三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的?；顓?shù)優(yōu)化及其代謝響應(yīng)*

曾廷蘭 陳 燕 母昌考, 2 王春琳, 2 史 策, 2 葉央芳①

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的保活參數(shù)優(yōu)化及其代謝響應(yīng)*

曾廷蘭1陳 燕1母昌考1, 2王春琳1, 2史 策1, 2葉央芳1①

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 浙江寧波 315832; 2. 寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物學(xué)教育部重點實驗室 浙江寧波 315832)

為延長三疣梭子蟹()在捕撈后的存活時間, 在優(yōu)化?；顪囟群统溲趿康幕A(chǔ)上, 再采用基于核磁共振(NMR)的代謝組學(xué)技術(shù), 比較分析了三疣梭子蟹前鰓代謝譜在充氧和不充氧?；钸^程中的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 12 °C下的三疣梭子蟹存活率最高, 80%的三疣梭子蟹能存活3.5 d。加大充氧量能提高三疣梭子蟹的存活率, 3.6 L氧氣可滿足一只三疣梭子蟹成蟹存活到3 d以上。因此, ?；钊嗨笞有返倪m宜溫度和充氧量分別是12 °C和3.6 L。不充氧?；顣?dǎo)致三疣梭子蟹前鰓中乳酸、丙氨酸和葡萄糖等代謝物的快速積累, 但充氧保活可抑制這些代謝物的變化, 表明氧氣通過緩解三疣梭子蟹前鰓的缺氧和滲透壓失衡, 從而有效延長三疣梭子蟹的存活時間。研究結(jié)果為三疣梭子蟹的?；钸\輸提供可借鑒的方法和理論參考。

三疣梭子蟹; 保活; 氧氣; 核磁共振; 代謝組學(xué)

三疣梭子蟹(, 以下簡稱梭子蟹)隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹屬(), 是我國重要的海洋經(jīng)濟蟹類。鮮活的梭子蟹口感細(xì)膩, 肉質(zhì)鮮美, 但在捕撈后很容易死亡, 在酶和微生物的共同作用下快速腐敗, 嚴(yán)重影響梭子蟹的質(zhì)量和口感(Lu, 2015; Grassi, 2019)。

為了?；钏笞有? 人們采用活水艙運輸、充氧水運和保濕干運的方法用于鮮活梭子蟹的運輸(林永平, 1989; 王春琳等, 2001; 王寒冰, 2006)。濕法運輸?shù)乃笞有反婊盥释ǔ８哂诟煞ㄟ\輸(謝佳彥等, 2010), 但鮮有方法能有效?；钏笞有返? d以上。鮮活梭子蟹存活期短可能與多種因子有關(guān)。鰓是梭子蟹進(jìn)行離子和氣體交換的場所, 鰓瓣的粗糙結(jié)構(gòu)和大的比表面積有利于離子的轉(zhuǎn)運和氣體的傳輸(佟蕊等, 2011)。捕撈后的梭子蟹往往被暴露在空氣中, 空氣暴露可導(dǎo)致鰓組織的濕度降低, 鰓瓣粘結(jié), 對氧氣的吸收能力下降, 進(jìn)而導(dǎo)致梭子蟹血淋巴中的二氧化碳和胺類等有害代謝物質(zhì)累積, 引起梭子蟹的組織內(nèi)部缺氧(Dong, 2019)。即便在最優(yōu)溫度條件下, 干露就導(dǎo)致近90%的梭子蟹存活不到24 h, 僅有極小部分梭子蟹能存活到36 h (Dong, 2019)。除了空氣暴露外, 梭子蟹還必須忍耐周圍環(huán)境溫度的變化, 導(dǎo)致梭子蟹體內(nèi)劇烈的代謝波動。如高溫不僅能加快梭子蟹的代謝速率, 還能導(dǎo)致血淋巴和肌肉中的葡萄糖、乳酸和腺嘌呤核苷酸等能量相關(guān)代謝物水平的顯著變化(Lu, 2015, 2016)。因此, 過高或過低的環(huán)境溫度都不利于梭子蟹的存活。此外, 在人工捆綁、分揀和裝筐時, 梭子蟹還會遭受因掙扎、受驚和擠壓等導(dǎo)致的生理壓力和機械損傷; 以及在運輸過程中受到饑餓、顛簸和噪音等因素的影響(Fotedar, 2011)。正是由于上述多種因子的綜合作用最終導(dǎo)致梭子蟹在捕撈后的存活期較短, 有時甚至只有幾個小時。

