苦參堿抗PCV2誘導(dǎo)小鼠肺炎的作用及其機制研究

孫 娜 張司寰 岑龍座 曹志剛 張 華 孫盼盼孫耀貴 范闊海 尹 偉 李宏全*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院/中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點實驗室，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實驗動物管理中心，山西 太谷 030801)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是養(yǎng)豬生產(chǎn)中常見的DNA病毒，PCV2與多種豬病綜合征有關(guān)，包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、幼齡仔豬的先天性震顫、豬繁殖障礙、腸炎和增生性壞死性肺炎等。由PCV2引起的疾病統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus associated diseases, PCVAD)，其臨診表現(xiàn)主要為進行性消瘦、貧血、黃疸、腹瀉、呼吸困難、母豬繁殖障礙和內(nèi)臟器官的病理變化，特別是全身淋巴結(jié)的高度腫大、出血以及間質(zhì)性肺炎[1]。疫苗免疫是防控病毒感染的有效手段，我國目前商業(yè)化的豬圓環(huán)病毒2型疫苗主要是滅活疫苗和基因工程亞單位疫苗。盡管PCV2疫苗的使用可一定程度上控制PCV2誘發(fā)的PMWS和PRDC[2]，但PCV2毒株變異較快[3]，現(xiàn)有疫苗的交叉保護效果差，且存在多病原的混合感染，因此，單純疫苗免疫不能達到控制疾病發(fā)生的目的，亟需研制具有廣譜抗病毒作用的藥物。長期以來，天然產(chǎn)物在藥物研發(fā)過程中起著重要作用，市面上的大多數(shù)藥物都是直接或間接來源于天然產(chǎn)物?？鄥A(Matrine, MT)是從苦參中提取分離的一種生物堿?，F(xiàn)已有大量研究證明苦參堿具有多種藥理作用，主要包括抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛和心肺功能保護等藥理作用[4]。此外，一些研究表明苦參堿具有廣譜抗病毒作用，包括乙肝病毒[5]、人腸道病毒71型[6]、柯薩奇病毒(Coxsackie virus B3, CVB3)[7]、流感病毒(H3N2)[8]和新型冠狀病毒[9]等。

本實驗室前期的研究結(jié)果表明，苦參堿體外具有抗PCV2[10]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)[11]和豬腦心肌炎病毒(EMCV)的作用[12]，并利用細胞模型證實了苦參堿對PRRSV和LPS共刺激誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)具有抑制作用，其抗炎機制與MyD88/NF-κB和NLRP3炎癥小體有關(guān)[13]?，F(xiàn)有研究已表明，PCV2感染可激活NF-κB信號通路以誘發(fā)炎癥反應(yīng)[14-17]。本研究擬建立PCV2感染誘發(fā)昆明小鼠肺炎模型，體內(nèi)評價苦參堿的抗PCV2誘發(fā)炎癥的作用，并以NF-κB信號通路和 NLRP3 炎癥小體為切入點，探究苦參堿的抗炎機制，以期為苦參堿作為抗病毒抗炎新獸藥的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究從中獸藥中發(fā)掘抗病毒抗炎化合物，也為PCV2的防控提供新的研究思路和臨床防治手段。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

32只SPF級昆明小鼠(雌性)，體重(20±2) g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2020-0003。于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物管理中心適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)溫度18～22 ℃，相對濕度50%～60%，讓小鼠自由采食鼠糧，飲用蒸餾水。

本研究所用毒株為PCV2-SH，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)姜平教授饋贈，中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點實驗室經(jīng)擴增保存，利用間接免疫熒光法(IFA)測定其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)為105.4[18]?？鄥A(批號：110805-201709)購自中國食品藥品檢定研究院，純度：98.7%；利巴韋林(CAS：36791-04-5)購自Solarbio，純度：99.0%。

