lncRNA OIP5-AS1 通過海綿吸附miR-143-3p調(diào)控COL1A1 促進(jìn)胃癌發(fā)展

劉 銳 褚偉偉 余明軍 王海明

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率都很高，尤其在東亞國家如中國、日本、韓國等。胃癌的發(fā)生是一個(gè)多階段、多因素、多因子的病理過程，由基因的表達(dá)突變和表觀遺傳改變所致[1]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是癌癥生物學(xué)的關(guān)鍵調(diào)控因子，可以在多個(gè)層面調(diào)控癌癥相關(guān)基因表達(dá)水平，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展[2]，但確切機(jī)制尚不清楚。lncRNA Opa 相互作用蛋白5 反義RNA 1（Opa-interacting protein 5 antisense RNA 1，OIP5-AS1）是位于人類OIP5 基因反義鏈上的lncRNA，通過不同的途徑促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展[3]。相關(guān)研究表明，lncRNA OIP5-AS1 與miR-143-3p 在腫瘤發(fā)展中起到重要作用[4-8]。然而，其在胃癌中的具體作用和機(jī)制尚未闡明。因此，本研究將探討lncRNA OIP5-AS1 通過靶向調(diào)控miR-143-3p 對(duì)胃癌細(xì)胞發(fā)展的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì) 胞 胃癌細(xì)胞AGS（目錄號(hào)TCHu232）購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，SGC7901（目錄號(hào)CL-0206）、MKN-45（目錄號(hào)CL-0292）、BGC823（目錄號(hào)CL-0033）及人正常胃細(xì)胞GES-1（目錄號(hào)CL-0563）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 試 劑 DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)10566016）和胎牛血清（批號(hào)10100147）均購自美國Gibco 公司；熒光素酶報(bào)告載體OIP5-AS1-WT、OIP5-AS1-MUT、Ⅰ型膠原α1（COL1A1）-WT、COL1A1-MUT 及相應(yīng)的對(duì)照質(zhì)粒購自上海吉瑪生物制藥有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒（批號(hào)E1910）購自美國Promega 公司；Lipofectamine2000（批號(hào)11668500）購自美國Invitrogen 公司；qRT-PCR 試劑盒購自（批號(hào)RR42LR）日本TaKaRa 公司；Anti-COL1A1（批號(hào)72026S）及山羊抗兔二抗（批號(hào)7074S）均購自美國CST 公司；Transwell 小室（批號(hào)3422）購自美國Corning 公司。

1.3 主要儀器 General Use Only 離心機(jī)，美國Thermo；FormaTMSteri-CycleTMCO2Incubator 培 養(yǎng)箱，美國Thermo；Multiskan FC 酶標(biāo)儀，美國Thermo；LightCycler 96 熒光定量PCR 儀，德國羅氏；TiS 熒光倒置顯微鏡，日本尼康；E1960 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，美國Promega 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將人正常胃細(xì)胞GES-1 和胃癌細(xì)胞AGS、SGC7901 置于含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長至85%時(shí)，加入胰酶消化傳代培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞稀釋，然后按照Lipofectamine 2000 試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細(xì)胞分組為陰性對(duì)照（si-NC）、si-lncRNA OIP5-AST（si-OIP5-AS1）、NC mimic、miR-143-3p mimic、si-OIP5-AS1+inhibitor NC、si-OIP5-AS1+miR-143-3p inhibitor 和si-OIP5-AS1+miR-143-3p mimic+si-COL1A1。

2.2 Western blot 檢測(cè) COL1A1 蛋白表達(dá)RIPA 裂解液提取三組細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg 蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。采用常規(guī)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，于5%的脫脂牛奶（TBST 溶解）室溫下封閉1 h。將膜置于稀釋的一抗溶液（1∶2000）室溫孵育2 h，PBST 洗膜每隔5 min 洗1 次，洗6 次；再將膜置于稀釋的二抗溶液中室溫孵育1.5 h（1∶5000），PBST 洗膜5 min，洗6次，化學(xué)發(fā)光顯色劑顯色。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）蛋白為內(nèi)參。

