新型鴨呼腸孤病毒分離鑒定及其σC基因序列分析

張 薇，武 華，陰雅潔，李松勵(lì)，侯紹華

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定 071000)

新型鴨呼腸孤病毒病是由新型呼腸孤病毒(Novel duck reovirus，NDRV)感染番鴨、半番鴨和北京鴨等多品種鴨引起的一種以肝臟和脾臟出現(xiàn)腫大壞死、出血為主要病理變化的一種免疫抑制性鴨傳染病[1]。自2017年以來，該病在中國多地鴨場相繼暴發(fā)，與以往報(bào)道的鴨呼腸孤病毒相比，NDRV的致病性更強(qiáng)，宿主范圍更廣，死亡率更高，給中國養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。NDRV屬于呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬成員，粒子直徑為70～80 nm，基因組由10個(gè)節(jié)段的雙鏈RNA組成[5-6]。NDRV σC蛋白由S1基因編碼，是病毒外衣殼的次要成分，是病毒結(jié)合細(xì)胞受體的作用位點(diǎn)，能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體[7-8]。對(duì)水禽源呼腸孤病毒的研究表明，外衣殼蛋白(μB、σB和σC)編碼基因的序列變異性顯著高于其他基因節(jié)段，σC蛋白編碼基因節(jié)段的變異性最高，因此，σC基因更適合于不同毒株的鑒別[9]。

目前，國內(nèi)外鮮有預(yù)防和治療NDRV的生物制品[10]。盡管抗禽呼腸孤病毒(Avian reovirus，ARV)和番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)的疫苗可以降低呼腸孤病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，但NDRV與禽呼腸孤病毒、番鴨呼腸孤病毒抗原是否有交叉保護(hù)，相關(guān)禽呼腸孤病毒和番鴨呼腸孤病毒的疫苗能否有效預(yù)防新型鴨呼腸孤病毒病，有待進(jìn)一步研究。由于呼腸孤病毒科的核酸屬于多節(jié)段基因，以及RNA聚合酶缺乏校正功能，導(dǎo)致病毒容易發(fā)生基因重組或抗原變異，產(chǎn)生新的致病性毒株，呼腸孤病毒的這個(gè)特性為研制有效的疫苗提出了挑戰(zhàn)[11]。因此，NDRV的分離與鑒定對(duì)疫苗毒株候選苗的篩選具有重要意義。為了掌握病毒病原特點(diǎn)及遺傳進(jìn)化規(guī)律，本研究從河北某鴨場采集疑似NDRV感染病鴨的肝臟和脾臟，通過RT-PCR、透射電鏡觀察、間接免疫熒光法(IFA)鑒定病毒，并對(duì)分離得到的病毒進(jìn)行σC基因測序和遺傳進(jìn)化分析，以確定病毒來源及進(jìn)化規(guī)律，以期為新型鴨呼腸孤病毒病的防控和疫苗的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 10份肝臟和脾臟病料采自河北某養(yǎng)殖場的疑似NDRV感染的鴨。

1.1.2 雞胚、細(xì)胞、試驗(yàn)動(dòng)物 10枚9日齡SPF雞胚(北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司)；雞肝癌細(xì)胞(LMH)和倉鼠腎成纖維細(xì)胞(BHK)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存)。10只7日齡北京鴨(北京南口北京鴨育種中心)。

1.1.3 主要試劑及儀器 AxyPrep病毒DNA/RNA小量試劑盒(北京三博志業(yè)生物技術(shù)有限公司)；EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix (+dye)、Trans2K?Plus DNA Marker(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；50×TAE(北京萃鋒科技有限公司)；瓊脂糖(北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司)；特級(jí)胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、青-鏈霉素(北京中創(chuàng)宏達(dá)科技有限公司)；F12培養(yǎng)基(北京依珊匯通科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)；NDRV陽性血清由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室制備并保存。FITC-兔抗鴨IgY IgG(H+L)(蘇州博特龍免疫技術(shù)有限公司)；Triton X-100(北京索萊寶科技有限公司)；DAPI Fluoromount-GTM 抗熒光淬滅封片劑(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)。透射電子顯微鏡(型號(hào)：HT770)；激光共聚焦顯微鏡(型號(hào)：TCS SP8)。