本研究利用?；畲鼏误w包裝梭子蟹, 分析了溫度和充氧量對梭子蟹成蟹存活的影響, 并采用基于核磁共振(NMR)的代謝組學(xué)技術(shù)探討了氧氣對梭子蟹存活影響的代謝機理, 為三疣梭子蟹的活體運輸提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于2017年10月自寧波一養(yǎng)殖場購買一批三疣梭子蟹, 選擇重量為(124±20) g的30只梭子蟹用于溫度實驗、重量為(160±25) g的30只梭子蟹用于充氧量實驗。于2018年10月在同一養(yǎng)殖場又購買重量為(170±45) g的150只梭子蟹用于代謝組學(xué)實驗。采購的梭子蟹通過氣泵充氧方式并加蓋遮陽網(wǎng)在2 h內(nèi)運回實驗室, 在塑料筐(2.0×1.5×0.7 m)內(nèi)充氣暫養(yǎng)一周, 暫養(yǎng)用水為消毒后的天然海水, 每日投喂花蛤, 于次日早晨清理殘渣。

甲醇、NaH2PO4·2H2O、K2HPO4·3H2O和NaCl購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 重水(99.9%氘代)和2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸鈉(TSP)購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

GXZ智能型光照培養(yǎng)箱, 寧波江南儀器廠; Bruker Avance III 600 MHz核磁共振譜儀, 德國Bruker公司; Bioprep-24組織破碎儀, 北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司; 5415R低溫高速離心機, 德國Eppendorf公司; FreeZone冷凍干燥機, 美國Labconco公司。梭子蟹打包設(shè)備由氧氣瓶、配套充氧設(shè)備、封口機、抽氣泵和充氧打包袋組成。

1.3 梭子蟹的?；畲b方法

把肢體完整的鮮活梭子蟹單獨裝入塑料盒中, 再放入含有適量海水的透明塑料?；畲?30 cm′10 cm, Shi, 2021)中, 手動擠出空氣, 用封口機把袋子開口端封緊。從充氣口充入適量體積的氧氣, 擠平充氣口。

1.4 溫度和充氧量實驗

為研究溫度對梭子蟹存活的影響, 把選定的梭子蟹隨機分成5組, 每組6只。設(shè)置海水量均為1.2 L, 充氧量均為4.8 L, 而每組的溫度分別為8、12、16、20和24 °C。每只蟹獨立包裝后分別置于這5個溫度的恒溫培養(yǎng)箱中。每隔12 h觀察梭子蟹的存活狀況, 梭子蟹死亡的判斷標(biāo)準(zhǔn)為眼柄無反應(yīng), 口器張開, 螯足和步足無反應(yīng), 并下垂(Barrento, 2011; Lu, 2016)。

為研究充氧量對梭子蟹存活的影響, 把選定的梭子蟹隨機分成5組, 每組6只。設(shè)置海水量均為1.2 L, ?；顪囟染鶠閮?yōu)化溫度(12 °C), 設(shè)置充氧量分別為1.2、2.4、3.6、4.8和6.0 L。每只蟹獨立包裝后分別置于優(yōu)化溫度(12 °C)的恒溫培養(yǎng)箱中。每隔12 h觀察梭子蟹的存活狀況, 計算存活率。

