N-糖蛋白去糖基化酶（PNGase）的研究進(jìn)展*

陳妍雯 袁舒穎 劉瑞杰 張紹興 鄒琳 蘆鑫榮 孔維溧 陳力** 孫桂芹**

（1）浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與信息工程學(xué)院，杭州 310053；2）復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生健康委員會(huì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032）

N-糖蛋白去糖基化酶（peptide∶N-glycanase，簡(jiǎn)寫為PNGase），又稱為N-糖肽酶、N-糖酰胺酶、肽-N-糖苷酶，廣泛分布于原核和真核生物中，可以水解多肽上天冬酰胺（Asn）連接的寡糖，并釋放出完整寡糖鏈［1］。不同物種來(lái)源的PNGase，基因長(zhǎng)度及氨基酸序列不同，生物學(xué)功能上也有一定差異性。PNGase參與秀麗線蟲的生殖，并與果蠅生長(zhǎng)、小鼠胚胎發(fā)育有關(guān)［2-3］。人體內(nèi)的PNGase NGLY1（N-glycanase 1）缺陷，會(huì)引起罕見(jiàn)遺傳性疾病先天性去糖基化障礙，患者出現(xiàn)發(fā)育遲緩、運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀［4］；對(duì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙的Ngly1缺陷小鼠模型補(bǔ)充其表達(dá)，模型小鼠的運(yùn)動(dòng)功能得到一定恢復(fù)［5］。NGLY1在人黑色素瘤細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)黑色素瘤細(xì)胞NGLY1，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制［6］。上述研究結(jié)果提示，PNGase可能在生物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有重要意義。本文闡述了PNGase在不同物種中的分布、酶的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能，為PNGase的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究提供依據(jù)。

1 PNGase的分布

PNGase在真核生物（真菌、線蟲、哺乳動(dòng)物等）和原核生物（細(xì)菌）中均有分布，本文對(duì)已報(bào)道的不同物種來(lái)源PNGase進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表1）。

1.1 真核生物的PNGase

PNGase在真核生物廣泛存在，包括真菌、植物、線蟲、哺乳動(dòng)物等［7-10］。1977年，Takahashi等［9］在杏仁（Almond）中首次發(fā)現(xiàn)PNGase，命名為糖胺酶A，即PNGase A。之后陸續(xù)在大豆［11］、水 稻［12］、擬 南 芥［13］和 番 茄［14］等 植 物 中 發(fā) 現(xiàn)PNGase。1997年，真菌塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）中 發(fā) 現(xiàn)PNGase，命 名 為PNGase At［7］。Suzuki等［15］在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)第二個(gè)真菌PNGase YPNG1。裂殖酵母中也發(fā)現(xiàn)有SpPNGase［16］。

無(wú)脊椎動(dòng)物秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅（線蟲和果蠅的壽命短、繁殖速度快）中發(fā)現(xiàn)的PNGase［17-18］，多用于PNGase體內(nèi)功能研究。1991年Seko等［19］在脊椎動(dòng)物青鳉魚（Medaka fish）的卵中發(fā)現(xiàn)PNGase。1993年，小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Ngly1、人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)NGLY1（N-glycanase 1，又稱為Nglycanase，PNGase）［10］；后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)人NGLY1的缺陷會(huì)導(dǎo)致遺傳性疾病NGLY1型先天性去糖基化 障 礙（NGLY1-related congenital disorder of deglycosylation，NGLY1-CDDG）［4］。

1.2 原核生物的PNGase

目前，原核生物的PNGase僅在腦膜炎敗血伊麗莎白菌（Elizabethkingia meningoseptica，縮寫為EM；又稱為腦膜炎膿毒黃桿菌，F(xiàn)lavobacteriummeningosepticum）中發(fā)現(xiàn)，共兩種PNGase，分別命名為PNGase F和PNGase F-Ⅱ。

