瘦素對(duì)氧糖剝奪∕復(fù)糖復(fù)氧后原代神經(jīng)元的影響及相關(guān)機(jī)制☆

張艷 程道賓 揭春曉 胡詩(shī)俊

腦缺血后再灌注過(guò)程會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激激增、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞過(guò)度凋亡等，即腦缺血-再灌注損傷（cerebral ischemia∕reperfusion injury,CIRI）[1-2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress,ERS）是指在缺血缺氧情況下，折疊不良的蛋白異常聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的狀態(tài)。有研究證實(shí)，靶向ERS相關(guān)信號(hào)能抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[3-4]。瘦素主要是由肥胖基因編碼、脂肪組織合成的多肽激素[5]，可與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的受體結(jié)合激活磷脂酰肌醇3-激酶∕蛋白激酶 B（phosphatidyl inositol 3-kinase∕protein kinase B,PI3K∕Akt）信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮抗凋亡作用[6-7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，瘦素通過(guò)調(diào)節(jié)ERS相關(guān)蛋白在局灶性缺血性卒中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8]，但具體機(jī)制尚不明確。因此，本研究用原代皮層神經(jīng)元行氧糖剝奪∕復(fù)糖復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation and reoxygenation,OGD∕R）擬建立 CIRI體外模型，旨在探討瘦素是否通過(guò)激活PI3K∕Akt信號(hào)通路減輕OGD∕R誘導(dǎo)的ERS，為其用于后續(xù)臨床應(yīng)用提供良好的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物新生24 h內(nèi)的Sprague-Dawley乳鼠購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。所有實(shí)驗(yàn)步驟遵守中華人民共和國(guó)科技部發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理指南》，并經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 皮層神經(jīng)元培養(yǎng)及鑒定參照Gaurav Das等[9]神經(jīng)元原代培養(yǎng)的方法并稍加改進(jìn)。取新生24 h內(nèi)的Sprague-Dawley乳鼠大腦皮層組織進(jìn)行原代培養(yǎng)：解剖的大腦皮層組織在剝離腦膜血管后，經(jīng)剪碎、消化、離心，用含10%胎牛血清DMEM∕F-12制備單細(xì)胞懸液，并將其種植于預(yù)涂有多聚賴氨酸的孔板中。4 h后，換成含2%B27和1%谷氨酰胺的Neurobasal-A培養(yǎng)基。每3～5 d半量換液；在種板第7 d后通過(guò)神經(jīng)元核抗原抗體NeuN鑒定神經(jīng)元的純度，具體步驟參照下文細(xì)胞免疫熒光。

1.3 氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧模型制作及分組原代神經(jīng)元培養(yǎng)7 d后，將孔板中的Neurobasal-A培養(yǎng)基換成無(wú)糖培養(yǎng)基將神經(jīng)元置于充滿95% N2和5% CO2的模塊化培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1 h、2 h和4 h；然后換用正常培養(yǎng)基在正常培養(yǎng)箱中（37°C，5% CO2）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

將細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、OGD∕R組、瘦素組和LY+瘦素組。正常組神經(jīng)元不作OGD∕R處理，加入等劑量溶劑；OGD∕R組神經(jīng)元在OGD∕R前給予等劑量溶劑；參照Z(yǔ)HANG等[10]及ZHANG等[11]，瘦素組神經(jīng)元在OGD∕R處理前選取400 ng∕mL瘦素（瑞士羅氏制藥公司）預(yù)處理24 h；LY+瘦素組神經(jīng)元用LY294002（美國(guó)MedChemExpress公司）預(yù)處理30 min，再予 400 ng∕mL 瘦素預(yù)處理 24 h，然后行OGD∕R處理。