1.5 代謝組學(xué)實驗

把選定的梭子蟹隨機分成2組, 每組75只。隨機選取9只梭子蟹作為?；? h組。對剩余梭子蟹分別獨立包裝, 設(shè)置海水量均為1.2 L。對充氧組的每個?；畲谐淙雰?yōu)化的充氧量(3.6 L), 而對不充氧的對照組的每個?；畲谐淙胂嗤?3.6 L)的空氣。置于室溫為(14.5±1.5) °C的房間內(nèi)。每日觀察梭子蟹的存活情況, 計算存活率。分別在?；?4、36、48和54 h時隨機選取對照組和氧氣組中存活的梭子蟹各9只。由于氧氣組的梭子蟹存活時間較長, 因此增加了一個108 h的取樣點。鑒于前鰓組織的呼吸功能(周雙林等, 2001), 本研究采集梭子蟹的第二和第三對鰓的鰓絲, 快速放入凍存管, 立即置于液氮中, 隨后轉(zhuǎn)移至–80 °C保存?zhèn)溆?。精確稱量0.05 g前鰓樣品, 加入含有破碎珠的2.5 mL破碎管, 加入1 mL甲醇水溶液(2:1), 使用組織破碎儀破碎(4 500 r/min) 30 s, 對破碎液離心(4 °C, 12 000 r/min) 10 min, 取上清液。用上述方法對剩余沉淀物再重復(fù)提取一次, 將兩次上清液合并, 使用真空抽濾泵除去上清液中的甲醇后冷凍干燥。獲得的凍干樣置于–80 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

在前鰓提取物的凍干樣中加入600 μL鈉鉀緩沖液, 充分溶解后離心(4 °C, 12 000 r/min) 10 min, 轉(zhuǎn)移550 μL的上清液至直徑為5 mm的核磁管。使用配有超低溫探頭的核磁共振譜儀對樣品進(jìn)行一維與二維核磁譜的采集, 具體方法詳見Xiao等(2008)。對前鰓樣品的1H NMR譜進(jìn)行分段積分, 選取譜區(qū)間為9.7～0.8, 去除5.0～4.75和3.38～3.35的信號區(qū)間以消除水和甲醇的干擾, 設(shè)置積分區(qū)間為2.4 Hz。對積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行重量歸一化處理以消除樣品之間的重量差異。把歸一化的NMR數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P+軟件(V11.0, 瑞典Umetrics公司), 選擇標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)處理模式對NMR數(shù)據(jù)作主成分分析(PCA), PCA分析結(jié)果不僅可提供樣本的聚類情況, 還可檢測離群樣本點。然后對NMR數(shù)據(jù)作正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA), 在OPLS-DA分析中, 設(shè)置自動規(guī)格化的數(shù)據(jù)處理模式, 并以NMR數(shù)據(jù)為變量, 以分組信息為變量。為驗證OPLS-DA模型的可靠性, 采用9倍交叉驗證的方法, 如果驗證所得的2值較高說明模型的質(zhì)量越高。此外, 還采用交叉驗證的方差分析(CV-ANOVA)方法進(jìn)一步驗證OPLS-DA模型的可靠性, 如果所得<0.05, 則證明OPLS-DA模型是可靠的(Eriksson, 2008)。為了獲得導(dǎo)致組間區(qū)分的物質(zhì), 先對自動規(guī)格化的NMR數(shù)據(jù)作回溯轉(zhuǎn)換(Cloarec, 2005), 再借助MATLAB軟件制作OPLS-DA模型相對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)圖。相關(guān)系數(shù)圖上每個點具有不同的顏色, 該顏色代表變量(即NMR數(shù)據(jù))和變量(即分組信息)之間的皮爾森積差相關(guān)系數(shù)()值。根據(jù)本研究的樣本重復(fù)數(shù)=9, 判定||>0.632的營養(yǎng)物質(zhì)對組間區(qū)分具有顯著意義(<0.05)。

為獲得梭子蟹前鰓中重要代謝物水平在?；钸^程中的相對變化, 本文計算了這些物質(zhì)相對于保活0 h對照中該代謝物增加或減少的變化百分率, 計算公式如下:

CR = 100×(M–0) /0, (1)

式中, CR表示代謝物的相對變化百分率(單位: %),M和0分別表示在?；钅骋粫r間點和保活0 h時的代謝物濃度。

1.6 生存曲線分析

采用Kaplan-Meier方法(GraphPad Prism 5, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, United States)的Log-rank (Mantel-Cox)法獲得中位生存時間和樣本組之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 三疣梭子蟹?；顥l件優(yōu)化

