侵染早期小麥葉銹菌相關(guān)基因的篩選及表達(dá)分析

張藝博 路亞南 劉 娜 肖繼斌 李 闖 程 琨 邢國(guó)珍 馬振玲 鄭文明

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

小麥葉銹病是由葉銹菌(PucciniatriticinaEriks，Pt)引起的一種真菌氣傳病害，其流行性強(qiáng)，在世界范圍內(nèi)的小麥種植區(qū)均有發(fā)生，可以造成小麥嚴(yán)重的產(chǎn)量損失[1-3]。例如，2015和2016年黃淮海地區(qū)葉銹病大流行，對(duì)河南和安徽等省的小麥產(chǎn)區(qū)造成嚴(yán)重威脅[4-5]。防治葉銹病最經(jīng)濟(jì)有效的方法是培育小麥抗性品種，而葉銹菌毒性的變異是導(dǎo)致品種抗病性快速喪失的根本原因，因此揭示葉銹菌毒性/致病性相關(guān)基因?qū)﹃U明葉銹菌致病機(jī)制及創(chuàng)制廣譜抗葉銹小麥新種質(zhì)具有重要意義。

葉銹菌夏孢子萌發(fā)是其侵入寄主的首要條件，了解夏孢子的萌發(fā)及早期侵染過(guò)程對(duì)小麥葉銹菌致病性的研究是至關(guān)重要的。在條件適宜的情況下，葉銹菌接觸寄主2 h內(nèi)便開(kāi)始萌發(fā)，芽管向氣孔方向延伸，接種后8 h，氣孔上方可觀察到大量附著胞[6]，部分附著胞產(chǎn)生侵染栓侵入氣孔，并在氣孔下腔形成氣孔下囊，標(biāo)志著入侵成功。12 h氣孔下囊分化成較短的初級(jí)入侵菌絲，接種后24 h，吸器與吸器母細(xì)胞開(kāi)始形成，自此，葉銹菌夏孢子與寄主建立了寄生關(guān)系[7-8]。目前關(guān)于葉銹菌侵染早期，尚沒(méi)有明確的時(shí)間定義，鑒于葉銹菌的早期侵染過(guò)程，一般認(rèn)為葉銹菌侵染早期可以界定在夏孢子接觸寄主24 h內(nèi)。

目前，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于植物、動(dòng)物及病原微生物等研究領(lǐng)域，該技術(shù)能夠反映轉(zhuǎn)錄本的類(lèi)型及數(shù)量，并在分子水平上揭示生理生化過(guò)程，從而有助于關(guān)鍵候選基因的挖掘。基于Illumina平臺(tái)的二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已應(yīng)用于小麥葉銹菌分泌蛋白的預(yù)測(cè)以及差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)的篩選[9-10]。張悅等[11-12]利用二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)共預(yù)測(cè)出635個(gè)葉銹菌候選分泌蛋白，并揭示了候選基因在與寄主互作過(guò)程中的表達(dá)模式；張瑞豐等[13]通過(guò)二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序解析了葉銹菌孢子萌發(fā)的相關(guān)通路，為小麥葉銹菌致病機(jī)制的研究提供了重要基礎(chǔ)。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，PacBio單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)克服了二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)Unigene拼接較短、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)不完整的缺陷，可直接獲得樣本的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本信息，并且在識(shí)別可變的isoform上具有更高的準(zhǔn)確性[14]?；赑acBio平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已被應(yīng)用于多個(gè)物種新的基因位點(diǎn)、isoform以及非編碼RNA的鑒定[15]。已有研究者利用Illumina RNA-Seq和PacBio Iso-Seq測(cè)序技術(shù)，對(duì)植物病原真菌，如大豆銹菌等進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[16]，研究結(jié)果為揭示病原菌致病過(guò)程中的分子機(jī)制提供了依據(jù)。目前，有關(guān)小麥葉銹菌三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)對(duì)萌發(fā)過(guò)程的葉銹菌夏孢子進(jìn)行三代結(jié)合二代高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和表達(dá)分析，旨在篩選與葉銹菌萌發(fā)及早期侵染相關(guān)的候選基因，以期為解析小麥葉銹菌的致病分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥品種：‘中國(guó)春’(‘CS’)、‘云麥34’(‘YM’)；供試葉銹菌系：Pt-HnZU18-3單孢系由本實(shí)驗(yàn)室分離純化保藏[17]；3個(gè)不同毒力的葉銹菌系：PT-1，PT-2，PT-3由張藝博[18]分離鑒定所得，毒力由高到低為：PT-1>PT-2>PT-3[18]。