1.4 細(xì)胞存活率測(cè)定將100 μL的細(xì)胞懸液加入96孔板中，密度約為 2×105∕孔，空白組加入不含細(xì)胞的等量培養(yǎng)基。各組細(xì)胞OGD∕R后，每孔加入10 μL CCK-8溶液并在37°C黑暗條件下孵育2 h。在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值。細(xì)胞的存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組-空白組）∕（正常對(duì)照組-空白組）×100%。

1.5 透射電鏡吸棄培養(yǎng)基，用2.5%戊二醛固定液固定OGD∕R后的神經(jīng)元；細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞后，用巴氏管將細(xì)胞液吸入離心管中固定過(guò)夜；用1%四氯化鋨再次固定1 h后，在梯度酒精中脫水30 min，并包埋于環(huán)氧樹(shù)脂中；使用超薄切片機(jī)切成超薄切片（70～80 nm），用2%的乙酸鈾酰和2%的乙酸鉛染色切片；在透射電子顯微鏡（型號(hào)JEM-2000EX）下觀察切片。

1.6 細(xì)胞免疫熒光將細(xì)胞轉(zhuǎn)種于24孔板的蓋玻片上，密度為2.5×105∕孔。用4%多聚甲醛將收集的細(xì)胞爬片室溫固定20 min；用0.25%曲那通溶液37°C穿透15 min；5%山羊血清白蛋白37°C封閉1 h；加入按適當(dāng)比例稀釋的一抗混合液（鼠抗大鼠NeuN，1∶1000；兔抗大鼠GRP78，1∶1000；兔抗大鼠p-Akt，1∶400）并放置于4°C冰箱孵育過(guò)夜。次日，用PBS溶液洗滌3次后，加入配制好的二抗混合液（羊抗兔IgG抗體，1∶1000；羊抗鼠IgG抗體，1∶1000）于37°C孵育1 h；PBS溶液洗滌3次后，用含DAPI抗熒光淬滅劑封片。在熒光顯微鏡（型號(hào)：DMIL-RF1）下觀察，每張細(xì)胞爬片隨機(jī)選取5個(gè)不同視野獲取圖像。

1.7 蛋白免疫印跡提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用BCA法對(duì)蛋白定量；每10 μL含40 μg蛋白，加入適量的上樣緩沖液煮沸10 min。用10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳使蛋白分離；隨后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（200 mA，75 min）。用5%脫脂牛奶溶液封閉1 h后，PVDF膜與相應(yīng)的一抗混合液（兔抗大鼠p-Akt，1∶2000；兔 抗 大鼠 Akt，1∶1000；兔 抗大 鼠GRP78，1∶1000；兔抗大鼠CHOP，1∶250；兔抗大鼠Caspase12，1∶500；兔抗大鼠β-actin，1∶2000）在4°C冰箱孵育過(guò)夜。TBST溶液洗膜3次后，與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗溶液（1∶10000）于暗室常溫孵育1 h。TBST溶液洗膜3次后，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液于暗室曝光顯影，結(jié)果用ImageJ軟件作定量分析。

1.8 RT-PCR提取細(xì)胞總RNA后，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的含量和純度，依據(jù)RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)Prime5.0軟件設(shè)計(jì)出以下引物。GRP78：正向引物TCTGTGACACCTGACCGACC，反向引物TGAATACACCGACGCATAG。Caspase12：正向引物TTGGATACTCAGTGGTGATAAAGGA，反向引物：GGATGCCGTGGGACATAAAGA。CHOP：正向引物GCGGCTCAAGCAGGAAATC，反向引物TTGGCACTGGCGTGATGGT。β-actin：正向引物TCAGGTCATCACTATCGGCAAT，反向引物AAAG AAAGGGTGTAAAACGCA。按GenStar廠家建議構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系，充分混勻后進(jìn)行擴(kuò)增，按照試劑說(shuō)明書(shū)給出的反應(yīng)程序進(jìn)行RT-擴(kuò)增。β-actin用于標(biāo)準(zhǔn)化不同樣品中RNA的數(shù)量和質(zhì)量。采用比較Ct法（ΔΔCt法）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有計(jì)量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 瘦素對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的體外神經(jīng)元損傷的作用