鑒于溫度和氧氣是梭子蟹存活的重要環(huán)境因子, 本研究分析了不同溫度和充氧量對梭子蟹存活的影響。結(jié)果表明, 在一定的充氧量條件下, 8～24 °C都不能確保梭子蟹在3 d內(nèi)全部存活(圖1a), 其中12 °C下的梭子蟹存活率最高, 有80%的梭子蟹能存活3.5 d, 但只有50%的梭子蟹能存活到第5天。次優(yōu)的溫度是8 °C, 有80%的梭子蟹能存活2.5 d, 隨后存活率急劇下降, 到第5天時已全部死亡。其他三個溫度下的梭子蟹存活率隨著溫度的提高依次降低, 24 °C下的梭子蟹在第2天已全部死亡。相比于溫度, 充氧量對梭子蟹存活的影響較小(圖1b), 且隨著充氧量的增加, 梭子蟹的存活率逐漸提高。其中3.6 L或以上的充氧量可確保所有梭子蟹存活到3 d以上, 其中6.0 L組的梭子蟹存活率最高, 5 d存活率為50%。綜合上述結(jié)果可知, ?；钏笞有返倪m宜溫度和充氧量分別是12 °C和3.6 L。

2.2 氧氣對三疣梭子蟹存活率的影響

為解析氧氣對梭子蟹存活影響的代謝機理, 本研究首先觀察了充氧和不充氧條件下梭子蟹的存活率差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 充氧組的中位生存時間達(dá)到147.5 h (圖2), 最接近于充氧量實驗中6.0 L組別梭子蟹的半數(shù)生存期(圖1b), 而顯著高于不充氧對照組的57 h (圖2,<0.000 1), 表明氧氣在梭子蟹?；钪械闹匾饔?。

2.3 氧氣對三疣梭子蟹前鰓代謝物的影響

為進(jìn)一步明確氧氣對三疣梭子蟹存活的影響, 實驗采用代謝組學(xué)技術(shù)分析了充氧和不充氧條件下梭子蟹前鰓的代謝譜變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在可檢測到的36種前鰓小分子代謝物中(圖3左; 表1), 有部分代謝物信號發(fā)生了較大幅度的變化。如與?；钋?0 h)相比, 乳酸信號在不充氧條件下保活36 h時明顯增強。借助無監(jiān)督的PCA軌跡圖(圖3右)顯示, 不充氧對照組的梭子蟹前鰓的代謝軌跡持續(xù)偏離0 h對照組, 而充氧組的代謝軌跡的偏離幅度減小, 且呈現(xiàn)震蕩偏離的現(xiàn)象。表明氧氣減緩了梭子蟹前鰓的代謝變化, 即便延長?；顣r間到108 h, 其整個代謝譜變化仍小于不充氧的對照組。

圖1 溫度(a)和充氧量(b)對三疣梭子蟹存活率的影響

圖2 氧氣對三疣梭子蟹生存曲線的影響

為揭示充氧和不充氧條件下前鰓代謝物的變化差異, 本研究采用監(jiān)督的OPLS-DA方法分析了各?；顣r間點相對于0 h點的代謝物差異。本研究共構(gòu)建了9個OPLS-DA模型(圖4a～4d; 圖5a～5b; 前三個時間點的氧氣組模型未顯示), 相應(yīng)的2值均大于0.4, CV-ANOVA驗證結(jié)果值均小于0.05, 說明所有OPLS-DA模型均可靠。OPLS-DA結(jié)果表明, 與?；? h的對照相比, 在不充氧?；?4 h可導(dǎo)致前鰓的丙氨酸、甜菜堿、?；撬?、葡萄糖和色氨酸的水平顯著升高(圖4a’); 而充氧?；?4 h僅導(dǎo)致海藻糖水平的顯著升高(結(jié)果未顯示)。同樣與0 h前鰓相比, 在不充氧?；?6 h可導(dǎo)致前鰓的乳酸、丙氨酸、甜菜堿、?；撬?、葡萄糖、組氨酸和葫蘆巴堿水平的顯著升高(圖4b’); 而充氧保活36 h僅導(dǎo)致葡萄糖水平的顯著升高(結(jié)果未顯示)。當(dāng)?；畹?8 h時, 不充氧條件下的前鰓相比于0 h對照, 除仍含有更高水平的丙氨酸、甜菜堿、?；撬?、葡萄糖與葫蘆巴堿外, 還含有更高水平的酪氨酸和色氨酸(圖4c’); 而充氧條件下的前鰓的甜菜堿、酪氨酸和色氨酸水平顯著高于0 h對照(結(jié)果未顯示)。當(dāng)?；钛娱L到54 h時, 不充氧條件下的前鰓相比于0 h對照, 含有更高水平的乳酸、丙氨酸和次黃嘌呤, 同時含有較低水平的谷氨酸、甜菜堿和2-吡啶甲醇(圖4d’); 而充氧條件下的前鰓中僅葡萄糖和肌苷的水平顯著高于0 h對照(圖5a’)。由于取樣和梭子蟹的死亡, 在保活108 h時, 僅充氧條件下的梭子蟹仍有存活。但其前鰓的代謝物開始出現(xiàn)較大變化, 比0 h對照含有更高水平的乳酸、丙氨酸、膽堿-O-硫化物、磷酸膽堿、甜菜堿、?；撬帷⒗野彼?、組氨酸、海藻糖、肌苷和2-吡啶甲醇(圖5b’)。上述顯著變化的代謝物的相關(guān)系數(shù)列于表2。