1.2 病料的處理

剖檢發(fā)病鴨可見肝臟和脾臟出現(xiàn)壞死，出血，采集肝臟和脾臟，剪碎并研磨，與生理鹽水按照1∶5的比例用勻漿機(jī)制成勻漿，加入1 000 IU青霉素、鏈霉素處理12 h后，―80 ℃反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心20 min，取上清無菌分裝，―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒的分離及鑒定

1.3.1 病毒的分離 將上述過濾后的病毒上清液經(jīng)尿囊腔無菌接種9日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，并用等量的加有雙抗的生理鹽水作為陰性對(duì)照，37 ℃溫箱繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察2次，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，連續(xù)觀察5 d，收集死亡雞胚，4 ℃展示柜放置過夜，觀察剖檢死亡雞胚，在雞胚上連續(xù)傳3代，無菌收獲雞胚和尿囊液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 病毒的血凝特性鑒定 對(duì)收獲的第3代雞胚尿囊液參照《中華人民共和國獸藥典》[12]進(jìn)行血凝試驗(yàn)，以新城疫病毒為陽性對(duì)照。具體步驟如下：在96孔微量板上，從第1至10孔，每孔加入PBS 25 μL，隨后吸取第3代雞胚尿囊液25 μL，從第1孔起，依次做2倍系列稀釋(稀釋度依次為1∶21、1∶22、1∶23、1∶24、1∶25、1∶26、1∶27、1∶28、1∶29、1∶210)。每孔加入1%雞紅細(xì)胞25 μL，并設(shè)不加第3代雞胚尿囊液的紅細(xì)胞為對(duì)照，立即在微量板振搖器上搖勻，室溫靜置30 min，傾斜96孔微量板，觀察分離株是否能凝集雞紅細(xì)胞。

1.3.3 病毒PCR鑒定 根據(jù)GenBank上已公布的NDRV σC基因序列(登錄號(hào)：KJ879930.1)，選擇保守區(qū)域運(yùn)用Oligo 7.0設(shè)計(jì)NDRV特異性檢測引物，引物序列：F：5′-ATCAAATCCCTCC-AAAGC-3′；R：5′-CAGCCATAAAGGAAGCAG-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為727 bp。引物由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成。根據(jù)AxyPrep病毒DNA/RNA小量試劑盒說明書提取第3代雞胚尿囊液中病毒RNA，以RNA為模板，RNase-free ddH2O代替RNA模板作為陰性對(duì)照，利用EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix (+dye)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μL：RNA模板5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，2×ES One-Step Reaction Mix 10 μL，EasyScript?One-Step Enzyme Mix 0.4 μL，RNase-free ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序：45 ℃孵育30 min；94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸42 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。同時(shí)，參考李靜[13]禽呼腸孤病毒、鴨病毒性肝炎病毒(DHV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、鴨瘟病毒(DPV)、禽腺病毒4型(FAdV-4)的引物對(duì)上述提取的第3代雞胚尿囊液中的病毒RNA進(jìn)行PCR檢測。

1.3.4 病毒純化及電鏡觀察 將第3代雞胚尿囊液4 ℃、8 000 r/min離心1 h，取上清，4 ℃ 32 000 r/min離心3 h，棄上清，用少量PBS重懸沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心10 min取上清，即為純化的病毒液，用3%磷鎢酸負(fù)染后通過透射電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)及大小。

1.3.5 病毒的間接免疫熒光鑒定 將BHK細(xì)胞培養(yǎng)于放有爬片的24孔板中，長滿單層后接種第8代病毒液，以不接種病毒液為陰性對(duì)照，當(dāng)接種病毒液的細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，用適量4%多聚甲醛覆蓋細(xì)胞室溫固定15 min，PBS洗3遍，在冰上用0.1% Triton X-100孵育15 min透化細(xì)胞，PBS洗3次，用5% BSA孵育1 h，加入NDRV陽性血清(1∶400稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，加入FITC標(biāo)記的兔抗鴨IgY IgG(H+L)(1∶1 000稀釋)37 ℃避光孵育1 h，PBS洗3次，最后取細(xì)胞爬片倒放于滴有抗熒光淬滅封片劑(含DAPI)的載玻片上進(jìn)行封片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 病毒的體外細(xì)胞培養(yǎng)

