EcR-USP(Ecdysone receptor,EcR；Ultraspiracle,USP)結(jié)合后，啟動一系列級聯(lián)反應(yīng)進而調(diào)控蛻皮與變態(tài)相關(guān)基因的表達，導(dǎo)致蛻皮與變態(tài)(Riddifordetal.,2000;2008;Yamanakaetal.,2013)的發(fā)生。JH則與其受體MET/Tai(Methoprene,MET；Taiman,Tai)結(jié)合，啟動其下游的初級反應(yīng)基因Kruppelhomolog1(Kr-h1)表達，進而啟動了JH級聯(lián)信號通路，調(diào)控昆蟲的生長與發(fā)育(Kayukawaetal.,2012;2017)。近年來許多研究逐步完善了20E與JH調(diào)控昆蟲生長與變態(tài)的機制，但二者確切的互作機制有待深入闡釋。Li等發(fā)現(xiàn)，果蠅鈣調(diào)同源結(jié)構(gòu)域蛋白Chd64(Calponin homology domain protein,21-kDa Calponin-like protein,Chd64)可與JH反應(yīng)元件(JH-response element,JHRE)結(jié)合，還可通過與核受體Methoprene-tolerant(Met)和USP互作響應(yīng)JH誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄表達(Lietal.,2007)。另一個果蠅Chd蛋白DroVav被認(rèn)為是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白與酪氨酸磷酸化的表皮生長因子受體(Dekeletal.,2000)。棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraChd64同源蛋白HaCal響應(yīng)20E誘導(dǎo)后以磷酸化形式進入細(xì)胞核，受JH analog methoprene(JHA)誘導(dǎo)后以非磷酸化形式與USP1互作進而參與調(diào)控20E或JH的信號級聯(lián)(Liuetal.,2011)

Chd64是一類含有CH結(jié)構(gòu)域的蛋白。CH結(jié)構(gòu)域一般含100～110個氨基酸殘基，它是一類肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，最初發(fā)現(xiàn)于鈣結(jié)合蛋白(Calponin)的氨基末端，后來發(fā)現(xiàn)在多種肌動蛋白結(jié)合蛋白和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白中也存在CH結(jié)構(gòu)域(Gimonaetal.,2002;Ferjanietal.,2010)。根據(jù)蛋白序列的不同，含有CH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)主要分為3類：氨基末端含單一CH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)、由兩個CH結(jié)構(gòu)域串聯(lián)形成絲狀肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(F-actin-binding domain,ABD)的蛋白質(zhì)及含兩個ABD結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(Korenbaum and Rivero,2002)。蛋白質(zhì)中兩個串聯(lián)的CH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了肌動蛋白結(jié)合區(qū)，例如血影蛋白、肌動蛋白、肌養(yǎng)蛋白和纖維蛋白(Hartwigetal.,1994;McGoughetal.,1998)。研究認(rèn)為，大部分含CH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)都能與肌動蛋白相結(jié)合或者參與細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Banuelosetal.,1998)。果蠅中含CH結(jié)構(gòu)域的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白DroVav作為一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器在果蠅發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Dekeletal.,2000)。Liu等發(fā)現(xiàn)在棉鈴蟲中含CH結(jié)構(gòu)域的類肌鈣蛋白HaCal在20E和JH的通路網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)了相關(guān)基因的表達從而影響棉鈴蟲的生長發(fā)育(Fuetal.,2009;Liuetal.,2011)。在赤擬谷盜和蝦中，Chd64也在20E和JH調(diào)控的通路中發(fā)揮了重要作用(Sinetal.,2014;Tarczewskaetal.,2015)。

基于Chd64蛋白在果蠅和棉鈴蟲生長發(fā)育中激素信號傳導(dǎo)途徑的重要作用，本論文克隆了鱗翅目模式昆蟲同時也是重要經(jīng)濟昆蟲家蠶中與果蠅DmChd64同源的BmChd64基因，并對該蛋白氨基酸序列進行生物信息學(xué)預(yù)測，同時利用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測了該基因在家蠶中的時空表達，并利用共聚焦顯微鏡進行了該蛋白的亞細(xì)胞定位分析，以期豐富家蠶等全變態(tài)昆蟲變態(tài)發(fā)育分子調(diào)控機理的研究，為家蠶發(fā)育的人為調(diào)節(jié)與害蟲的生物防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和主要試劑