1.2 試驗設(shè)計

選取4周齡32只雌性SPF級別昆明小鼠按體重隨機均分成4組，每組8只，即：空白對照組、PCV2組(只感染PCV2)、苦參堿處理組(PCV2+40 mg/kg苦參堿)、利巴韋林陽性藥物對照組(PCV2+40 mg/kg利巴韋林)。本實驗室前期已通過測定苦參堿對昆明小鼠的半數(shù)致死量(LD50)得到苦參堿在昆明小鼠上的最大安全劑量為40 mg/kg，利巴韋林試驗劑量為40 mg/kg[18]。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，除空白對照組外，其他各組小鼠通過每只腹腔注射0.5 mL 105.4TCID50/mL的PCV2進行攻毒，同時對空白對照組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，于接種PCV2后的第5天開始腹腔注射對應(yīng)藥物，每天按0.2 mL/10 g體重，定點給予40 mg/kg，連續(xù)用藥5 d，空白對照組小鼠腹腔注射等體積的滅菌生理鹽水。在PCV2接種后的第11天(用藥6 d)，剖檢所有試驗小鼠，采集肺臟樣本，提取肺組織DNA、RNA和總蛋白，并制備肺組織病理切片。

1.3 肺組織切片制備和HE染色

解剖小鼠后立即取其大小合適的肺組織固定在Bouin’s固定液中，每隔24 h更換70%酒精，共換液3次。按照梯度酒精進行浸泡后浸蠟2.5 h，過夜包埋，隨后進行修塊、切片、展片和撈片，置于攤片機上40 ℃烘干。經(jīng)蘇木精-伊紅染色后，中性樹膠封片，正置熒光顯微鏡鏡檢。

1.4 熒光定量PCR(qPCR)檢測PCV2 Cap基因和炎癥相關(guān)基因的表達

取出-80 ℃凍存的各組小鼠肺組織樣品，取適量放進裝有液氮的研缽中，快速充分研磨至粉末狀。提取肺組織DNA，用于檢測各組PCV2Cap基因的表達量，提取方法參照天根生化科技(北京)有限公司的血液/細胞/組織 DNA 提取試劑盒使用說明書。參照TRIzol說明書進行RNA提取，用于檢測各組炎癥因子相關(guān)基因的表達量。采用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒(去除gDNA)說明書合成cDNA。使用ND-1000核酸蛋白濃度測定儀分別檢測DNA和RNA的質(zhì)量濃度。分別以DNA或cDNA為模板，應(yīng)用ABI 7500 Real-time PCR系統(tǒng)，根據(jù)Bimake熒光定量試劑說明書，qPCR檢測PCV2Cap基因以及IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α基因的表達。以β-actin為管家基因，采用2-ΔΔCt法計算分析IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α相對表達量。制備Cap基因標準曲線，通過標準曲線計算各組Cap基因拷貝數(shù)。本研究所用基因引物由西安擎科澤西生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 本研究用于qPCR的引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR in the study

1.5 蛋白提取和Western blot

取出-80 ℃凍存的各組小鼠肺組織樣品，取適量放進裝有液氮的研缽中，快速充分研磨至粉末狀。將RIPA buffer、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑(Beyotime，中國)按照VRIPA∶V蛋白酶抑制劑∶V磷酸酶抑制劑=100∶1∶1的體積比例混勻形成的蛋白裂解工作液加至肺組織的粉末中。參照說明書提取組織總蛋白并采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)測得蛋白大小，經(jīng)不同濃度SDS-PAGE電泳分離后，將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜完全浸泡于含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中，在水平搖床上室溫封閉2 h。按照表2加入相應(yīng)一抗，4 ℃過夜孵育，然后加入二抗室溫孵育1 h。按照eECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒說明書，配制發(fā)光液，用X-光膠片在暗室條件下進行顯影、定影并成相，掃描后用Image J軟件進行數(shù)據(jù)采集。

表2 本研究中用到的抗體信息Table 2 Antibody information in the study

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件，利用單因素方差分析法(One-way ANOVA)進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果均采用平均值±標準差(Mean±SD)表示。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1。利用Image J(National Institutes of Health，USA)軟件對Western blot圖像進行灰度值分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦參堿對PCV2感染小鼠肺臟病理變化的影響

PCV2感染的第11天(用藥6 d)，固定肺臟組織，HE染色鏡檢觀察肺臟病理學(xué)變化。從圖1的HE染色結(jié)果看出，與空白組相比(圖1(a))，PCV2組小鼠的肺間質(zhì)顯著增寬，肺泡腔顯著縮小(粗箭頭)。同時還觀察到中等量的炎性細胞和紅細胞浸潤(細箭頭)，提示PCV2感染誘發(fā)了小鼠間質(zhì)性肺炎(圖1(b))。與PCV2組相比，苦參堿處理組(圖1(c))和陽性對照組(圖1(d))能不同程度的改善PCV2感染誘導(dǎo)的肺間質(zhì)增寬、肺泡腔縮小等病理變化。