取經(jīng)PCR鑒定為NDRV陽性并純化的病毒液分別接種BHK和LMH細(xì)胞，每12 h觀察1次，繼續(xù)培養(yǎng)3 d或當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到70%～80%時(shí)收獲病毒，反復(fù)凍融3次，連續(xù)盲傳8代，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞作為陰性對(duì)照，觀察病毒增殖產(chǎn)生的細(xì)胞病變。

1.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將1.3.1中無菌收獲的雞胚，按照1∶5(W/V)的比例加入生理鹽水制成勻漿，用青-鏈霉素處理12 h，―80 ℃反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心1 h，取上清用0.22 μm濾器過濾除菌。將10只7日齡健康雛鴨分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。試驗(yàn)組皮下接種純化的病毒(1 mL/只)，對(duì)照組注射等體積生理鹽水。隔離飼養(yǎng)7 d，每天觀察雛鴨發(fā)病情況，接種后第7天全部處死，剖檢觀察其肝臟和脾臟的病理變化。

1.6 病毒σC基因的擴(kuò)增與序列分析

根據(jù)GenBank上NDRV σC基因序列(登錄號(hào)：KJ879930.1)，選擇兩端保守區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增σC基因完整開放閱讀框(ORF)的特異性引物，引物序列為：F：5′-ATGGATCGCAACGAGGTGA-3′;R：5′-ATGAA-TAGCTCTTCTCATCGC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為997 bp，引物由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成。提取第3代雞胚尿囊液RNA，以RNase-free ddH2O代替RNA模板作為陰性對(duì)照，參照1.3.3 RT-PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增，用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物，連接pMD19-T克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落進(jìn)行PCR鑒定后將陽性菌株送至蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司測序。利用Mega 7.0對(duì)NDRV σC基因與GenBank中已發(fā)表的其他NDRV σC基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析和相似性比對(duì)。同時(shí)比對(duì)分離株與滅活疫苗TH11株(KC493571.1)和弱毒疫苗JS01-105P株(V202168)σC蛋白氨基酸序列并進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 病毒的分離

由圖1可知，雞胚在接毒后出現(xiàn)死亡，死亡雞胚全身出血，充血嚴(yán)重，有彌散針尖樣出血點(diǎn)，剖檢病變可見肝臟出血腫大，脾臟有出血點(diǎn)。

A、B，正常雞胚；C、D，死亡雞胚；E，死亡雞胚的脾臟

2.2 病毒的血凝特性鑒定

由圖2可知，NDRV分離株反應(yīng)孔均呈線狀流下，陽性對(duì)照反應(yīng)孔呈完全無線狀流下(100%凝集)的最高稀釋倍數(shù)為1∶24，即血凝效價(jià)為1∶24，該NDRV分離株對(duì)雞紅細(xì)胞不具有血凝活性。

圖2 NDRV分離株血凝特性的測定

2.3 病毒PCR鑒定

病料上清液PCR鑒定結(jié)果顯示，在約727 bp處可見NDRV條帶，與預(yù)期大小一致，禽呼腸孤病毒、鴨病毒性肝炎、鴨坦布蘇病毒、鴨瘟病毒、禽腺病毒血清4型檢測結(jié)果均為陰性(圖3)。說明成功分離NDRV，命名為BD/CHN/2020。

M，DL5000 DNA Marker；1，NDRV；2，陰性對(duì)照；3，禽呼腸孤病毒；4，鴨病毒性肝炎病毒；5，鴨坦布蘇病毒；6，鴨瘟病毒；7，禽腺病毒4型

2.4 病毒的透射電鏡鑒定

由圖4可知，病毒經(jīng)3%磷鎢酸染色后，透射電鏡觀察可見直徑為60～80 nm、無囊膜、球形的病毒粒子，與NDRV形態(tài)和大小相符。

圖4 BD/CHN/2020株透射電鏡觀察結(jié)果(40 000×)

2.5 病毒的間接免疫熒光鑒定

由圖5可知，接種BD/CHN/2020株的BHK細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)顯現(xiàn)特異性綠色熒光，未接種BD/CHN/2020株的BHK細(xì)胞無特異性綠色熒光。說明病毒感染BHK細(xì)胞后能夠表達(dá)相關(guān)蛋白。

圖5 BD/CHN/2020株間接免疫熒光檢測結(jié)果(200×)

2.6 病毒的體外細(xì)胞培養(yǎng)