本研究選用的家蠶品系為大造，蠶卵由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供，家蠶幼蟲定時以桑葉飼喂，于溫度26℃，相對濕度65%～75%，光周期L ∶D=12 ∶12條件下培養(yǎng)至成蟲。大腸桿菌DH5α、BL21、原核表達載體pET-28a及真核表達載體pIE1-EGFP-N1均由本實驗室保存。Trizol Isolate抽提試劑盒、pMD-18T載體、DNA限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Taq酶、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker、DNA marker、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自TAKARA公司；質(zhì)粒提取和DNA膠回收試劑盒為TianGen產(chǎn)品；實驗所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；實驗涉及的引物合成和相關(guān)DNA測序委托華大基因公司完成。

本研究所用BmN細(xì)胞株來源于家蠶卵巢細(xì)胞，為本實驗室培養(yǎng)與保存，細(xì)胞培養(yǎng)條件為27℃恒溫，所用培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)的Grace培養(yǎng)基(GIBCO，USA)。細(xì)胞每隔3 d以1 ∶3的比例稀釋培養(yǎng)基作繼代培養(yǎng)。后均勻鋪板于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度長至80%～90%時進行轉(zhuǎn)染和后續(xù)實驗。

1.2 家蠶總RNA的提取與cDNA合成

選取處于5齡游走期的家蠶，脂肪體、中腸、表皮和翅原基組織；取5齡至蛹期的家蠶，隔天取翅原基組織，并于液氮中速凍后研磨。按Trizol Isolate抽提試劑盒的說明提取家蠶組織的RNA，用紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度和濃度及質(zhì)量，然后按照TAKARA公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit(反轉(zhuǎn)錄試劑盒)說明書，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.3 家蠶 BmChd64基因的克隆及序列分析

以果蠅中的DmChd64(Acession No:AAF47840)為參照基因，在NCBI上通過Blast分析對比出家蠶中對應(yīng)的同源基因，即BmChd64(Accesion No：NP_001040372；相似性：81%；E-value：4e-109)。根據(jù)序列設(shè)計PCR引物(見表1)，以家蠶cDNA為模版，進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。參照DNA膠回收試劑盒的方法進行膠回收。將膠回收純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α菌體中，篩選陽性克隆進行測序。使用DNAstar軟件中的Clustal Alignment Programe對測序后的序列進行比對鑒定?；蛐蛄斜容^與進化樹構(gòu)建使用DNAStar軟件的Clustal W方法。

表1 本研究所使用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 家蠶BmChd64的原核表達和純化

用BamHⅠ和XhoⅠ對目的DNA片段和pET-28a載體進行雙酶切，反應(yīng)體系為質(zhì)粒10 μL，BamH I酶1 μL，XhoⅠ酶1 μL，10 × K Buffer 3 μL，ddH2O 5 μL。反應(yīng)條件為37℃ 3 h。膠回收后將二者連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-BmChd64，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21菌體中，加入最終濃度為1 M IPTG進行誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE檢測表達情況。為了確定重組蛋白是否以可溶的形式表達，收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體后，將菌體進行超聲破碎，分別收集沉淀和上清液，在12%凝膠上進行SDS-PAGE檢測。蛋白純化按照Ni-NTA His·Bind Resin(Novagen)試劑盒的方法進行。取1 mL Ni2+柱于管中，使用2倍體積蒸餾水洗2次，2倍體積1×Charge (50 mM NiSO4)緩沖液洗3次，2倍體積1×Binding buffer(0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl，5 mM Imidazole，pH7.9)緩沖液洗2次，將收集的上清液用0.45 μM的濾膜過濾后加入管中，分別以10倍體積的1×Binding buffer、6倍體積的1×Washing buffer (0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl，60 mM Imidazole，pH7.9)和6倍體積的1×Elute buffer (0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl，1 M Imidazole，pH7.9)洗柱子，離心收集上清，該上清含純化蛋白。用SDS-PAGE檢查蛋白純化效果。