(a)空白組;(b)PCV2組;(c)苦參堿處理組;(d)陽性對照組放大倍率：400×。比例尺：50 μm。

2.2 苦參堿對PCV2感染小鼠肺臟組織中Cap基因表達的影響

給藥結(jié)束后，提取肺臟組織DNA，qPCR檢測苦參堿對各組小鼠肺臟組織中 PCV2Cap基因的表達量，如圖2所示。與PCV2組相比，苦參堿處理組顯著降低小鼠肺臟組織中Cap基因的表達量(P<0.05)，表明苦參堿可抑制PCV2在小鼠肺臟組織中的復(fù)制。

與PCV2組相比，*表示P<0.05；**表示P<0.01。Compared with PCV2 group， * means P<0.05; ** means P<0.01.

2.3 苦參堿下調(diào)PCV2感染小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA和蛋白水平的表達

在PCV2感染小鼠11 d(用藥第6 天)解剖各組小鼠，取其肺組織，提取RNA及總蛋白，采用qPCR和Western blot檢測苦參堿對各組PCV2感染后的小鼠肺組織中4個炎癥相關(guān)因子mRNA和蛋白表達的影響。qPCR檢測結(jié)果顯示(圖3)，與空白組比，PCV2組的IL-1β(P<0.05)、IL-6(P<0.01)、IL-8(P<0.000 1)和TNF-α(P<0.05) mRNA 的表達量顯著升高，提示PCV2感染誘發(fā)了小鼠肺臟炎癥。與PCV2組相比，苦參堿處理組和陽性對照組均不同程度地降低了IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的表達量。

Western blot結(jié)果顯示(圖4)，與空白組比，PCV2組的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α蛋白的相對表達量顯著升高(P<0.000 1)。與PCV2組比，苦參堿組和利巴韋林陽性藥物組均顯著降低IL-1β、IL-6、IL-8和 TNF-α蛋白的表達(P<0.000 1)，進一步證實了苦參堿對炎癥因子表達的抑制作用。

2.4 苦參堿抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路

苦參堿作用于PCV2感染小鼠11 d(用藥6 d)后，Western blot檢測苦參堿對各組小鼠肺組織中TLR4、MyD88、IκBα、p-IκBα和NF-κB p65蛋白的表達水平的影響，結(jié)果顯示(圖5)，與空白組相比，PCV2組中TLR4和MyD88蛋白的表達水平顯著上升(P<0.000 1)；IκBα蛋白表達水平顯著下降(P<0.000 1)，p-IκBα和p65表達水平顯著上升(P<0.001)，表明PCV2感染小鼠后，肺組織中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路被激活。與PCV2組相比，苦參堿組顯著降低了TLR4(P<0.000 1)、MyD88(P<0.000 1)、p-IκBα(P<0.000 1)和p65(P<0.01)蛋白的表達，升高IκBα(P<0.001)的表達。表明苦參堿在PCV2感染下可抑制小鼠肺組織中TLR4/MyD88/NF-κB通路的活化。

與PCV2組相比，**表示P<0.01；***表示P<0.001；****表示P<0.000 1。

2.5 苦參堿抑制NLRP3炎癥小體的活化

Western blot檢測NLRP3炎性小體復(fù)合物中NLRP3、ASC和Caspase-1的表達情況。結(jié)果顯示(圖6)，與空白對照組相比，PCV2組顯著升高NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表達(P<0.000 1)。與PCV2組相比，苦參堿組顯著降低NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表達(P<0.000 1)。提示PCV2感染能夠激活NLRP3炎癥小體，而苦參堿對其有抑制作用。