由圖6可知，BD/CHN/2020株接種BHK細(xì)胞傳至第5代后，48 h出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，細(xì)胞聚集成團(tuán)，形成大量的合胞體，然后細(xì)胞逐漸拉網(wǎng)脫落；接種LMH細(xì)胞傳至第2代后，72 h出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，細(xì)胞圓縮、聚集，形成合胞體。

A，BD/CHN/2020株接種BHK細(xì)胞盲傳至第5代，接種48 h；B，BD/CHN/2020株接種LMH細(xì)胞盲傳至第2代，接種72 h；C，正常BHK細(xì)胞培養(yǎng)48 h；D，正常LMH細(xì)胞培養(yǎng)72 h

2.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將過濾除菌的雞胚上清液皮下注射7日齡健康的北京鴨，接種后第2天發(fā)病鴨精神沉郁，眼周濕潤、淚痕明顯，排白色稀糞，至第7天5只全部發(fā)病，死亡3只。試驗(yàn)組發(fā)病率為100%，死亡率為60%。由圖7可知，剖檢死亡鴨可見脾臟腫大、呈暗紅色，有大小不一的白色壞死灶，部分出現(xiàn)肝臟腫大，有白色壞死灶和出血斑。對(duì)照組肝臟和脾臟無明顯病變。

圖7 BD/CHN/2020株感染雛鴨脾臟和肝臟剖檢病變

2.8 病毒σC基因的擴(kuò)增與序列分析

由圖8可知，第3代雞胚尿囊液經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，在約997 bp處得到單一σC基因條帶，與預(yù)期大小一致。利用Mega 7.0將本研究分離的BD/CHN/2020株與GenBank中其他已發(fā)表的禽源呼腸孤病毒毒株進(jìn)行σC基因的遺傳進(jìn)化分析，由圖9和表1可知，NDRV σC基因核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分為2大進(jìn)化分支，雞源支和水禽支，BD/CHN/2020株與NDRV不同毒株在同一分支，相似性高達(dá)92.9%～99.7%，其中與NDRV SY親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)99.7%，而與番鴨呼腸孤病毒、禽呼腸孤病毒相似性較低，分別為52.0%～53.5%、27.0%～27.6%；BD/CHN/2020株與滅活疫苗TH11株和弱毒疫苗JS01-105P株相比，與滅活疫苗TH11株核苷酸相似性為98.2%，而與弱毒疫苗JS01-105P株相似性略低，為97.7%。經(jīng)σC蛋白氨基酸相似性比對(duì)，BD/CHN/2020株與其他NDRV參考株相似性為86.0%～97.7%。由表2可知，與TH11株相比，BD/CHN/2020株第93位氨基酸由S變?yōu)門，第132位氨基酸由T變?yōu)锳，第158位氨基酸由Q變?yōu)镠，第253位氨基酸由V變?yōu)锳，第298位氨基酸由A變?yōu)閂，與JS01-105P株相比，BD/CHN/2020株第120位氨基酸由P變?yōu)門。

M，DL5000 DNA Marker；1，第3代雞胚尿囊液；2，陰性對(duì)照

圖9 基于NDRV σC基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹

表1 σC基因核苷酸和氨基酸序列相似性比對(duì)

表2 BD/CHN/2020株氨基酸突變位點(diǎn)