1984年，Plummer等［20］在EM中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)細(xì)菌來(lái)源的PNGase并命名為PNGase F，PNGase F能完整水解并釋放糖蛋白上的N-糖鏈，但不能作用于含有α-1,3核心巖藻糖基化的N-糖蛋白。2015年，孫桂芹等［3］在EM中發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)細(xì)菌來(lái)源的PNGase F-Ⅱ，PNGase F-Ⅱ在具有PNGase F功能的同時(shí)，還可水解并釋放植物和昆蟲來(lái)源的含有α-1,3核心巖藻糖基化N-糖蛋白的完整糖鏈。

Table 1 Basic information statistics table of N-glycosidase from different species表1 不同物種PNGase的基本信息統(tǒng)計(jì)表

2 PNGase的結(jié)構(gòu)

不同物種PNGase是均具有去糖基化功能的同工酶，其基因序列、酶結(jié)構(gòu)等各有特點(diǎn)。

2.1 不同物種PNGase的同源性

PNGase在不同物種內(nèi)雖然具有相似功能，但其氨基酸長(zhǎng)度和序列有較大差異。根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的PNGase相關(guān)氨基酸序列，進(jìn)行序列比對(duì)，本文繪制了部分PNGase的進(jìn)化樹(shù)（圖1）。由圖可知，原核、真核生物PNGase有較大的遺傳距離，但在真核生物中有一定的保守性，人與黑猩猩的PNGase同源性最近。

2.2 PNGase的結(jié)構(gòu)

2.2.1 真核來(lái)源的PNGase

Fig.1 Phylogenetic tree analysis of PNGase圖1 部分PNGase的進(jìn)化樹(shù)分析

目前，真菌、植物和動(dòng)物來(lái)源的PNGase分子結(jié)構(gòu)僅有部分得到解析。人NGLY1蛋白含有PUB、PNG Core、PAW 3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域［24］（圖2a），其中PUB區(qū)域的結(jié)構(gòu)已被解析，該結(jié)構(gòu)域由5個(gè)α螺旋和3個(gè)反平行的β折疊構(gòu)成。PUB是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的區(qū)域；PNG Core是NGLY1催化N-糖蛋白去糖基化的區(qū)域；PAW參與NGLY1與寡糖結(jié)合［25］。通過(guò)AlphaFold2模擬了NGLY1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖2b），根據(jù)模擬結(jié)果，PUB結(jié)構(gòu)域有一長(zhǎng)臂狀結(jié)構(gòu)，可能與幫助蛋白質(zhì)結(jié)合相關(guān)。釀酒酵母YPNG1分子結(jié)構(gòu)已得到解析，分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)域；小鼠Ngly1僅有PUB結(jié)構(gòu)域得到解析。

Fig.2 Structure of human PNGase圖2 人PNGase的結(jié)構(gòu)

2.2.2 原核來(lái)源的PNGase

PNGase F的保守結(jié)構(gòu)域包括PNG-N與PNG-C（圖3）。PNGase F的活性中心，是兩個(gè)8字反向β折疊形成的結(jié)構(gòu)域，底物在活性中心內(nèi)與3個(gè)酸性氨基酸結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)分別為Asp60、Glu118和Glu206。Kuhn等［26］認(rèn)為Asp60位點(diǎn)起催化作用，Glu118位點(diǎn)主要參與底物的識(shí)別與結(jié)合，Glu206位點(diǎn)主要穩(wěn)定底物分子與酶的結(jié)合。

PNGase F-Ⅱ的N端為GLPGLi結(jié)構(gòu)、C端為PNG-N和PNG-C結(jié)構(gòu)域（圖3），后兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間由10個(gè)氨基酸組成的α螺旋連接。GLPGLi結(jié)構(gòu)域由10個(gè)β折疊和兩個(gè)α螺旋組成，與Glu82和Asp189結(jié)合，帶正電荷。PNGase F-Ⅱ靠近C端的PNG-N和PNG-C與PNGaseF的相似，但PNGaseF-Ⅱ沒(méi)有Glu118位點(diǎn)，比PNGase F多了3個(gè)與底物識(shí)別相關(guān)的loop環(huán)［3］。