1.2 樣品制備及RNA提取

取0.2 g葉銹菌夏孢子粉裝入離心管中，加入DEPC處理的水使其充分萌發(fā)，分別制備萌發(fā)0、2、4、8、12和24 h的葉銹菌樣品，采用Trizol法[19]提取RNA，樣品送至北京百邁客公司進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。

1.3 測(cè)序及測(cè)序數(shù)據(jù)的處理

質(zhì)量合格的樣品由北京百邁客公司完成文庫(kù)的構(gòu)建，在PacBio RS II平臺(tái)進(jìn)行葉銹菌的三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，同時(shí)構(gòu)建二代文庫(kù)用Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

對(duì)PacBio RS II平臺(tái)下機(jī)數(shù)據(jù)Polymerase Read進(jìn)行過(guò)濾，共獲得11.33 Gb的clean data，根據(jù)條件full passes≥0且序列準(zhǔn)確性>0.75從clean data中提取ROI(reads of insert)序列，對(duì)其中的全長(zhǎng)序列進(jìn)行ICE(Iterative isoform-clustering)聚類(lèi)及quiver程序糾正，利用proovread[20]軟件用Illumina RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)低質(zhì)量全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行校正。使用CD-HIT[21]軟件去除冗余轉(zhuǎn)錄本，并用BUSCO[22]對(duì)其進(jìn)行完整性評(píng)估。對(duì)Illumina HiSeq平臺(tái)的下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，以三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本為參考轉(zhuǎn)錄本，對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)進(jìn)行定量。

1.4 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的功能注釋

使用BLAST軟件將得到的非冗余轉(zhuǎn)錄本序列分別在NR(RefSeq non-redundant proteins)、Swiss-Prot(Swiss-Prot Protein Sequence Database)、GO(Gene Ontology)、COG(Clusters of Orthologous Groups)、KOG(euKaryotic Ortholog Groups)、Pfam(Protein family)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和eggNOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups)這8個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，從而獲得轉(zhuǎn)錄本的注釋信息。

1.5 候選差異表達(dá)基因的篩選及生物信息學(xué)分析

通過(guò)二代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)三代轉(zhuǎn)錄本基因在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，將差異倍數(shù)(Fold Change)≥2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate,FDR)<0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。綜合二代轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析及三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的生物信息分析，篩選夏孢子萌發(fā)過(guò)程的重要基因。利用SignalP 4.0，TMHMM 2.0和TargetP 2.0軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組中的分泌蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)候選基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。

1.6 候選基因表達(dá)模式分析

將前期鑒定的3個(gè)不同毒力的菌系‘PT-1’、‘PT-2’、‘PT-3’分別與‘CS’(感病品種)、‘YM’(抗病品種)組成親和與非親和組合，取接種后0、2、4、8、12和24 h的小麥葉片，提取RNA(方法同1.2)；根據(jù)候選基因的全長(zhǎng)序列，利用Oligo 7軟件進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)(表1)，以ACTIN為內(nèi)參，利用Applied Biosystems Step One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)候選基因進(jìn)行表達(dá)分析，反應(yīng)體系為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s(40個(gè)循環(huán))；4 ℃保存，候選基因的相對(duì)表達(dá)水平按照2-ΔΔCT方法計(jì)算。

表1 熒光定量PCR引物(5’→3’)Table 1 Primers of qRT-PCR (5’→3’)

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

由表2可知，從clean data中提取441 355條ROI序列，其中包含255 706(57.9%)條全長(zhǎng)序列、179 164(40.6%)條非全長(zhǎng)序列和被過(guò)濾掉的6 485條<300 bp的序列，253 744條序列屬于全長(zhǎng)非嵌合序列。Illumina HiSeq平臺(tái)共產(chǎn)出Raw data 60.191 Gb，過(guò)濾后的Clean data為58.778 Gb。由表3可知，Q20(堿基識(shí)別精度99%)達(dá)到94.98%以上，Q30(堿基識(shí)別精度99.9%)達(dá)到92.22%以上，GC含量集中在54.95%～56.50%。

表2 F01樣品的ROI數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 ROI data statistics of F01 sample

表3 Illumina HiSeq平臺(tái)產(chǎn)出數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 3 Summary for Illumina Hiseq sequencing