1.5 BmChd64在家蠶不同發(fā)育時期各組織中的表達分析

以家蠶各發(fā)育時期翅原基cDNA和5齡游走期翅原基、表皮、脂肪體和中腸組織cDNA為模版，以家蠶Rp49(Gene ID:778453)作為內(nèi)參基因，參照qRT-PCR試劑盒的方法(TAKARA，大連)，采用20 μL體系，10 μL SYBR Premix Ex TaqTM，上、下游引物各0.8 μL，6.8 μL ddH2O，2 μL DNA模板。使用7300 Real-time PCR System進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序如下：95℃變性30 s，40個循環(huán)，循環(huán)條件為95℃ 3 s，60℃ 30 s。每個樣品重復(fù)進行3次，檢測BmChd64的表達。為增加數(shù)據(jù)的可比性，需提前檢測目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的擴增效率是否一致。然后采用2法來確定每一個目標(biāo)基因相對內(nèi)標(biāo)基因Rp49的相對表達量。用Graphpad Prism 5統(tǒng)計分析軟件，采用ANOVA(多個處理間的兩兩比較)或獨立樣本T測驗(兩個樣品間比較)來進行處理間的差異比較分析。

1.6 BmChd64的亞細(xì)胞定位

將PCR擴增得到的BmChd64的ORF片段插入到pMD18-T中，用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切后，將目的DNA片段插入到真核表達載體pIE1-EGFP-N1上，并通過雙酶切驗證重組質(zhì)粒pIE1-BmChd64-EGFP。

轉(zhuǎn)染前一天，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)BmN細(xì)胞過夜，至細(xì)胞密度80%～95%時，進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時，去除細(xì)胞培養(yǎng)皿中的完全培養(yǎng)基，用無血清(FBS)的Grace’s Insect培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩次，再加入適量的無FBS的Grace’s Insect培養(yǎng)基到培養(yǎng)皿中，然后加入200 μL轉(zhuǎn)染混合物，輕輕混勻，培養(yǎng)8 h后，更換含10% FBS的Grace’s Insect培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，通過激光共聚焦顯微鏡觀察帶有GFP標(biāo)簽的BmChd64，進行亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 BmChd64基因克隆與序列分析

以家蠶cDNA為模版，對BmChd64基因進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳分離后在500～700 bp中間處顯示出一條特異性條帶(圖1)。對該特異性PCR產(chǎn)物進行膠回收后與pMD18-T載體連接，通過PCR檢測陽性克隆。提取陽性克隆細(xì)胞的質(zhì)粒進行DNA測序，測序結(jié)果顯示該PCR產(chǎn)物與GenBank的相應(yīng)序列相同。

圖1 BmChd64基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of BmChd64 gene注：M，5000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，BmChd64基因的PCR擴增。Note:M,DL5000 DNA marker;1,PCR amplification of BmChd64 gene.

對克隆得到的BmChd64的cDNA序列進行分析。結(jié)果顯示，該基因開放閱讀框(ORF)的堿基數(shù)為567 bp，編碼188個氨基酸。BmChd64蛋白的分子量大小為20.9 kDa，理論等電點為8.41。該基因所編碼的蛋白在第27～130個氨基酸處存在CH結(jié)構(gòu)域(圖2)。

圖2 BmChd64核苷酸及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of BmChd64注：陰影序列顯示CH域。下劃線，5′非翻譯區(qū)和3′非翻譯區(qū)；紅色字體，起始密碼子與終止密碼子；***，翻譯終止位點；黃色底紋，CH結(jié)構(gòu)域。Note:Shadow sequence showed a CH domain.Underline,5′ untranslated region and 3′ untranslated region;Red font,Start codon and stop codon;***,Translation termination site;Yellow shading,CH domain.