與PCV2組相比，****表示P<0.000 1。

3 討 論

實驗室前期已證實苦參堿可顯著抑制PCV2在小鼠肝臟中的復(fù)制[19]，在本研究中，通過每只腹腔注射0.5 mL 105.4TCID50/mL的PCV2進行攻毒，經(jīng)檢測肺臟組織中PCV2Cap基因的表達量，發(fā)現(xiàn)苦參堿亦顯著抑制PCV2Cap基因在小鼠肺臟中的復(fù)制。這些結(jié)果均證實了通過腹腔注射的方式可建立PCV2感染昆明小鼠模型，且苦參堿具有抗PCV2作用。PCV2感染小鼠后會引起肺間隔增寬、肺泡腔縮小等病理現(xiàn)象，這與PCV2感染仔豬后出現(xiàn)的肺部病理變化相一致[20]，通過qPCR和Western blot檢測炎性因子，結(jié)果表明，PCV2感染小鼠后肺組織中一系列炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)的mRNA和蛋白表達量均顯著升高，提示采用PCV2誘發(fā)小鼠的肺炎模型來研究藥物的抗炎作用及機理具有一定的科學(xué)性和可行性。本研究中，苦參堿處理后，可顯著降低PCV2誘導(dǎo)的小鼠肺臟組織中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α基因和蛋白的表達，表明苦參堿能抑制PCV2感染小鼠誘發(fā)的炎性反應(yīng)。Chu等[21]研究表明苦參堿可顯著減少自身免疫性腦脊髓炎誘發(fā)的TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子的產(chǎn)生，且苦參堿是通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路來發(fā)揮抗炎作用的。

TLRs是一類模式識別受體，在先天性免疫應(yīng)答中起重要作用。TLR4是TLR家族成員之一，MyD88是TLR4/NF-κB途徑中的銜接蛋白[22]。NF-κB在抗病毒感染的正常免疫反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，且作為關(guān)鍵介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，但異?；罨腘F-κB是引起炎癥反應(yīng)的主要原因[23]。研究表明，PCV2可通過介導(dǎo)MyD88/NF-κB信號通路來調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)豬肺泡巨噬細胞分泌IL-1β、IL-6和IL-10等炎癥因子[17]。在本研究中，PCV2感染小鼠后，顯著升高了TLR4、MyD88和p-IκBα 和NF-κB p65的表達，降低了IκBα的表達，表明PCV2感染激活了TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，這與先前體外研究結(jié)果一致[24]，而苦參堿干預(yù)后能顯著抑制這一通路的活化，表明苦參堿通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活來發(fā)揮其抗炎作用。Xue等[25]在研究黃芪多糖抗PCV2作用機制時，同樣發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可通過抑制NF-κB信號通路和氧化應(yīng)激反應(yīng)來發(fā)揮其抗病毒作用。在研究苦參多糖[26]和馬尾藻多糖[27]的抗PCV2作用時也得到的類似的結(jié)果。提示NF-κB信號通路是藥物發(fā)揮抗病毒、抗炎作用的核心通路。

NLRP3炎癥小體及其相關(guān)蛋白和下游炎癥因子的異常表達與肺部炎癥性相關(guān)疾病有重大的關(guān)聯(lián)，如慢性阻塞性肺炎、支原體肺炎等[28]。Zhao等[29]總結(jié)了NLRP3炎癥小體與病毒感染的相關(guān)性，并提出NLRP3炎癥小體是藥物發(fā)揮抗病毒作用的重要靶標之一?，F(xiàn)已鑒定出大約40種靶向NLRP3炎癥小體的天然化合物[30]。已有研究表明PCV2可通過激活NF-κB/NLRP3信號通路以介導(dǎo)促炎細胞因子IL-1β的表達[31]。本研究中，PCV2感染可誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的激活，而苦參堿處理組可顯著抑制NLRP3、ASC和Caspase-1的表達，表明苦參堿可通過抑制NLRP3炎癥小體的活化來抑制促炎因子IL-1β的分泌和表達。實驗室前期在PRRSV感染模型上，同樣發(fā)現(xiàn)了苦參堿對NLRP3炎癥小體的抑制作用[13]。

4 結(jié) 論

本研究證實苦參堿可明顯改善PCV2誘導(dǎo)的小鼠肺間質(zhì)增寬的病理現(xiàn)象并降低小鼠肺組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA和蛋白表達水平?？鄥A通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路以及 NLRP3 炎癥小體的激活來發(fā)揮其抗炎作用。