2.2 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的功能注釋

由圖1可知，轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞組分中主要注釋到：細(xì)胞(Cell)、細(xì)胞組件(Cell Part)、細(xì)胞器(Organelle)等；在分子功能中主要注釋到：催化活性(Catalytic Activity)及結(jié)合(Binding)；在生物過(guò)程中主要注釋到：代謝過(guò)程(Metabolic Process)與細(xì)胞過(guò)程(Cellular Process)。

圖1 葉銹菌夏孢子轉(zhuǎn)錄本的GO注釋Fig.1 GO annotation of urediniospores transcript of leaf rust

2.3 候選基因的篩選及生物信息學(xué)分析

由表4可知，相較于休眠夏孢子，萌發(fā)2、4、8、12和24 h的夏孢子分別有5 121、2 329、2 424、3 199 和3 699個(gè)差異表達(dá)基因。利用SignalP 4.0，TMHMM 2.0和TargetP 2.0軟件預(yù)測(cè)出1 169個(gè)分泌蛋白；相較于休眠夏孢子，萌發(fā)2、4、8、12和24 h分別有294、123、116、205及183個(gè)差異分泌蛋白。葉銹菌的早期侵染過(guò)程中，接觸寄主8和12 h分別為附著胞大量產(chǎn)生及形成初級(jí)菌絲的關(guān)鍵時(shí)期，是葉銹菌最終成功侵染并建立寄生關(guān)系的前提基礎(chǔ)，因此，以萌發(fā)8與12 h為主要時(shí)間點(diǎn)，結(jié)合全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的基因表達(dá)差異倍數(shù)及注釋信息，篩選可能與病原菌致病力相關(guān)的基因及分泌蛋白。

表4 葉銹菌夏孢子萌發(fā)過(guò)程差異表達(dá)基因篩選Table 4 Screening of differentially expressed genes during urediniospores germination of Puccinia triticina

由表5可知，差異表達(dá)基因的GO注釋結(jié)果涉及代謝過(guò)程、ATP結(jié)合、氨基酸的生物合成、MAPK(mitogen-activated protein kinase)信號(hào)通路及氧化磷酸化等，其中還包括部分差異分泌蛋白(PTTG_1279、PTTG_3315、PTTG_1645、PTTG_1387、PTTG_2743、PTTG_1645)。結(jié)合候選基因在轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)模式及生物信息學(xué)分析，共篩選到4個(gè)與葉銹菌萌發(fā)過(guò)程相關(guān)的重要基因，分別為：PTTG_1050、PTTG_4765、PTTG_1823、PTTG_1279。

表5 部分差異表達(dá)基因列表Table 5 List of partial differentially expressed genes

由圖2可知，候選基因PTTG_1050、PTTG_4765和PTTG_1279在整個(gè)萌發(fā)過(guò)程中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，PTTG_1823為萌發(fā)過(guò)程中的下調(diào)表達(dá)基因。PTTG_1050編碼292個(gè)氨基酸，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組功能注釋結(jié)果顯示其參與SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors)介導(dǎo)的囊泡運(yùn)輸，結(jié)構(gòu)域注釋為Syntaxin-6_N超家族、SNARE超家族。候選基因PTTG_4765編碼959個(gè)氨基酸，屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族PDR亞族，結(jié)構(gòu)域注釋為3a01205超家族，為多向耐藥性家族蛋白，見(jiàn)圖3。PTTG_1823編碼430個(gè)氨基酸，參與MAPK信號(hào)通路，屬于PKc_Like(protein kinase C-like)超基因家族。候選基因PTTG_1279編碼213個(gè)氨基酸，為本研究預(yù)測(cè)的分泌蛋白編碼基因，其編碼蛋白符合一般分泌蛋白特征：氨基酸<300個(gè)，具有信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，富含半胱氨酸，未注釋到保守結(jié)構(gòu)域(圖3)。

FPKM，每百萬(wàn)測(cè)序堿基中每千個(gè)轉(zhuǎn)錄子測(cè)序堿基中所包含的測(cè)序片段數(shù)。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。FPKM represent number of sequenced fragments contained in every thousand transcripts of sequenced bases per million of sequenced bases. Different lowcase letter indicate difference significant at 0.05 level. The same below.