圖3 充氧和不充氧條件下三疣梭子蟹前鰓組織提取物的典型600 MHz 1H NMR譜(左)及其代謝軌跡(右)

注: C0～C54: 對照組0 h、24 h、36 h、48 h和54 h; O24～O108: 充氧組24 h、36 h、48 h、54 h和108 h。虛線區(qū)域相比于4.7～0.7 ppm區(qū)域縱向放大了16倍

表1 三疣梭子蟹前鰓代謝物的核磁數(shù)據(jù)

Tab.1 NMR data of the metabolites in crab anterior gills extracts

續(xù)表

注: 多重性a: s. 單峰; d. 雙峰; t. 三重峰; q. 四重峰; m. 多重峰; dd. 兩重雙重峰; dt. 兩重三重峰; td. 三重兩重峰

本研究進(jìn)一步分析了前鰓中各代謝物在?；钸^程中的整體變化趨勢, 發(fā)現(xiàn)只有乳酸的變化幅度最大(圖6)。表現(xiàn)在不充氧條件下54 h時比對照增加了2 729.07%, 但充氧條件下, 乳酸水平在54 h內(nèi)沒有增加, 直到108 h時才增加為對照的244.42%。而其他代謝物如葡萄糖、丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、次黃嘌呤、肌苷和膽堿-O-硫化物的最大累積增量為0 h對照的100%～300%, 而組氨酸、甜菜堿、?；撬?、2-吡啶甲醇和葫蘆巴堿的最大累積增量均不足0 h對照的100% (數(shù)據(jù)未顯示)。

圖4 不充氧?；畹娜嗨笞有非蚌w提取物的OPLS-DA得分圖(a～d)和相關(guān)系數(shù)圖(a’～d’)

注: C0(黑色星號)、C24(紅色圓圈)、C36(藍(lán)色方框)、C48(紫色菱形)和C54(棕色三角形)分別代表保活0 h、24 h、36 h、48 h和54 h的前鰓。數(shù)字代表的代謝物信息見表1

圖5 充氧?；畹娜嗨笞有非蚌w提取物的OPLS-DA得分圖(a～b)和相關(guān)系數(shù)圖(a’～b’)

注: C0(黑色星號)、O54(棕色三角)和O108(桔色倒三角)分別代表?；? h、54 h和108 h的前鰓。數(shù)字代表的代謝物信息見表1

表2 在充氧和不充氧條件下三疣梭子蟹前鰓中顯著變化的代謝物的OPLS-DA相關(guān)系數(shù)

Tab.2 OPLS-DA correlation coefficients for significantly altered metabolites in aqueous extracts of the anterior gills of P. trituberculatus kept in the air or supplemented oxygen