Fig.3 Structure of prokaryotic PNGase［3］圖3 原核生物PNGase的結(jié)構(gòu)［3］

3 PNGase的功能研究

3.1 PNGase的酶學(xué)功能研究

PNGase能夠裂解N-連接糖肽或糖蛋白上天冬酰胺殘基與N-乙酰葡糖胺與之間的酰胺鍵，使天冬酰胺轉(zhuǎn)化為天冬氨酸，生成含有天冬氨酸的多肽鏈并釋放完整的N-糖鏈［27-28］。根據(jù)糖蛋白糖鏈外層鏈結(jié)構(gòu)的不同，糖蛋白可分為高甘露糖型（high-mannose，含有多個(gè)α-連接的甘露糖殘基）、復(fù)雜型（hybrid，含有以巖藻糖、半乳糖和唾液糖為組分的糖鏈殘基）與雜合型（complex，兼有高甘露糖型、復(fù)雜型特點(diǎn)）。PNGase對(duì)復(fù)合型、雜合型、高甘露糖型糖鏈均可切除；能水解的N-糖蛋白或N-糖肽的氨基酸序列為Ser/Thr-X-Asn（Ser：絲氨酸，Thr：蘇氨酸，X：除脯氨酸以外的任何氨基酸）［1］。PNGase的酶切位點(diǎn)示意圖見(jiàn)圖4。

目前平臺(tái)已承接全國(guó)用戶規(guī)模達(dá)10 000個(gè)，300家企業(yè)及代理商接入系統(tǒng)平臺(tái)，8個(gè)區(qū)域數(shù)據(jù)中心；全國(guó)合作運(yùn)營(yíng)光纖傳輸網(wǎng)絡(luò)范圍達(dá)到14 000多公里，覆蓋全國(guó)200多個(gè)城市，目前是裝備制造業(yè)中最大的分布云網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)綜合服務(wù)提供商和運(yùn)營(yíng)商。

Fig.4 Schematic diagram of the restriction site of PNGase圖4 PNGase的酶切位點(diǎn)示意圖

Suzuki等［24］報(bào)道，人NGLY1的主要作用底物為高甘露糖型N-糖蛋白。原核來(lái)源的PNGase F具有廣泛的底物特異性，可以酶切RNase B、Ova、IgG等底物，但不能切除帶有α-1,3-核心巖藻糖N-糖蛋白上的寡糖鏈，例如辣根過(guò)氧化物酶（HRP，植物來(lái)源蛋白）［2］；而同為原核來(lái)源的PNGase F-Ⅱ，除了具有PNGase F的功能，可水解釋放含有α-1,3核心巖藻糖N-糖蛋白的完整糖鏈［3］。其余物種來(lái)源的PNGase具有相似的酶學(xué)功能。

3.2 PNGase的生物學(xué)功能研究

已有研究顯示，PNGase在真核生物中發(fā)揮一定的生物學(xué)功能，如器官發(fā)育、個(gè)體生長(zhǎng)等［4，29-30］。當(dāng)人NGLY1缺陷時(shí)，會(huì)導(dǎo)致先天性去糖基化障礙［4，6］。PNGase在原核生物中的生物學(xué)功能尚未明確，本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PNGase F在炎癥機(jī)體中可能促進(jìn)細(xì)胞因子風(fēng)暴，從而加重EM感染宿主的炎癥反應(yīng)［31］。