圖3 候選基因PTTG_1050(a)、PTTG_4765(b)和PTTG_1823(c)的保守結(jié)構(gòu)域注釋Fig.3 Annotation of conserved domains of candidate genes PTTG_1050 (a), PTTG_4765 (b) and PTTG_1823 (c)

2.4 候選基因在親和與非親和組合中的表達(dá)模式

由圖4和圖5可知，PTTG_1050和PTTG_4765在不同毒力菌系中具有相同的表達(dá)模式，但在親和與非親和組合中，表達(dá)模式不同。2個(gè)候選基因均在強(qiáng)毒菌系‘PT-1’的親和組合中顯著上調(diào)表達(dá)；在非親和組合中，侵染后2和12 h也出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，但非親和組合中，表達(dá)量峰值出現(xiàn)在侵染后12 h，而親和組合中的表達(dá)量峰值出現(xiàn)在侵染后24 h，且親和組合中候選基因的整體表達(dá)量顯著高于非親和組合，PTTG_1050與‘CS’的親和組合中，表達(dá)量與葉銹菌毒性成顯著正相關(guān)，推測(cè)PTTG_1050可能與葉銹菌的強(qiáng)毒性相關(guān)，并在葉銹菌生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。PTTG_4765在親和組合中有著較高的表達(dá)量，且與非親和組合出現(xiàn)表達(dá)量峰值的時(shí)間有所差異，其在親和組合中侵染24 h達(dá)到表達(dá)量峰值，且表達(dá)量顯著高于非親和組合，推測(cè)PTTG_4765可能與葉銹菌致病力相關(guān)。

PT-1-CS、PT-2-CS、PT-3-CS分別表示‘PT-1’、‘PT-2’、‘PT-3’接種CS；PT-1-YM、PT-2-YM、PT-3-YM分別表示‘PT-1’、‘PT-2’、‘PT-3’接種YM，下同。PT-1-CS, PT-2-CS and PT-3-CS represent ‘PT-1’, ‘PT-2’ and ‘PT-3’ are inoculated with CS，respectively. PT-1-YM, PT-2-YM and PT-3-YM represent ‘PT-1’, ‘PT-2’ and ‘PT-3’ are inoculated with YM， respectively. The same below.

圖5 3個(gè)不同毒力菌系與‘CS’/‘YM’的親和(a)、非親和(b)組合中PTTG_4765的表達(dá)Fig.5 Expression of PTTG_4765 in ‘CS’/‘YM’ compatible (a) and incompatible (b) combinations of three different virulent isolates

由圖6和圖7可知，PTTG_1823和PTTG_1279分別在不同毒力菌系的早期侵染過(guò)程中表現(xiàn)出顯著不同的表達(dá)模式。PTTG_1823在親和組合中整體為上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，而在‘PT-1’、‘PT-2’的非親和組合中下調(diào)表達(dá)，在‘PT-3’的非親和組合中，侵染后2和12 h出現(xiàn)表達(dá)量上調(diào)，但上調(diào)倍數(shù)不超過(guò)1.6倍，表明其在抗病寄主中表達(dá)受到抑制，顯示其可能與感病寄主中菌絲的順利擴(kuò)展有密切關(guān)系，與葉銹菌的毒性相關(guān)。PTTG_1279在菌系‘PT-1’與‘PT-3’中有著相似的表達(dá)模式，即在親和組合中，侵染后2和24 h均出現(xiàn)表達(dá)量上調(diào)，不同的是，侵染4～8 h，其在‘PT-1’中，表達(dá)量持續(xù)下調(diào)，而在‘PT-3’中持續(xù)上調(diào)，非親和組合中，PTTG_1279在‘PT-1’和‘PT-3’這兩個(gè)菌系中的表達(dá)模式完全一致，侵染4 h出現(xiàn)表達(dá)量峰值；其在中度毒力菌系‘PT-2’中，有著顯著不同于‘PT-1’和‘PT-3’的表達(dá)模式，即在親和與非親和組合中均顯著上調(diào)表達(dá)，在親和組合中，侵染8 h達(dá)到表達(dá)量峰值，后續(xù)時(shí)間點(diǎn)持續(xù)高表達(dá)，而在‘PT-2’的非親和組合中，12 h達(dá)到峰值后又迅速下降，表明其在中度毒力菌系‘PT-2’中可能存在不同的作用途徑或機(jī)制。

圖6 3個(gè)不同毒力菌系與‘CS’/‘YM’的親和(a)、非親和(b)組合中PTTG_1823的表達(dá)Fig.6 Expression of PTTG_1823 in ‘CS’/‘YM’ compatible (a) and incompatible (b) combinations of three different virulent isolates