2.1.1 神經(jīng)元純度鑒定以及確定合理的OGD∕R時(shí)間和藥物濃度 將培養(yǎng)7～8 d的神經(jīng)元進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色。經(jīng)熒光顯微鏡觀察，所有細(xì)胞胞核被DAPI染成藍(lán)色；FITC標(biāo)記為陽(yáng)性的細(xì)胞為紅色，即神經(jīng)元。計(jì)數(shù)神經(jīng)元陽(yáng)性率為90%以上（圖1）。

如表1所示，與正常對(duì)照組相比，隨著OGD時(shí)間的增加，細(xì)胞活力逐漸下降。在氧糖剝奪2 h和復(fù)糖復(fù)氧24 h后，細(xì)胞活力下降至42.06%。綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用2 h∕24 h作為OGD∕R時(shí)間。

表1 不同OGD時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率的影響

如表2所示，瘦素以濃度依賴的形式保護(hù)皮層神經(jīng)元免受OGD∕R損傷。與OGD∕R組比較，在瘦素濃度達(dá)到400 ng∕mL時(shí)，瘦素的神經(jīng)保護(hù)作用顯著（P＜0.01）。因此，選擇400 ng∕mL的劑量作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)瘦素預(yù)處理的濃度。

表2 不同瘦素濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響

2.1.2 瘦素對(duì)OGD∕R后神經(jīng)元的影響 正常條件下培養(yǎng)的神經(jīng)元，細(xì)胞核圓而亮且細(xì)胞質(zhì)豐富，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)完整。經(jīng)OGD∕R處理后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，即細(xì)胞皺縮，胞漿較少，并且神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)消失。與OGD∕R組比較，瘦素預(yù)處理后神經(jīng)元的改變明顯減少（圖2）。

四組細(xì)胞存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=215.00，P＜0.01）。CCK-8結(jié)果與顯微鏡下觀察結(jié)果一致（表3），即瘦素預(yù)處理后，神經(jīng)元OGD∕R后的細(xì)胞存活率明顯提高（P＜0.01）。然而，在添加LY294002后，神經(jīng)元OGD∕R后的細(xì)胞狀態(tài)變差，且細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.01）。

表3 各組神經(jīng)元存活率、p-Akt/Akt、GRP78 mRNA及蛋白表達(dá)量比較

2.1.3 瘦素對(duì)PI3K∕Akt信號(hào)通路的影響 正常組神經(jīng)元的胞質(zhì)處見(jiàn)少量p-Akt的表達(dá)。與正常組比較，OGD∕R處理后神經(jīng)元的胞核和胞質(zhì)處p-Akt光密度明顯增強(qiáng)；與OGD∕R組比較，瘦素預(yù)處理組p-Akt光密度明顯增強(qiáng)。蛋白印跡技術(shù)結(jié)果與細(xì)胞免疫熒光結(jié)果一致，p-Akt∕Akt組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=11.73，P＜0.05）。OGD∕R組p-Akt蛋白水平顯著高于正常組（P＜0.05）；瘦素組p-Akt蛋白水平顯著高于OGD∕R組（P＜0.05）；與瘦素組比較，LY+瘦素組p-Akt熒光強(qiáng)度及p-Akt∕Akt蛋白水平顯著降低（P＜0.05）(圖3，表3）。

2.2 瘦素對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

2.2.1 瘦素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)改變的影響 正常組的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈扁平的囊腔，排列整齊，彼此相通，并且網(wǎng)膜胞質(zhì)面附著大量核糖體；OGD∕R后出現(xiàn)擴(kuò)張的和部分碎裂的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，嵌有少量核糖體；與OGD∕R組比較，瘦素預(yù)處理能極大地減少上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的改變；然而，LY294002預(yù)處理神經(jīng)元能明顯干擾瘦素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的影響（圖4）。