3 討 論

NDRV由于其高致病性和廣泛的宿主譜而嚴(yán)重?fù)p害了水禽業(yè)，該病毒最早發(fā)現(xiàn)于南方，近幾年中國北方地區(qū)相繼有關(guān)于新型鴨呼腸孤病毒病的報(bào)道，感染鴨早期無明顯特異性癥狀，剖檢特征性病變?yōu)槠⑴K出血或壞死，耐過病鴨生長發(fā)育緩慢[14-16]。因此,了解NDRV的病原學(xué)和流行病學(xué)對(duì)于控制該病發(fā)生十分重要。本研究通過PCR、透射電鏡觀察、間接免疫熒光法鑒定，并對(duì)分離毒株進(jìn)行了σC基因的測序和遺傳進(jìn)化分析，以了解其病原學(xué)特性和流行情況。在病毒的分離試驗(yàn)中，BD/CHN/2020株對(duì)SPF雞胚有致病性，且能引起與鴨感染NDRV相似的病理變化，與劉曉麗等[17]報(bào)道一致，提示BD/CHN/2020株有垂直傳播感染雞群、導(dǎo)致雛雞免疫抑制的可能。因此，在實(shí)際的養(yǎng)殖過程中，尤其是種雞場、孵化場，要防止鴨呼腸孤病毒對(duì)雞胚的污染，切斷傳播途徑，預(yù)防雞群感染鴨呼腸孤病毒的可能性。最先采用BHK細(xì)胞進(jìn)行病毒培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，該毒株在BHK細(xì)胞上適應(yīng)5代以上才能產(chǎn)生細(xì)胞病變，這可能會(huì)導(dǎo)致毒力減弱或基因突變，基于此，嘗試采用LMH細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，傳至第2代即出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，建立了NDRV低代次分離培養(yǎng)的方法，為其病原學(xué)特性的評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明，攻毒鴨全部發(fā)病，剖檢后發(fā)現(xiàn)與鴨場發(fā)病鴨相似的病理變化，主要表現(xiàn)為脾臟腫大壞死出血，部分肝臟出現(xiàn)腫大，有白色壞死灶和出血斑，與Farkas等[3]報(bào)道的以肝臟和脾臟表面有針頭大的白色壞死點(diǎn)為病理特征的番鴨呼腸孤病毒有所不同，與武鴻等[18]報(bào)道的以脾臟腫大、壞死，呈暗紅色為主要病變的NDRV分離毒株一致，更符合NDRV的病理變化。BD/CHN/2020株可能與南方NDRV的傳播密切相關(guān)，NDRV最早發(fā)生于南方，北方較南方少，近幾年NDRV流行范圍從南方擴(kuò)散到北方，北方多地相繼出現(xiàn)NDRV感染的報(bào)道[19]，遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，該毒株與NDRV不同毒株在同一分支，與2018年由晁錦等[20]在江蘇省沭陽某發(fā)病鴨場分離得到的NDRV SY株核苷酸序列相似性最高，為99.7%，所以推測BD/CHN/2020株的出現(xiàn)可能與南方NDRV的傳播有關(guān)。

σC蛋白是病毒外衣殼的次要成分，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，σC蛋白作為病毒結(jié)合細(xì)胞受體的主要位點(diǎn)，對(duì)病毒的吸附、合胞體的形成有重要影響，并促進(jìn)病毒的侵襲[21-22]。目前商品化的鴨呼腸孤病毒病疫苗僅有番鴨呼腸孤病毒活疫苗(CA株)，對(duì)NDRV σC基因序列分析顯示，BD/CHN/2020株與番鴨呼腸孤病毒核苷酸序列相似性為52.0%～53.5%，相似性較低，在免疫過程中產(chǎn)生的中和抗體可能會(huì)有所不同，導(dǎo)致番鴨呼腸孤病毒活疫苗(CA株)對(duì)NDRV保護(hù)不完全，其他NDRV疫苗還處于試驗(yàn)研究階段。比對(duì)BD/CHN/2020株與滅活疫苗TH11株(KC493571.1)和弱毒疫苗JS01-105P株(V202168)σC氨基酸序列均發(fā)生了突變，有文獻(xiàn)表明2017年及以后的NDRV分離株在σC氨基酸位點(diǎn)132A、138R、158H和258A處存在特異性突變[23]，NDRV分離株可能正在不斷的變異和進(jìn)化，BD/CHN/2020株與2011年發(fā)現(xiàn)的TH11株(KC493571.1)相比發(fā)生了5個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)中132A、158H印證了這一點(diǎn)。σC蛋白氨基酸位點(diǎn)的突變有可能改變病原的感染能力，從而引起病原的抗原發(fā)生變異，引起疫苗保護(hù)不完全的問題。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)NDRV的流行情況和病原特點(diǎn)的掌握、早期落實(shí)綜合防治措施和改善養(yǎng)鴨管理制度、研發(fā)新疫苗等，控制該病的暴發(fā)和流行，使中國養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展。

4 結(jié) 論

本研究成功分離得到1株NDRV，其可在BHK、LMH細(xì)胞上穩(wěn)定增殖產(chǎn)生細(xì)胞融合病變并致死雞胚，感染雛鴨后產(chǎn)生典型的NDRV病理變化，與國內(nèi)NDRV疫苗株相比第93、120、132、158、253和298位氨基酸處發(fā)生了突變，結(jié)果為進(jìn)一步研發(fā)有效的NDRV新疫苗及其防控奠定基礎(chǔ)。