圖7 3個(gè)不同毒力菌系與‘CS’/‘YM’的親和(a)、非親和(b)組合中PTTG_1279的表達(dá)Fig.7 Expression of PTTG_1279 in ‘CS’/‘YM’ compatible (a) and incompatible (b) combinations of three different virulent isolates

3 討 論

作物病原真菌與寄主間的互作研究已有報(bào)道[23-24]。病原菌通過(guò)病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecule pattern，PAMP)或吸器向植物體內(nèi)釋放效應(yīng)蛋白抑制寄主免疫系統(tǒng)，入侵寄主植物。寄主的PAMP觸發(fā)免疫反應(yīng)(PAMP-triggered immunity，PTI)和效應(yīng)蛋白觸發(fā)免疫反應(yīng)(Effector-triggered immunity，ETI)兩大免疫系統(tǒng)相輔相成，為植物抵御病原菌的入侵提供有力保障[25-26]，而葉銹菌夏孢子萌發(fā)是其侵染早期的重要發(fā)育階段，萌發(fā)過(guò)程相關(guān)的一些關(guān)鍵基因在葉銹菌與小麥的早期互作及成功侵染中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

本研究篩選到了葉銹菌萌發(fā)過(guò)程相關(guān)的4個(gè)關(guān)鍵基因，其中，PTTG_1050可能參與SNARE介導(dǎo)的囊泡運(yùn)輸，該通路被報(bào)道可能與孢子萌發(fā)相關(guān)[13]，SNARE蛋白家族成員Sec22先后在稻瘟病菌[27]、大麗輪枝菌[28]以及禾谷鐮刀菌[29]中被證實(shí)與病原菌致病力相關(guān)；PTTG_4765屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族PDR亞族，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能在增強(qiáng)病原菌抵抗不利環(huán)境中起作用[30]，禾谷鐮刀菌中的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因FgATM1被報(bào)道在病原菌的致病力方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[31]；PTTG_1823參與MAPK信號(hào)通路，真菌的MAPK通路在菌絲侵染、附著胞形成以及致病毒力方面均起到非常重要的作用，能促進(jìn)病原真菌的侵染、幫助病原真菌突破植物防御反應(yīng)[32-33]，同時(shí)，PTTG_1823與葉銹菌、條銹菌的致病基因PtMAPK1和PsMAPK1同屬于PKc_Like超家族[34-35]；PTTG_1279為本研究預(yù)測(cè)的分泌蛋白編碼基因，病原菌分泌蛋白被報(bào)道能夠抑制宿主的免疫反應(yīng)，介導(dǎo)病原菌的營(yíng)養(yǎng)吸收，進(jìn)而促進(jìn)病原菌的寄生與定植[36-37]。小麥葉銹菌萌發(fā)相關(guān)基因的研究可為揭示其致病分子機(jī)制，特別是為PTI相關(guān)基因的作用機(jī)制提供重要基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

對(duì)萌發(fā)的小麥葉銹菌夏孢子進(jìn)行了全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得20 853個(gè)高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本，平均長(zhǎng)度為2 170.51 bp。將轉(zhuǎn)錄本在8個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，97%的轉(zhuǎn)錄本均得到注釋?zhuān)渲校?2 202條轉(zhuǎn)錄本被注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中。在葉銹菌夏孢子萌發(fā)2、4、8、12和24 h分別鑒定出5 121、2 329、2 424、3 199、3 699個(gè)差異表達(dá)基因，共預(yù)測(cè)出1 169個(gè)分泌蛋白，差異表達(dá)分析顯示，相較于休眠夏孢子，萌發(fā)2、4、8、12和24 h分別有294、123、116、205及183個(gè)差異表達(dá)的分泌蛋白。

以萌發(fā)8與12 h為主要時(shí)間點(diǎn)，篩選到了4個(gè)與侵染早期葉銹菌萌發(fā)相關(guān)的重要基因，PTTG_1050為SNARE蛋白的編碼基因；PTTG_4765屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族PDR亞族；PTTG_1823屬于PKc_Like超基因家族；PTTG_1279為預(yù)測(cè)的候選分泌蛋白編碼基因。4個(gè)候選基因在親和互作中表達(dá)量均高于非親和互作，表明候選基因在葉銹菌的早期侵染和擴(kuò)展中發(fā)揮著重要作用。