2.2 BmChd64的同源性比對與進化分析

為了解Chd64蛋白在昆蟲中的功能是否保守，將家蠶BmChd64的氨基酸序列與埃及伊蚊Aedesaegypti、岡比亞按蚊Anophelesgambiae、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、體虱Pediculushumanuscorporis、赤擬谷盜Triboliumcastaneum、黑腹果蠅D.melanogaster、果蠅D.mojavensis及豌豆蚜Acyrthosiphonpisum進行同源序列比對和相似性分析。結(jié)果顯示，BmChd64與其它昆蟲的同源氨基酸序列具有極高的相似性，其中，與赤擬谷盜的相似性最高為84%，與DmChd64的相似性為80.9%。不同昆蟲間同源氨基酸序列的高相似性(圖3和表2)，暗示了該基因在不同昆蟲中的功能較保守，推測其在昆蟲中可能發(fā)揮相似的功能?；谕葱詷?gòu)建了系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，BmChd64與鞘翅目赤擬谷盜的親緣關(guān)系最近，但與同為鱗翅目的棉鈴蟲的HaCal親緣關(guān)系較遠(圖4)。

圖3 不同昆蟲的Chd64蛋白的氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment of Chd64 protein from different insects注：Chd64蛋白來源及GenBank登錄號。1，家蠶 Bombyx mori transgenlin (Chd64) protein，NP_001040372.1；2，赤擬谷盜 Tribolium castaneum，XP_975100.1；3，埃及伊蚊 Aedes aegypti，XP_001652323.1；4，果蠅 Drosophila mojavensis，XP_015015904.1；5，黑腹果蠅 Drosophila melanogaster Cdh64，NP_001261398.1；6，岡比亞按蚊 Anopheles gambiae，XP_321834.4；7，豌豆蚜 Acyrthosiphon pisum calpoin-like，NP_001191867.1；8，體虱 Pediculus humanus corporis，XP_002426427.1；9，棉鈴蟲 Helicoverpa armigera calpoin，XP_021189834.1。

表2 不同昆蟲Chd64蛋白的氨基酸序列相似性(相似度(%))Table 2 Amino acid sequence identity of Chd64 protein from different insects(Identity)

圖4 BmChd64與其它昆蟲同源氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of Chd64 protein from different insects

2.3 BmChd64重組蛋白的表達與純化

將重組質(zhì)粒pET-28a-BmChd64轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，在37℃，200 rpm的培養(yǎng)條件下，加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達，以經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-28a菌體蛋白作為對照。SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，在約26 kDa處出現(xiàn)一條特異性條帶(圖5-A，泳道2)，因pET-28a含有2個His標(biāo)簽，每個標(biāo)簽蛋白為3 kDa，預(yù)測BmChd64蛋白的分子量為 20.9 kDa，出現(xiàn)的目的條帶與預(yù)測的pET-28a-BmChd64蛋白大小相近，這表明BmChd64重組蛋白在原核系統(tǒng)中成功表達。將菌體經(jīng)過超聲波破碎后，在上清和沉淀中都檢測到重組蛋白(圖5-A，泳道3和4)，表明重組蛋白以可溶的形式表達。蛋白純化后，在小于29 kDa處出現(xiàn)純化的特異性蛋白條帶，與預(yù)測的pET-28a-BmChd64蛋白約26 kDa大小一致(圖5-B，泳道1和2)。

圖5 BmChd64重組蛋白表達的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of expression of BmChd64 protein注：A，BmChd64重組蛋白誘導(dǎo)表達；M，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-28a菌體蛋白；2，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體重組總蛋白；3，誘導(dǎo)的菌體重組蛋白上清；4，誘導(dǎo)的菌體重組蛋白沉淀。B，BmChd64重組蛋白純化；M，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2，純化后BmChd64重組蛋白。Note:A,Induced expression of BmChd64 recombinant protein;M,Standard protein maker;1,pET-28a bacterial protein induced by IPTG;2,Recombinant total protein of pET-28a-BmChd64 induced by IPTG;3,Supernatant recombinant protein of pET-28a-BmChd64 induced by IPTG;4,Precipitate recombinant protein of pET-28a-BmChd64 induced by IPTG.B,Purification of BmChd64 recombinant protein;M,Standard protein maker;1 and 2,BmChd64 recombinant protein after purification.