2.2.2 瘦素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的促細(xì)胞存活因子GRP78表達(dá)的影響 GRP78蛋白表達(dá)量（F=12.03，P＜0.05）、GRP78 mRNA（F=15.67，P＜0.05）組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常組比較，OGD∕R組GRP78光密度明顯增強(qiáng)，并且在瘦素預(yù)處理后進(jìn)一步加強(qiáng)。蛋白印跡技術(shù)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，OGD∕R組的GRP78的mRNA和蛋白水平明顯增高（P＜0.05）；與OGD∕R組比較，瘦素組神經(jīng)元的GRP78 mRNA和蛋白水平顯著增高（P＜0.001，P＜0.05）；與瘦素組比較，LY+瘦素組GRP78 mRNA水平顯著降低（P＜0.01，P＜0.001）（圖5，表3）。

2.2.3 瘦素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的促凋亡因子CHOP和Caspase12表達(dá)的影響 四組神經(jīng)元中CHOP（F=17.36，P＜0.05）和Caspase12（F=15.80，P＜0.05）的蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，神經(jīng)元中CHOP mRNA（F=27.10，P＜0.01）和 Caspase12 mRNA（F=45.47，P＜0.01）的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常組比較，OGD∕R組 CHOP和 Caspase12 mRNA水平及蛋白表達(dá)量明顯增加（P＜0.001）；與OGD∕R組比較，瘦素組CHOP和Caspase12 mRNA水平及蛋白表達(dá)量顯著下降（P＜0.01）；與瘦素組比較，LY+瘦素組CHOP和Caspase12 mRNA水平及蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）（圖6，表4、5）。

表4 各組神經(jīng)元中CHOP和Caspase12的蛋白表達(dá)量比較

表5 各組神經(jīng)元中CHOP和Caspase12 mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

近年來(lái)，瘦素被報(bào)告能通過(guò)減輕細(xì)胞炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞過(guò)度凋亡等改善多器官缺血-再灌注損傷[12-14]。然而，瘦素參與腦缺血-再灌注的損傷具體機(jī)制尚未完全清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，瘦素通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減少OGD∕R誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，并且與其激活PI3K∕Akt信號(hào)通路有關(guān)。

瘦素是一種由脂肪細(xì)胞合成并分泌的脂肪細(xì)胞因子，它不僅在能量代謝和胰島素敏感性調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用，也在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要[15]。本研究通過(guò)倒置顯微鏡觀察神經(jīng)元的形態(tài)及CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)神經(jīng)元的存活率，結(jié)果顯示瘦素能有效提高體外神經(jīng)細(xì)胞存活率，維持細(xì)胞狀態(tài)，這與先前的研究報(bào)告一致，即瘦素預(yù)處理對(duì)OGD∕R后神經(jīng)元具有保護(hù)作用。PI3K∕Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，由G蛋白偶聯(lián)受體或受體酪氨酸激酶激活PI3K引起的?；罨腜I3K將4,5-二磷酸肌醇轉(zhuǎn)化為第二信使3,4,5-三磷酸磷脂肌醇，它與含有PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白Akt結(jié)合，使之移位到細(xì)胞膜。定位后，Akt（在Thr308殘基處）可被其上游調(diào)節(jié)劑如磷酸肌醇依賴性激酶1磷酸化，而Akt完全活化需在Ser473殘基處進(jìn)一步磷酸化[16]。活化的Akt與細(xì)胞存活、新陳代謝和蛋白質(zhì)合成等密切相關(guān)[17]。本研究通過(guò)免疫熒光觀察到，激活的Akt在OGD∕R條件下從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核，而這可能參與一系列生理過(guò)程，如促進(jìn)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、增生和抑制細(xì)胞凋亡。另外，本研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元OGD∕R后p-Akt的表達(dá)明顯提高，并且在瘦素預(yù)處理后p-Akt的表達(dá)進(jìn)一步升高，提示瘦素在再灌注期間上調(diào)p-Akt的表達(dá)。然而，在LY294002預(yù)處理后瘦素的神經(jīng)保護(hù)作用被削弱，如神經(jīng)元存活率下降，細(xì)胞狀態(tài)明顯變差，且p-Akt的表達(dá)下降，提示瘦素通過(guò)激活PI3K∕Akt信號(hào)通路發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。