2.3 qRT-PCR 檢測(cè)miR-143-3p 和OIP5-AS1 的表達(dá) TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。檢測(cè)lncRNA OIP5-AS1 以βactin 為內(nèi)參，miR-143-3p 以U6 為內(nèi)參，使用2－ΔΔCt法計(jì)算miR-143-3p 和lncRNA OIP5-AS1 的相對(duì)表達(dá)水平。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃5 min，96 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35 個(gè)循環(huán)。所用引物序列（由上海生工生物合成）如下：miR-143-3p 的反轉(zhuǎn)錄引物為5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGAGCTA-3'。miR-143-3p 上游引物為5'-CGCGTGAGATGAAGCACTG-3'，下游引物為5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'。U6上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-ACGCT-TCACGAATTTGCGT-3'。OIP5-AS1上游引物為5'-CAGACCTGGCACAATGGCTCAC'-3'，下游引物為5'-GTGGGCTCAAACTGGGCTCAAG-3'。β-actin 上游引物為5'-TGTCAC-CAACTGGGACGATA-3'，下游引物為5'-GGGGTGTT-GAAGGTCTCAAA-3'。

2.4 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖 采用CCK-8 檢測(cè)試劑盒在96 孔板中測(cè)定細(xì)胞活力并設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。每孔加入10 μL CCK-8 試劑，在37 ℃黑暗培養(yǎng)箱中連續(xù)孵育3 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)在450 nm 處測(cè)定吸光度。

2.5 傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將細(xì)胞鋪到12孔板中，培養(yǎng)達(dá)到約100%的融合度。用10 μL 的移液槍槍頭在孔底造成劃痕，使用預(yù)冷的PBS 除去未附壁的細(xì)胞至無細(xì)胞脫落。將細(xì)胞放入不含血清的DMEM 中培養(yǎng)24 h。顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移距離。

2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 各組細(xì)胞用胰酶消化處理后，接種于Transwell 小室24 孔板內(nèi)，上室加入100 μL 細(xì)胞懸液，下室加250 μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，PBS 沖洗2 次至無細(xì)胞碎片，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min 后PBS 沖洗染色液，干燥后顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

2.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將構(gòu)建的OIP5-AS1 野生型載體OIP5-AS1-WT/突變型載體OIP5-AS1-MUT 以及COL1A1 野生型載體COL1A1-WT/突變型載體COL1A1-MUT 分別與NC mimic 或miR-143-3p mimic 共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染成功后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，按雙熒光素酶試劑盒操作說明檢測(cè)熒光素酶活性。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graph Pad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 lncRNA OIP5-AS1 在胃癌細(xì)胞系表達(dá)水平升高 qRT-PCR 測(cè)定結(jié)果顯示，lncRNA OIP5-AS1 在胃癌細(xì)胞AGS、SGC7901、BGC823、MKN-45 中表達(dá)水平分別是GES-1 細(xì)胞的6.10、5.53、3.90 和3.03倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。選擇表達(dá)水平較高的AGS 和SGC7901 細(xì)胞進(jìn)行下一步研究。

3.2 敲低lncRNA OIP5-AS1 抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 應(yīng)用siRNA 敲低lncRNA OIP5-AS1 的表達(dá)，并通過qRT-PCR 驗(yàn)證AGS、SGC7901 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染si-OIP5-AS1 后，lncRNA OIP5-AS1 表達(dá)水平分別降低至原來的0.25 和0.34 倍（P＜0.05）。通過CCK-8 分析lncRNA OIP5-AS1 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，與si-NC 相比，si-OIP5-AS1 轉(zhuǎn)染的AGS 和SGC7901 增殖明顯減少[AGS：（0.71±0.07）比（1.20±0.11）；SGC7901：（1.02±0.10）比（1.80±0.10），P均＜0.05]。此外，分別通過傷口愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell測(cè)定lncRNA OIP5-AS1 對(duì)胃癌細(xì)胞遷移（見圖1）和侵襲（見圖2）的影響，結(jié)果表明，AGS 和SGC7901 的遷移[AGS：（29.01±3.68）%比（72.04±6.82）%；SGC7901：（23.97±2.24）%比（62.02±3.73）%，P 均＜0.01]和侵襲能力[AGS：（35.68±6.96）個(gè)比（278.33±11.85）個(gè)；SGC7901：（62.74±12.77）個(gè) 比（248.65±12.03）個(gè)，P均＜0.01]因lncRNA OIP5-AS1 的敲低而顯著減弱。