2.4 BmChd64在家蠶各發(fā)育時期各組織中的表達分析

利用qRT-PCR分別分析了家蠶5齡游走期脂肪體、中腸、表皮和翅原基中BmChd64的表達量和5齡至蛹期的翅原基中BmChd64基因的mRNA的表達情況。結(jié)果顯示，BmChd64在家蠶5齡游走期的各組織都有一定量的表達，BmChd64在脂肪體中的表達量最低，在翅原基中的表達量最高，其次是表皮和中腸(圖6)，BmChd64在翅原基的高表達暗示其與變態(tài)發(fā)育中翅原基的發(fā)育相關(guān)。在翅原基中，BmChd64在5齡末期和游走期都有較高水平的表達，在蛹初期表達下降，到蛹期 4 d表達又升高，至蛹末期表達量最高(圖7)。BmChd64在翅原基的表達模式與家蠶體內(nèi)20E的滴度變化高度一致(楊鑫華,2010;Wangetal.,2018)，暗示其在翅原基的表達可能與20E有關(guān)。

圖6 qRT-PCR檢測BmChd64在脂肪體、中腸、表皮和翅原基中的表達Fig.6 qRT-PCR analysis of expression profiles of BmChd64 in the fatbody,midgut,epidermis and wing disc注：EP，表皮；MG，中腸；FB，脂肪體；WD，翅原基。不同字母表示兩者之間顯著差異，P<0.05。Note:EP,Epidermis;MG,Midgut;FB,Fat body;WD,Wing disc.Different letters indicated significant differences,P<0.05.

圖7 qRT-PCR檢測BmChd64在翅原基中的表達Fig.7 qRT-PCR analysis of expression profile of BmChd64 in the wing disc注：L，幼蟲期；D，天；W，游走期；PP，預(yù)蛹期；P，蛹期。數(shù)字表示在相應(yīng)時期的天數(shù)。不同字母表示兩者之間顯著差異，P<0.05。Note:L,Larval stage;D,Day;W,Wandering;PP,Prepupal stage;P,Pupal stage.The numbers indicated the days in the corresponding stages.Different letters indicated significant differences,P<0.05.

2.6 BmChd64蛋白的亞細(xì)胞定位

蛋白質(zhì)的功能與其亞細(xì)胞定位密切相關(guān)，通過了解蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位信息，可為探究蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能提供線索。為檢測BmChd64在細(xì)胞內(nèi)的定位，本論文構(gòu)建了綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的BmChd64蛋白表達載體，通過雙酶切驗證pIE1-BmChd64-EGFP載體構(gòu)建成功。用構(gòu)建好的pIE1-BmChd64-EGFP轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞株，并通過共聚焦顯微鏡檢測熒光信號。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了EGFP載體的細(xì)胞中，熒光信號在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均勻分布，且細(xì)胞質(zhì)比細(xì)胞核的綠色熒光更強。在轉(zhuǎn)染了BmChd64-pEGFP載體的細(xì)胞中，熒光信號雖在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有分布，但圍繞細(xì)胞核的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的熒光明顯更暗，出現(xiàn)一個暗圈，而細(xì)胞核中熒光信號更強(圖8-D,F)，暗示了細(xì)胞質(zhì)中的BmChd64蛋白也可能入核，其主要是在細(xì)胞核中起作用。

圖8 BmChd64在BmN細(xì)胞中的定位Fig.8 Localization of BmChd64 in BmN cells注：A，BmN轉(zhuǎn)染EGFP質(zhì)粒后綠色熒光圖像；B，BmN轉(zhuǎn)染EGFP質(zhì)粒后白光圖像；C，BmN轉(zhuǎn)染EGFP質(zhì)粒后熒光和白光Merge圖像；D，BmN轉(zhuǎn)染EGFP-BmChd64質(zhì)粒后綠色熒光圖像；E，BmN轉(zhuǎn)染EGFP-BmChd64質(zhì)粒后白光圖像；F，BmN轉(zhuǎn)染EGFP-BmChd64質(zhì)粒后熒光和白光Merge圖像；N，細(xì)胞核；C，細(xì)胞質(zhì)；綠色熒光，目的蛋白存在的位置。Note:A,Green fluorescence image after transfection of EGFP vector in BmN cells;B,White light image after transfection of EGFP vector in BmN cells;C,Fluorescence and white light Merge image after transfection of EGFP vector in BmN cells;D,Green fluorescence image after transfection of EGFP-BmChd64 plasmid in BmN cells;E,White light image after transfection of EGFP-BmChd64 plasmid in BmN cells;F,Fluorescence and white light Merge image after transfection of EGFP-BmChd64 plasmid in BmN cells;N,Nuclei;C,Cytoplasm.The fluorescence presented the location of target gene.