圖6 充氧和不充氧條件下三疣梭子蟹前鰓乳酸的相對變化

3 討論

3.1 溫度和氧氣對三疣梭子蟹存活表型的影響

三疣梭子蟹離水后的快速死亡很大程度上歸因于環(huán)境因子的劇烈變化, 溫度和氧氣是其中兩個關(guān)鍵因子。目前有較多學(xué)者關(guān)注溫度對梭子蟹存活的影響(Lu, 2015, 2016; Dong, 2019), 但鮮有對氧氣的研究。溶解氧的重要性在梭子蟹的常規(guī)養(yǎng)殖中并不凸顯, 但在梭子蟹運輸中卻顯得尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn), 溫度和充氧量對梭子蟹的存活都起著決定性作用, 但兩者的影響方式不同。就溫度而言, 過低和過高的溫度都不利于梭子蟹的存活, 12 °C是10月份梭子蟹?；畹妮^適宜溫度。這個適宜溫度可能與環(huán)境溫度有關(guān), 已有研究發(fā)現(xiàn), 蟹類的最適溫度會隨著環(huán)境溫度的變化而變化(Lewis, 2014)。因此, 在不同月份下?；钏笞有芬m當(dāng)調(diào)整保活溫度。與溫度影響不同的是, 充氧量越大, 梭子蟹的存活率就越高, 但高到一定程度后存活率的提高不明顯, 表明梭子蟹對氧氣的需求是有限值的。Liu等(2011)報道梭子蟹存活需要的溶解氧水平為2～4 mg/L。在本研究中, 0.7 L的充氧量可使保活袋中海水的溶解氧達(dá)到8.6 mg/L, 可滿足梭子蟹存活所需。但隨著保活時間的延長, 氧氣被逐漸消耗, 因此充氧量要與梭子蟹的耗氧率相匹配。顯然, 耗氧率越高, 保活袋的充氧量就越大。而梭子蟹的耗氧率又受到單位水體梭子蟹質(zhì)量和外界環(huán)境因素等因子的影響(王馨等, 2014)。在本實驗條件下, 3.6 L的充氧量可滿足梭子蟹成蟹3 d存活的需要。但在不同?；顥l件下, 可能需要適當(dāng)調(diào)整充氧量。

3.2 三疣梭子蟹對溫度和氧氣的代謝響應(yīng)

溫度和氧氣都會影響梭子蟹的存活, 這可能與這兩個因子影響梭子蟹的代謝有關(guān)?，F(xiàn)有不少研究關(guān)注溫度對蟹類代謝的影響。如高溫能加快三疣梭子蟹的代謝速率, 導(dǎo)致血淋巴和肌肉中的葡萄糖、乳酸和腺嘌呤核苷酸等能量相關(guān)的代謝物產(chǎn)生劇烈波動(Lu, 2015, 2016); 高溫也能改變藍(lán)蟹() (Abol-Munafi, 2020)和欖綠青蟹() (Azra, 2020)的脂肪酸組成, 并顯著提高招潮蟹(Capparelli, 2019)、(Da Silva Vianna, 2020)和(Manríquez, 2021)的耗氧量。而適度低溫(10 °C)能顯著提高梭子蟹肌肉中與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的海藻糖-6-磷酸合成酶基因和能量代謝相關(guān)的果糖1,6-二磷酸醛縮酶基因的表達(dá)(Zhao, 2015); 還能刺激擬穴青蟹()肌肉中四種ATPase的活性, 但過低的溫度(5 °C)卻顯著抑制了Ca2+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活性(Kong, 2012)。顯然, 過高和過低的溫度都可能影響梭子蟹的正常代謝, 這可能在一定程度上解釋了本研究中溫度對梭子蟹存活影響的代謝原因。