圖1 傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)si-OIP5-AS1 對(duì)胃癌細(xì)胞遷移的影響

圖2 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)si-OIP5-AS1 對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲的影響

3.3 miR-143-3p 在胃癌細(xì)胞系表達(dá)水平顯著降低，COL1A1 表達(dá)水平升高 qRT-PCR 結(jié)果顯示，AGS和SGC7901 中miR-143-3p 表達(dá)水平分別是GES-1的0.56 和0.49 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Western blot 結(jié)果顯示，COL1A1 在胃癌細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)水平顯著高于GES-1 細(xì)胞（P＜0.01），見圖3。

圖3 Western blot 檢測(cè)COL1A1 在胃癌細(xì)胞和正常胃細(xì)胞中的表達(dá)水平

3.4 lncRNA OIP5-AS1 通過吸附miR-143-3p 調(diào)控COL1A1 的表達(dá) 通過starBase 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)lncRNA OIP5-AS1 與miR-143-3p，miR-143-3p 與COL1A1具有結(jié)合位點(diǎn)（見圖4）。同時(shí)，miR-143-3p mimic 顯著降低OIP5-AS1-WT 和COL1A1-WT 的熒光素酶活性（P＜0.01）（見表1）。qRT-PCR 結(jié)果顯示，敲低lncRNA OIP5-AS1 后，AGS 和SGC7901 細(xì)胞miR-143-3p 表達(dá)水平升高，分別為對(duì)照組的2.60 和2.13倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而Western blot 結(jié)果顯示，相比于si-NC 組COL1A1 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；此外，敲低lncRNA OIP5-AS1 對(duì)COL1A1 表達(dá)的抑制作用能夠被miR-143-3p inhibitor 所逆轉(zhuǎn)（P＜0.01），見圖5。

圖4 starBase 預(yù)測(cè)lncRNA OIP5-AS1、miR-143-3p、COL1A1的靶向結(jié)合位點(diǎn)

圖5 Western blot 檢測(cè)不同處理組胃癌細(xì)胞COL1A1 表達(dá)

表1 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)分析胃癌細(xì)胞lncRNA OIP5-AS1 與miR-143-3p、miR-143-3p 與COL1A1 間的相互關(guān)系（）

表1 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)分析胃癌細(xì)胞lncRNA OIP5-AS1 與miR-143-3p、miR-143-3p 與COL1A1 間的相互關(guān)系（）

注：NC mimic 組為每孔胃癌細(xì)胞加入100 nmol 的NC mimic 及5 μL 轉(zhuǎn)染試劑；miR-143-3p mimic 組為每孔胃癌細(xì)胞加入100 nmol 的miR-143-3p mimic 及5 μL 轉(zhuǎn)染試劑；OIP5-AS1 為Opa 相互作用蛋白5 反義RNA1；COL1A1 為Ⅰ型膠原α1；與NC mimic 組比較，aP＜0.01

3.5 lncRNA OIP5-AS1 通過調(diào)控miR-143-3p/COL1A1 影響胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 挽救實(shí)驗(yàn)表明，si-OIP5-AS1 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，能夠被miR-143-3p inhibitor 恢復(fù)；在此基礎(chǔ)上，敲低COL1A1 能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，見表2，圖6-7。

圖6 傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各處理組胃癌細(xì)胞的遷移

表2 各處理組胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲（）

表2 各處理組胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲（）

注：si-NC 組為每孔胃癌細(xì)胞加入100 pmol 的si-NC 及5 μL 轉(zhuǎn)染試劑；si-OIP5-AS1 組為每孔胃癌細(xì)胞加入100 pmol 的si-OIP5-AS1 及5 μL轉(zhuǎn)染試劑；si-OIP5-AS1+miR-143-3p inhibitor 組為每孔胃癌細(xì)胞加入100 pmol 的si-OIP5-AS1、100 nmol 的miR-143-3p inhibitor 和5 μL 轉(zhuǎn)染試劑；si-OIP5-AS1+miR-143-3p inhibitor+si-COL1A1 組為每孔胃癌細(xì)胞加入100 pmol 的si-OIP5-AS1、100 nmol 的miR-143-3p inhibitor、100 nmol 的si-COL1A1 和5 μL 轉(zhuǎn)染試劑；OIP5-AS1 為Opa 相互作用蛋白5 反義RNA1；COL1A1 為Ⅰ型膠原α1；與si-NC 組比較，aP＜0.01；與si-OIP5-AS1 組比較，bP＜0.01；與si-OIP5-AS1+miR-143-3p inhibitor 組比較，cP＜0.01

4 討論

由于早期胃癌缺乏特異性癥狀，大多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已為中晚期，預(yù)后差。目前被證實(shí)的胃癌高危因素包括幽門螺桿菌感染、過量攝入鹽和硝酸鹽、肥胖等，此外，異常的分子信號(hào)通路也參與了胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[9]。lncRNA 的失調(diào)參與了癌癥中的細(xì)胞增殖、腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，同時(shí)，lncRNA 作為miRNA的分子海綿，阻斷靶轉(zhuǎn)錄本的結(jié)合活性[10]。已有多種lncRNA 被鑒定為致癌或抑癌因子，如XIST、GAS5、HOTAIR 和MALAT1[11]。lncRNA 已被證明參與了不同癌癥類型，據(jù)報(bào)道lncRNA OIP5-AS1 通過靶向調(diào)控miR-378a-3p 促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖，而敲低lncRNA 表達(dá)會(huì)抑制肺癌細(xì)胞的增殖[12]。Yang 等[13]也發(fā)現(xiàn)，lncRNA OIP5-AS1 通過調(diào)控miR-410 的表達(dá)調(diào)控其靶基因KLF10，從而促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖、周期進(jìn)展和抑制凋亡，影響下游信號(hào)通路。本研究也發(fā)現(xiàn)，lncRNA OIP5-AS1 在胃癌細(xì)胞系中表達(dá)水平顯著升高。

圖7 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各處理組胃癌細(xì)胞AGS 和SGC7901 的侵襲

多項(xiàng)研究表明，miR-143 在人類癌癥中表達(dá)下調(diào)，其中miR-143-3p 發(fā)揮腫瘤抑制因子的關(guān)鍵作用，通過靶向癌基因參與人類癌癥的發(fā)病過程，靶向HK2 在食管鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮作用[14]。miR-143-3p表達(dá)下調(diào)與卵巢癌的進(jìn)展有關(guān)[15]。這說明miR-143-3p 的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有直接的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，miR-143-3p 抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

COL1A1 基因編碼Ⅰ型膠原的α1 鏈，是主要的細(xì)胞外基質(zhì)成分，已在多種類型的癌癥中被證實(shí)。據(jù)報(bào)道COL1A1 在胃癌中表達(dá)上調(diào)，并影響胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[16]。本研究結(jié)果顯示，COL1A1 在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

本研究中，生物信息預(yù)測(cè)miR-143-3p 的上下游靶標(biāo)分子，發(fā)現(xiàn)miR-143-3p 能夠靶向作用于lncRNA OIP5-AS1，以及下游COL1A1 mRNA 的3’-UTR，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)以及挽救實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了lncRNA OIP5-AS1 通過海綿吸附miR-143-3p 上調(diào)COL1A1 促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲進(jìn)，影響胃癌細(xì)胞的發(fā)展。