3 結(jié)論與討論

本研究成功克隆了家蠶的BmChd64基因，該基因cDNA的開放閱讀框為567 bp，編碼188個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量大小為20.9 kDa，理論等電點為8.41，存在單個CH結(jié)構(gòu)域，與其它昆蟲中已報道的Chd64蛋白含CH結(jié)構(gòu)域一致(Lietal.,2007;Liuetal.,2011;Kozowskaetal.,2014;Tarczewskaetal.,2015)。同源性比對表明該基因編碼的氨基酸序列與赤擬谷盜TcChd64和果蠅DmChd64同源性較高，推測BmChd64與TcChd64和DmChd64的功能相似。DmChd64的生物學(xué)功能已有研究證實，其通過與EcR/USP和Met等蛋白結(jié)合，共同調(diào)控JH應(yīng)答基因的表達，在介導(dǎo)果蠅JH和20E激素信號交流過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用(Lietal.,2007)。赤擬谷盜TcChd64蛋白的功能尚未有報道，Kozowska等對TcChd64蛋白序列進行分析發(fā)現(xiàn)，其與DmChd64的相似性達74%，推測其與DmChd64的功能相似(Kozowskaetal.,2014)。因此，本研究推測，BmChd64可能與DmChd64一樣，參與了家蠶JH和20E的激素調(diào)控過程。

同時，本研究利用qRT-PCR檢測了BmChd64在家蠶不同組織中的表達。結(jié)果顯示，BmChd64在5齡游走期的多個組織都有一定量的表達，其中BmChd64在翅原基中表達量最高，其次是表皮和中腸，表達量最低的是脂肪體，該基因在翅原基中表達量最高，表明該基因在翅原基的發(fā)育過程中有著重要的作用。在翅原基中，BmChd64在 5齡中后期的表達水平較低，而到了5齡末期和游走期表達水平較高，在蛹初期表達下降，到蛹期4 d表達又升高，至蛹末期表達量最高，這一變化趨勢與20E在家蠶體內(nèi)的滴度變化(楊鑫華,2010;Wangetal.,2018)趨勢相吻合。在棉鈴蟲中，20E誘導(dǎo)HaCal的快速磷酸化，HaCal可通過20E或JH信號迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中與USP1相互作用，同時HaCalRNAi可以抑制20E對USP1、PKC和HR3的誘導(dǎo)(Liuetal.,2011)。因此推測，BmChd64可能在20E的作用下大量表達，進而導(dǎo)致翅原基完成幼蟲-蛹期的變態(tài)發(fā)育并促進5齡中后期的蛹翅向成蟲翅轉(zhuǎn)變。

研究蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位有助于更好地了解目的蛋白的作用機理和調(diào)控機制。本研究用構(gòu)建好的BmChd64-EGFP轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞株后通過共聚焦顯微鏡檢測熒光信號，熒光信號在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有分布，但主要是分布在細(xì)胞核中。Liu等發(fā)現(xiàn)在棉鈴蟲中，含有CH結(jié)構(gòu)域的蛋白HaCal磷酸化能迅速進入細(xì)胞核內(nèi)與核內(nèi)蛻皮激素受體復(fù)合物EcR-USP結(jié)合，從而在20E和JH的通路網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用(Liuetal.,2011)。因此推測家蠶BmChd64蛋白可能也與HaCal一樣會被磷酸化，而磷酸化影響了蛋白的亞細(xì)胞定位。Kozowska等利用Kratky圖表明果蠅DmChd64和赤擬谷盜TcChd64蛋白很可能在兩個末端都有內(nèi)在的無序區(qū)域(intrinsically disordered regions,IDRs)，這些區(qū)域可作為與各種因子進行多重相互作用的平臺，并為其調(diào)節(jié)功能奠定基礎(chǔ)(Kozowskaetal.,2014)。BmChd64與DmChd64、TcChd64同源性最高，推測家蠶BmChd64蛋白可能也可與其它因子互作，而與其它因子的互作也會影響B(tài)mChd64的亞細(xì)胞定位。綜上所述，家蠶BmChd64可能在20E的作用下參與調(diào)控家蠶翅原基的變態(tài)發(fā)育。