相比于溫度, 較少學(xué)者關(guān)注氧氣對蟹類代謝的影響。Liu等(2011)發(fā)現(xiàn), 三疣梭子蟹對溶解氧的敏感性高于帝王蟹(), 其消化腺的葡萄糖、膽固醇和?；视退诫S著溶解氧的下降而顯著降低, 而乳酸脫氫酶活性和乳酸水平卻顯著升高, 顯示出明顯的好氧代謝向厭氧代謝轉(zhuǎn)換的特征。本研究也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象, 主要觀察到乳酸在不充氧?；畹乃笞有非蚌w中被大量積累。作為蟹類厭氧呼吸的主要末端終產(chǎn)物(G?de, 1986), 乳酸的積累與蟹的缺氧緊密相關(guān)(Lowery, 1986; Van Aardt, 1987)。如藍(lán)蟹()缺氧時的血淋巴乳酸積累量可達(dá)到正常時的40～60倍(Lowery, 1986)。本研究中, 前鰓乳酸水平的大幅度增加預(yù)示著梭子蟹在不充氧的保活袋中在24 h時已經(jīng)缺氧, 到54 h時已嚴(yán)重缺氧。顯然, 在缺氧條件下, 梭子蟹前鰓的能量代謝效率顯著降低。為維持基本的生命活動, 生物需要消耗更多的葡萄糖用于產(chǎn)能(Larade, 2002)。但前鰓葡萄糖并沒有全部進(jìn)入糖酵解用于乳酸發(fā)酵, 而是被部分積累。這種現(xiàn)象類似于江蟹()在缺氧6 h時血淋巴中葡萄糖的積累(Van Aardt, 1987), 以及其他無脊椎動物海參()在缺氧時肌肉中葡萄糖的積累(Weinrauch, 2019)。Yoldas等(2021)認(rèn)為, 葡萄糖的積累是為了維持細(xì)胞的正常體積和穩(wěn)定大分子結(jié)構(gòu), 本研究中梭子蟹前鰓中葡萄糖的倍增可能與能量代謝和保護(hù)作用有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)葫蘆巴堿水平的顯著升高。葫蘆巴堿是煙酸的甲基化產(chǎn)物(Upmeier, 1988), 不僅是植物的重要滲透保護(hù)物質(zhì)(Lee, 2008), 還是動物特別是蟹類應(yīng)對壓力的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(Hammer, 2012)。本研究團(tuán)隊早前也發(fā)現(xiàn)梭子蟹應(yīng)對低鹽脅迫時肌肉中大量積累的葫蘆巴堿(Ye, 2014), 表明梭子蟹產(chǎn)生更多的葫蘆巴堿是為了維持前鰓在缺氧下的滲透平衡。甜菜堿、牛磺酸和丙氨酸水平的顯著升高也進(jìn)一步佐證了這一推測。這是因為甜菜堿是動植物中普遍存在的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(Cook, 1984; Peel, 2010), 更在海洋生物中發(fā)揮其滲透調(diào)節(jié)功能(Preston, 1993)。?；撬嵋脖徽J(rèn)為是魚類在壓力條件下的滲透調(diào)節(jié)因子(Fiess, 2007; Avella, 2009)。而丙氨酸是植物和動物響應(yīng)外界脅迫的初級壓力信號分子(Eberlee, 1988; Monselise, 2003)。因此, 這些代謝物在不充氧?；?8 h前的大量累積可能都指示梭子蟹前鰓受到了缺氧的壓力, 并積極進(jìn)行能量代謝和滲透平衡的調(diào)節(jié)。但在54 h時, 只剩下丙氨酸水平顯著高于對照, 同時甜菜堿水平顯著低于對照, 表明呼吸酸化(Astall, 1991)和滲透壓失衡可能最終促使了梭子蟹的死亡。

而氧氣可有效緩解梭子蟹的缺氧狀況, 在?；畹那?4 h, 不僅乳酸沒有被大量積累, 而且只有個別代謝物發(fā)生了顯著升高, 其中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)海藻糖和葡萄糖水平的顯著提高可穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)大分子的結(jié)構(gòu)和功能(Simola, 2000), 有助于維持梭子蟹前鰓的代謝穩(wěn)態(tài)。但在?；?08 h時, 充氧組梭子蟹前鰓開始出現(xiàn)乳酸和丙氨酸等11種代謝物水平的顯著升高, 預(yù)示著能量代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝等多種代謝的紊亂。

4 結(jié)論

在10月份, 在保活袋中充裝一定量的海水、3.6 L或以上充氧量, 在12 °C下可保活梭子蟹成蟹3 d以上。不充氧?；羁蓪?dǎo)致梭子蟹前鰓中乳酸、丙氨酸和葡萄糖等代謝物的快速積累, 但充氧?；羁梢种七@些代謝物的變化, 表明氧氣可緩解梭子蟹前鰓的缺氧和滲透壓失衡, 從而有效延長梭子蟹的保活時間。

王春琳, 金國英, 2001. 海鮮品?；铋L途運輸技術(shù)[J]. 海洋漁業(yè), 23(4): 189-191.