CIRI的病理生理過(guò)程錯(cuò)綜復(fù)雜，受多種因素的調(diào)節(jié)，ERS是其中的重要機(jī)制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為多功能細(xì)胞器，其中存在數(shù)十種伴侶分子、酶和輔助因子，它們有助于新合成蛋白精確折疊，并協(xié)助多肽實(shí)現(xiàn)最終的功能構(gòu)象[18]。在生理環(huán)境下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊效率和信使核糖核酸翻譯速率相平衡。腦缺血條件下，折疊不良的蛋白積聚于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，競(jìng)爭(zhēng)性地與GRP78結(jié)合，導(dǎo)致3種跨膜蛋白激發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)的下游信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)[19]。據(jù)報(bào)告，GRP78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激期間不僅充當(dāng)壓力傳感器控制ERS激活，還作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊能力，抑制新生蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)并幫助折疊不良的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解以促進(jìn)細(xì)胞存活[20]。此外，GRP78在ERS期間具有抗凋亡作用，如上調(diào)抗凋亡因子Bcl2的表達(dá)，并下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)[21-23]。本研究結(jié)果顯示，OGD∕R顯著誘導(dǎo)GRP78的表達(dá)，且瘦素預(yù)處理后GRP78的表達(dá)進(jìn)一步升高，提示瘦素可能通過(guò)上調(diào)GRP78的表達(dá)抑制ERS以減輕OGD∕R損傷。若持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)無(wú)法恢復(fù)，ERS相關(guān)的細(xì)胞凋亡則會(huì)發(fā)生。CHOP相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子途徑和Caspase12依賴性途徑是ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的兩種特異性途徑，特別是Caspase12[24]。Caspase12位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜，是ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特異性蛋白水解酶，并不受其他死亡形式所激活[25]。本研究結(jié)果顯示，OGD∕R處理后CHOP和Caspase12的表達(dá)升高，但瘦素預(yù)處理后CHOP和Caspase12的表達(dá)明顯降低，這提示瘦素可能通過(guò)下調(diào)CHOP和Caspase12的表達(dá)抑制OGD∕R誘導(dǎo)的ERS。在病理狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)改變與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。透射電鏡顯示，與正常皮層神經(jīng)元比較，OGD∕R后細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹且部分破碎，膜上鑲嵌的核糖體明顯減少，提示未折疊蛋白反應(yīng)從促存活模式轉(zhuǎn)向促凋亡模式。然而，瘦素預(yù)處理明顯減輕了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)擴(kuò)張，表明瘦素可能通過(guò)抑制ERS來(lái)促進(jìn)神經(jīng)元存活。此外，LY294002預(yù)處理神經(jīng)元后，上述現(xiàn)象明顯被逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明瘦素可能通過(guò)PI3K∕Akt信號(hào)通路抑制ERS。

如何改善CIRI是治療缺血性卒中的一大挑戰(zhàn)。本研究初步驗(yàn)證了瘦素抑制OGD∕R誘導(dǎo)的ERS，且PI3K∕Akt信號(hào)通路可能參與其中。然而，考慮到臨床實(shí)踐與細(xì)胞試驗(yàn)之間的差異，以及瘦素對(duì)多個(gè)組織的影響，有必要通過(guò)高質(zhì)量、大樣本及多中心前瞻性研究來(lái)衡量瘦素在CIRI患者中的療效和安全性。此外，本研究未應(yīng)用更多的抑制劑或激動(dòng)劑來(lái)阻斷或激活相關(guān)的信號(hào)通路以進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，瘦素的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。