3.2.1 PNGase與人類疾病

人體內(nèi)蛋白質(zhì)糖基化修飾作用缺陷，會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生，如糖基化障礙（congenital disorder of glycosylation，CDG）。N-糖基化缺陷是CDG糖基化缺陷類型之一，與PNGase缺陷相關(guān)［32］。由NGLY1缺陷引起的NGLY1-CDDG，患者出現(xiàn)發(fā)育遲緩、智力缺陷、運(yùn)動(dòng)功能障礙等臨床癥狀［4］。本課題組于2020年報(bào)道了6例中國(guó)NGLY1-CDDG患者，并對(duì)NGLY1-CDDG的臨床及基礎(chǔ)研究進(jìn)行了綜述［33-34］。

另外，Zolekar等［6］對(duì)人皮膚黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細(xì)胞相比正常黑色素細(xì)胞NGLY1高表達(dá)；體外敲除黑色素瘤細(xì)胞NGLY1基因，黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制、死亡，提示NGLY1與黑色素瘤的高度相關(guān)性，抑制NGLY1可能作為新的黑色素瘤治療策略。

3.2.2 PNGase與鼠模型疾病

Fujihira等［30］敲除C57BL/6品系小鼠的Ngly1基因，觀察發(fā)現(xiàn)C57BL/6Ngly1+/-缺陷的雌雄小鼠配交后，Ngly1-/-后代在胚胎發(fā)育過(guò)程出現(xiàn)心室間隔缺損，個(gè)體在出生前胚胎全部死亡，但C57BL/6品系小鼠與ICR品系小鼠雜交，Ngly1-/-小鼠胚胎部分死亡，Ngly1-/-小鼠的致死表型可以通過(guò)敲除內(nèi)切N-糖苷酶基因（Engase）得到糾正。

Kong等［35］敲除小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEFs的Ngly1，發(fā)現(xiàn)Ngly1-/-MEFs線粒體膜電位降低50%，線粒體活性氧負(fù)荷上升40%，線粒體呼吸鏈功能缺陷；回補(bǔ)Ngly1后，線粒體功能恢復(fù)正常。Asahina等［5］報(bào)道，Ngly1缺陷鼠模型出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙，使用腺相關(guān)病毒（AAV-9）與人NGLY1 cDNA重組載體對(duì)小鼠進(jìn)行單次腦室內(nèi)注射，恢復(fù)大腦（神經(jīng)元）和脊髓中的NGLY1表達(dá)，大腦神經(jīng)元中NGLY1的酶活性增加，模型鼠的運(yùn)動(dòng)功能得到一定恢復(fù)。上述結(jié)果提示，小鼠體內(nèi)PNGase缺陷可導(dǎo)致部分品系小鼠胚胎致死；PNGase可能與維持線粒體功能和機(jī)體運(yùn)動(dòng)功能有關(guān)；補(bǔ)充NGLY1表達(dá)，可能對(duì)相關(guān)疾病有治療意義。

3.2.3 PNGase與酵母

PNGase缺陷的酵母突變株，與野生型相比，突變株中錯(cuò)誤折疊的突變糖蛋白的降解速率變慢，但png1基因的缺失未影響酵母細(xì)胞的生存和生長(zhǎng)，與酵母生存無(wú)明顯關(guān)聯(lián)［17］。Hirsch等［36］報(bào)道，酵母YPNG1在體外也可以區(qū)分正確與非正確的糖蛋白。上述結(jié)果提示，YPNG1可能與酵母細(xì)胞內(nèi)糖蛋白質(zhì)量控制有關(guān)。

3.2.4 PNGase與線蟲

秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的PNGase PNG-1由png-1基因編碼［17］。Habibi-Babadi等［29］研究發(fā)現(xiàn)，png-1能夠限制神經(jīng)元和上皮細(xì)胞軸突分支，png-1缺陷后其產(chǎn)卵器官發(fā)育過(guò)程中軸突分支增加，導(dǎo)致其產(chǎn)卵行為下降。Kong等［35］敲除秀麗線蟲的png-1基因，發(fā)現(xiàn)png-1敲除個(gè)體壽命降低為野生型的53%。上述結(jié)果提示，PNGase可能參與維持線蟲的生殖功能，并延長(zhǎng)線蟲個(gè)體壽命。

3.2.5 PNGase與果蠅

Galeone等［37］研 究 果 蠅PNGase相 關(guān) 基 因Pngl，發(fā)現(xiàn)其與果蠅骨骼形態(tài)生成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信 號(hào) 通 路 有 關(guān)，BMP參與果蠅胚胎期消化道形成；當(dāng)Pngl缺陷，果蠅發(fā)育遲緩且幼蟲消化道畸形。Owings等［38］干擾果蠅Pngl表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PNGase缺陷個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，在部分個(gè)體中有致死性；熱休克基因表達(dá)增加，熱沖擊作用可延長(zhǎng)缺陷個(gè)體的壽命，對(duì)治療有一定的參考意義。結(jié)果提示PNGase缺陷可能導(dǎo)致果蠅生長(zhǎng)發(fā)育延遲、器官畸形。

4 展 望

糖組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后的研究熱點(diǎn)。糖基化和去糖基化是影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的重要修飾，研究此類修飾需要具有相關(guān)酶學(xué)功能的工具酶。PNGase酶學(xué)功能的研究可以通過(guò)質(zhì)譜、核磁共振波譜等技術(shù)開(kāi)展。PNGase F是目前應(yīng)用最多的糖生物學(xué)分析工具酶，N-糖蛋白經(jīng)PNGase F水解，獲得的寡糖鏈可通過(guò)質(zhì)譜、毛細(xì)管電泳等技術(shù)分析鑒定糖鏈結(jié)構(gòu)及豐度，已在腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病與糖基化研究中得到應(yīng)用［39-41］。

PNGase的酶學(xué)及生物學(xué)功能已有一定的研究，但生物體內(nèi)的生理病理機(jī)制還未明確。研究表明，人NGLY1缺陷可引起罕見(jiàn)遺傳性疾病NGLY1-CDDG，臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、智力缺陷、運(yùn)動(dòng)障礙等［4］，該疾病目前無(wú)有效的治療方法。AAV9-NGLY1 cDNA重組載體，能補(bǔ)充Ngly1缺陷小鼠神經(jīng)元細(xì)胞的NGLY1，使模型小鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙恢 復(fù)［5］，結(jié)果提示NGLY1可 能 為NGLY1-CDDG患者治療的潛在藥物靶點(diǎn)，提高NGLY1蛋白表達(dá)水平或其酶活性，可能有助于減輕患者癥狀，針對(duì)NGLY1篩選酶激活劑是該類疾病藥物的研發(fā)目標(biāo)。NGLY1在黑色素瘤細(xì)胞中高表達(dá)，降低NGLY1表達(dá)水平能抑制黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［6］，為NGLY1酶抑制劑相關(guān)藥物的研發(fā)提供新的思路。另外，NGLY1-CDDG患者成纖維細(xì)胞存在線粒體功能損傷，影響能量產(chǎn)生，回補(bǔ)NGLY1表達(dá)恢復(fù)線粒體功能，NGLY1或能應(yīng)用于線粒體相關(guān)藥物的研發(fā)。

孫桂芹等［3］發(fā)現(xiàn)的PNGase F-Ⅱ能水解植物、昆蟲來(lái)源帶有α-1,3核心巖藻糖的蛋白質(zhì)寡糖，而植物［42］、昆蟲［43］來(lái)源的α-1,3核心巖藻糖結(jié)構(gòu)參與人IgE識(shí)別花粉、蜂毒等過(guò)敏原。李天勝等［44］用核心巖藻糖苷酶（cFase I）處理過(guò)敏原，發(fā)現(xiàn)過(guò)敏病人的血清對(duì)處理后過(guò)敏原的反應(yīng)下降。因此，糖苷酶在過(guò)敏原的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究與中藥糖生物學(xué)研究等領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價(jià)值。