王寒冰, 2006. 三疣梭子蟹養(yǎng)殖技術(shù)之四三疣梭子蟹親蟹的長途運輸及其對育苗效果的影響[J]. 中國水產(chǎn)(2): 48-49.

王馨, 王芳, 路允良, 等, 2014. 光照強度對三疣梭子蟹呼吸代謝的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 38(2): 237-243.

佟蕊, 成永旭, 吳旭干, 等, 2011. 3種不同棲息環(huán)境下蟹鰓的超微結(jié)構(gòu)、脂類組成及含量的比較[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 35(9): 1426-1435.

林永平, 1989. 活梭子蟹出口暫養(yǎng)和運輸技術(shù)試驗[J]. 海洋漁業(yè)(3): 121-122.

周雙林, 姜乃澄, 盧建平, 等, 2001. 甲殼動物滲透壓調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展Ⅰ. 鰓的結(jié)構(gòu)與功能及其影響因子[J]. 東海海洋, 19(1): 44-51.

謝佳彥, 朱愛意, 2010. 幾種重要水產(chǎn)品活體運輸技術(shù)研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 29(9): 532-536.

ABOL-MUNAFI A B, IKHWANUDDIN M, AZRA M N, 2020. Effects of temperature on the whole body fatty acid composition and histological changes of the gills in blue swimmer crabs,[J]. Aquaculture Reports, 16: 100270.

ASTALL C M, JONES M B, 1991. Respiration and biometry in the sea cucumber[J]. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 71(1): 73-81.

AVELLA M, DUCOUDRET O, PISANI D F,, 2009. Swelling-activated transport of taurine in cultured gill cells of sea bass: physiological adaptation and pavement cell plasticity [J]. American Journal of Physiology: Regulatory Integrative and Comparative Physiology, 296(4): R1149-R1160.

AZRA M N, TAVARES C P D S, ABOL-MUNAFI A B,, 2020. Growth rate and fatty acid composition of orange mud crab instars,, reared at different temperatures [J]. The Egyptian Journal of Aquatic Research, 46(1): 97-102.

BARRENTO S, MARQUES A, VAZ-PIRES P,, 2011.(Linnaeus, 1758) physiological responses to simulated live transport: influence of temperature, air exposure and AQUI-S?[J]. Journal of Thermal Biology, 36(2): 128-137.

CAPPARELLI M V, BORDON I C, ARAUJO G,, 2019. Combined effects of temperature and copper on oxygen consumption and antioxidant responses in the mudflat fiddler crab(Brachyura, Ocypodidae) [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 223: 35-41.

CLOAREC O, DUMAS M E D, TRYGG J,, 2005. Evaluation of the orthogonal projection on latent structure model limitations caused by chemical shift variability and improved visualization of biomarker changes in1H NMR spectroscopic metabonomic studies [J]. Analytical Chemistry, 77(2): 517-526.

COOK R J, WAGNER C, 1984. Glycine N-methyltransferase is a folate binding protein of rat liver cytosol [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81(12): 3631-3634.

DA SILVA VIANNA B, MIYAI C A, AUGUSTO A,, 2020. Effects of temperature increase on the physiology and behavior of fiddler crabs [J]. Physiology & Behavior, 215: 112765.

DONG Z G , MAO S, CHEN Y H,, 2019. Effects of air-exposure stress on the survival rate and physiology of the swimming crab[J]. Aquaculture, 500: 429-434.

EBERLEE J C, STOREY K B, 1988. Tissue-specific biochemical responses during anoxia and recovery in the channeled whelk [J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 121(2): 165-176.

ERIKSSON L, TRYGG J, WOLD S, 2008. CV-ANOVA for significance testing of PLS and OPLS? models [J]. Journal of Chemometrics, 22(11/12): 594-600.

FIESS J C, KUNKEL-PATTERSON A, MATHIAS L,, 2007. Effects of environmental salinity and temperature on osmoregulatory ability, organic osmolytes, and plasma hormone profiles in the Mozambique tilapia () [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 146(2): 252-264.

FOTEDAR S, EVANS L, 2011. