腎上腺靜脈取血聯(lián)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析腎上腺激素代謝譜在原發(fā)性雙側(cè)腎上腺大結(jié)節(jié)增生診斷中的應(yīng)用

李楠，張倩，楊國(guó)慶，呂朝暉，裴育，李春霖，謝雯春，王凱

原發(fā)性雙側(cè)腎上腺大結(jié)節(jié)增生（primary bilateral marconodular adrenal hyperplasia，PBMAH）是一種罕見(jiàn)的庫(kù)欣綜合征亞型，所占比例不足1%［1］。其臨床表現(xiàn)多不典型，生化特征表現(xiàn)為血促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）水平低或正常、皮質(zhì)醇不完全或不被地塞米松抑制、24 h尿游離皮質(zhì)醇升高或正常，影像學(xué)表現(xiàn)為雙側(cè)腎上腺結(jié)節(jié)樣增生改變。學(xué)術(shù)界在很長(zhǎng)一段時(shí)間認(rèn)為該病為ACTH非依賴(lài)性，命名為“ACTH非依賴(lài)性大結(jié)節(jié)樣腎上腺增生”（ACTH-independent marconodular adrenal hyperplasia，AIMAH）。但隨著對(duì)其發(fā)病機(jī)制的深入研究，證實(shí)PBMAH病人腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞簇通過(guò)旁分泌和自分泌的方式表達(dá)產(chǎn)生ACTH刺激皮質(zhì)醇分泌［2］，“非ACTH依賴(lài)性”的說(shuō)法不太妥當(dāng)，而PBMAH更合適。雖然PBMAH發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，但目前研究發(fā)現(xiàn)腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞異常表達(dá)的多樣化激素受體參與了該病皮質(zhì)醇分泌的調(diào)控［3］。

在過(guò)去的十幾年里，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）用于測(cè)定類(lèi)固醇激素促進(jìn)了腎上腺皮質(zhì)疾病的研究［4］。與免疫法相比，HPLC-MS/MS不僅特異性、敏感性更好，而且一次可以檢測(cè)多種物質(zhì)［5］。本研究應(yīng)用腎上腺靜脈取血（adrenal vein sampling，AVS）聯(lián)合HPLC-MS/MS的方法對(duì)一例雙側(cè)腎上腺占位擬診PBMAH的病人行腎上腺激素水平測(cè)定分析，探討該方法在PBMAH的診斷和發(fā)病機(jī)制探討中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料男，59歲，因“發(fā)現(xiàn)血壓高10年，雙側(cè)腎上腺占位1年半”于2019年7月收入解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心內(nèi)分泌科住院，血壓119/78 mmHg，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）22.4 kg/m2，無(wú)滿(mǎn)月臉、水牛背、向心性肥胖，無(wú)皮膚菲薄、瘀斑或?qū)挻笞霞y等典型庫(kù)欣體貌。化驗(yàn)提示肝、腎功能、甲狀腺功能均正常，血鉀3.99 mmol/L，睪酮8.9 nmol/L，雌二醇132.21 pmol/L，黃體生成素6.03 U/L，泌乳素5.71 μg/L，卵 泡 刺 激 素13.68 U/L，孕 酮0.8 nmol/L。 血ACTH-皮質(zhì)醇節(jié)律及地塞米松抑制試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 ACTH-皮質(zhì)醇節(jié)律及地塞米松抑制試驗(yàn)情況

血皮質(zhì)醇368.69 nmol/L，ACTH＜1.1 pmol/L，對(duì)照日24 h尿游離皮質(zhì)醇（urinary free cortisol，UFC）303.5 nmol。小劑量地塞米松抑制試驗(yàn)服藥后24 h UFC為180.8 nmol，大劑量地塞米松抑制試驗(yàn)服藥后24 h UFC 182.2 nmol/L。腎上腺CT提示雙側(cè)腎上腺區(qū)可見(jiàn)多個(gè)類(lèi)圓形結(jié)節(jié)影，邊緣光滑，密度均一，增強(qiáng)后病灶呈中度均勻強(qiáng)化，最大直徑2.1 cm。見(jiàn)圖1。

圖1 腎上腺CT圖像

受試者按照自愿參加的原則，病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 腎上腺取血結(jié)果判定方法空腹10 h，晨7～10時(shí)在局麻下行雙側(cè)腎上腺靜脈取血。術(shù)中經(jīng)雙側(cè)股靜脈入路，分別取雙側(cè)外周靜脈（股靜脈）、腎上腺靜脈血各兩管，每管6 mL，冰浴立即送檢，一份測(cè)定血ACTH、游離皮質(zhì)醇（free cortisol，F(xiàn)）（化學(xué)發(fā)光法）和醛固酮（放射免疫法）。計(jì)算雙側(cè)腎上腺靜脈與外周靜脈血F的比值（腎上腺靜脈血F/股靜脈血F）及雙側(cè)腎上腺靜脈的血F與醛固酮的比值比［（腎上腺靜脈血F/同側(cè)腎上腺靜脈血醛固酮）（/對(duì)側(cè)腎上腺靜脈血F/對(duì)側(cè)腎上腺靜脈血醛固酮）］，按照梅奧診所的標(biāo)準(zhǔn)，腎上腺靜脈與外周靜脈血F比值大于6.5提示皮質(zhì)醇分泌腺瘤，雙側(cè)腎上腺靜脈血F與醛固酮的比值比大于2.3為單側(cè)功能腺瘤的診斷閾值［6］。另一份采用HPLC-MS/MS行腎上腺激素代謝譜測(cè)定，分析腎上腺局部與外周血的代謝譜情況。

1.3 HPLC-MS/MS材料和方法

1.3.1 主要試劑 包括孕烯醇酮、孕酮、17-α-羥孕酮、皮質(zhì)醇、可的松、睪酮、二氫睪酮、脫氧皮質(zhì)酮、雄烯二酮、脫氫異雄酮、皮質(zhì)酮、11-脫氧皮質(zhì)醇、醛固酮、雌酮、雌二醇、雌三醇、17-α-羥孕烯醇酮、脫氫異雄酮硫酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)品混合液（除脫氫異雄酮濃度范圍為1～30 000 μg/L以外，其余激素濃度范圍為0.01～300.00 μg/L），內(nèi)標(biāo)混標(biāo)工作液（濃度：10 μg/L），質(zhì)譜級(jí)甲醇，純凈水。

1.3.2 樣本及標(biāo)品前處理方法 使用移液器量取200 μL樣本或標(biāo)品溶液于1.5 mL離心管中，加入50 μL內(nèi)標(biāo)混標(biāo)工作液和400 μL沉淀液。將溶液充分混勻并于14 000 r/min條件下離心10 min，離心后收集上清液備用。使用固相萃取柱（Oasis PRiME HLB uElution plate）進(jìn)一步純化樣本，分別用200 μL甲醇和200 μL水活化固相萃取柱，將上清液及磷酸溶液混勻后上樣，隨后用200 μL甲醇溶液進(jìn)行清洗，30 μL甲醇進(jìn)行洗脫，最后加入70 μL水于洗脫液中并混勻，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 液質(zhì)方法 島津液相色譜儀LC-20ADXR和AB Sciex QTRAP 5500三重四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行聯(lián)用，選用Turbo-V電噴霧離子源。色譜柱為Waters C18色譜柱，柱子的長(zhǎng)度為100 mm，內(nèi)徑為2.1 mm.流動(dòng)相分別為含有氟化銨的水相（A相）和甲醇（B相）。色譜梯度由40%甲醇升至85%甲醇，隨后使用100%甲醇沖洗3 min?？偭魉贋?.45 mL/min。選擇正離子及負(fù)離子模式，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式掃描待測(cè)物，離子化電壓4 500 V，源溫度700℃。

使用Analyst軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和處理。

2 結(jié)果

腎上腺靜脈取血結(jié)果如表2所示，左側(cè)腎上腺與外周血F比值3.46，右側(cè)腎上腺與外周血F比值2.99，兩側(cè)經(jīng)醛固酮校正后的F比值比為1.35（左/右），提示雙側(cè)無(wú)明顯差異。ACTH在雙側(cè)腎上腺局部均高于外周血，左側(cè)腎上腺靜脈與股靜脈ACTH比值為1.34，右側(cè)腎上腺與股靜脈ACTH比值為1.41。

表2 患者雙側(cè)腎上腺靜脈取血測(cè)定的激素情況

質(zhì)譜分析代謝譜測(cè)定結(jié)果如表3所示，股靜脈血的類(lèi)固醇激素代謝產(chǎn)物無(wú)明顯的升高。而腎上腺局部取血的類(lèi)固醇激素水平有不同程度的升高表現(xiàn)，醛固酮、可的松、雌二醇等激素水平處于正常范圍，但相應(yīng)的前體物質(zhì)皮質(zhì)酮、皮質(zhì)醇、雌酮均升高。

表3 腎上腺取血HPLC-MS/MS分析腎上腺激素代謝譜情況

圖2所示為右側(cè)腎上腺質(zhì)譜分析結(jié)果，可見(jiàn)腎上腺皮質(zhì)激素代謝均處于激活狀態(tài)，鹽皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素、性腺激素都有不同程度的升高。

圖2 右腎上腺質(zhì)譜分析代謝譜

經(jīng)AVS證實(shí)病人為PBMAH所致的亞臨床庫(kù)欣綜合征，雙側(cè)腎上腺皮質(zhì)分泌差異不明顯，因皮質(zhì)醇水平升高不明顯，臨床癥狀不顯著，病人要求繼續(xù)觀(guān)察。口服藥物控制血壓，監(jiān)測(cè)血糖、血脂、骨代謝情況，定期復(fù)查腎上腺CT，評(píng)估腎上腺功能。半年后隨訪(fǎng)，病人病情平穩(wěn)，血壓波動(dòng)在120～135/75～89 mmHg，生化提示血糖5.7 mmol/L，鉀4.16 mmol/L，低密度脂蛋白膽固醇2.62 mmol/L。

3 討論

PBMAH病人的診斷需要全面系統(tǒng)的影像學(xué)表現(xiàn)評(píng)估和內(nèi)分泌學(xué)研究。因病人常不具備典型庫(kù)欣綜合征表現(xiàn)，常常以影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)的腎上腺意外瘤就診。生化檢查異常包括血、尿皮質(zhì)醇水平升高，皮質(zhì)醇晝夜分泌戒律消失，ACTH正?；蚱停┝考按髣┝康厝姿梢种圃囼?yàn)不能被抑制［7］。影像學(xué)檢查中，PBMAH以良性、雙側(cè)腎上腺增生性和大結(jié)節(jié)樣改變?yōu)樘卣鳎I上腺可能有明顯的增大。但是目前影像學(xué)手段，如CT或者磁共振不能區(qū)分腎上腺占位是否有功能。18F-PET/CT作為功能影像學(xué)方法，在腎上腺皮質(zhì)醇瘤的檢測(cè)敏感性50%，特異性81.8%［8］，且功能與非功能腫瘤之間的SUV值有很大的重疊，限制了該檢查的辨識(shí)能力。

PBMAH病人的術(shù)后病理學(xué)組織檢查是明確診斷的進(jìn)一步手段。PBMAH病人的腎上腺組織存在一個(gè)或多個(gè)大結(jié)節(jié)，直徑一般大于0.4 cm，結(jié)節(jié)由富含脂質(zhì)的透明細(xì)胞和不含脂質(zhì)的致密細(xì)胞組成，外觀(guān)上呈黃色大結(jié)節(jié)，似“生姜樣”改變。透明細(xì)胞主要表達(dá)3-β類(lèi)固醇脫氫酶，透明細(xì)胞來(lái)自腎上腺束狀帶，每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的皮質(zhì)醇量很少。致密細(xì)胞主要表達(dá)17-α羥化酶［9］。這些酶學(xué)和代謝產(chǎn)物的細(xì)微變化在亞臨床階段的外周血檢測(cè)中可能很難發(fā)現(xiàn)，腎上腺局部取血陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)的可能更大，這就促進(jìn)了AVS在疾病診斷中的應(yīng)用。治療方面，雙側(cè)腎上腺切除被認(rèn)為最為有效的方法，但是術(shù)后病人永久性腎上腺功能減退和可能增加的死亡率是臨床醫(yī)生始終面臨的巨大挑戰(zhàn)［10］。因此，在AVS基礎(chǔ)上行單側(cè)腎上腺切除是目前臨床上可用的方法［10］。AVS可以區(qū)分雙側(cè)腎上腺占位是否存在優(yōu)勢(shì)側(cè)，是決定手術(shù)方案的重要手段［11］。另外，隨著PBMAH腎上腺皮質(zhì)異常受體被發(fā)現(xiàn)，PBMAH受體靶向治療已成為一種可能的治療手段，但仍需要進(jìn)一步研究［12-13］。

目前臨床上激素檢測(cè)的方法為免疫分析方法，包括放射免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、電化學(xué)發(fā)光法等。免疫法檢測(cè)快、成本低，但是特異性差，容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，而且一次只能檢測(cè)一種類(lèi)固醇激素［14］，因此，在復(fù)雜內(nèi)分泌疾病的診斷和研究中有一定的局限性。HPLC-MS/MS能夠同時(shí)分析樣品中的多個(gè)研究目標(biāo)。在過(guò)去的十幾年中，HPLC-MS/MS技術(shù)在藥物監(jiān)測(cè)、新生兒篩查、毒理學(xué)診斷等臨床領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，是一種可靠的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)［15-16］。HPLC-MS/MS方法不但靈敏度、特異度高，還可以同時(shí)檢測(cè)多種結(jié)構(gòu)類(lèi)似但分子量不同的物質(zhì)，檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍寬，可對(duì)濃度范圍分布非常廣的多種激素進(jìn)行可靠檢測(cè)，適用于內(nèi)分泌疾病中復(fù)雜激素譜的定量檢測(cè)［4］。既往內(nèi)分泌疾病的研究中，HPLC-MS/MS的應(yīng)用擴(kuò)大了可測(cè)量的激素譜，對(duì)腎上腺疾?。ㄈ缭l(fā)性醛固酮、庫(kù)欣綜合征等）特征的描述和診斷方面具有較好的價(jià)值和應(yīng)用前景［4］。一項(xiàng)84例庫(kù)欣綜合征病人的研究顯示，HPLC-MS/MS測(cè)定的激素譜對(duì)庫(kù)欣綜合征的診斷準(zhǔn)確率為87%，特異性89%，在區(qū)分不同亞型的庫(kù)欣綜合征時(shí)具有良好的準(zhǔn)確性，總的錯(cuò)誤分類(lèi)率為9.5%，這個(gè)效力與所有的傳統(tǒng)分類(lèi)方法相結(jié)合的效力相似［17-19］。與ACTH依賴(lài)性庫(kù)欣綜合征病人相比，腎上腺庫(kù)欣綜合征病人HPLC-MS/MS測(cè)定的激素譜表現(xiàn)出更低水平的雄激素前體和較高水平的11-脫氧皮質(zhì)酮。

本研究應(yīng)用AVS聯(lián)合HPLC-MS/MS的方法測(cè)定一例雙側(cè)腎上腺占位病人腎上腺局部和外周血中激素水平，結(jié)果可見(jiàn)腎上腺局部ACTH和皮質(zhì)醇均高于外周血，雙側(cè)無(wú)明顯差異。結(jié)合病人實(shí)驗(yàn)室檢查、腎上腺影像學(xué)表現(xiàn)和AVS結(jié)果，PBMAH診斷明確，且雙側(cè)腎上腺皮質(zhì)醇分泌差異不大。與文獻(xiàn)報(bào)道類(lèi)似［17］，本例病人HPLC-MS/MS激素代謝譜中，腎上腺局部的皮質(zhì)酮、脫氧皮質(zhì)酮、11-脫氧皮質(zhì)酮水平升高，而睪酮水平下降，符合腎上腺源性庫(kù)欣綜合征的特點(diǎn)。病人雙側(cè)腎上腺局部的皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、17α羥孕烯醇酮等水平均高于正常水平，而外周血中激素水平正常。HPLC-MS/MS的結(jié)果在進(jìn)一步證明了AVS結(jié)果正確的同時(shí)，在病因上有一定的解釋。既往認(rèn)為PBMAH為ACTH非依賴(lài)性，但研究發(fā)現(xiàn)病人腎上腺皮質(zhì)阿皮黑素表達(dá)增加且局部可以生成ACTH［2］，同時(shí)腎上腺皮質(zhì)存在異位激素受體（如腸抑胃肽受體、β腎上腺素能受體、5-羥色胺受體等）或受體表達(dá)增加（如促黃體生成素受體、絨毛膜促性腺激素受體等），這些使得PBMAH病人腎上腺局部形成了一個(gè)重要的旁分泌、自分泌調(diào)控系統(tǒng)［3］。本研究的結(jié)果很直觀(guān)地證實(shí)了PBMAH病人腎上腺局部ACTH和類(lèi)固醇激素分泌的增加，也間接證實(shí)了腎上腺皮質(zhì)旁分泌、自分泌系統(tǒng)的存在。

因此，本研究通過(guò)AVS聯(lián)合HPLC-MS/MS的方法測(cè)定一例雙側(cè)腎上腺占位病人腎上腺局部和外周血中激素水平，明確了PBMAH的診斷，并對(duì)該病的病因?qū)W研究有一定的幫助。AVS聯(lián)合HPLC-MS/MS可以很好地體現(xiàn)局部和周?chē)I上腺激素代謝譜的情況，有可能成為PBMAH臨床診斷和治療決策的重要手段之一。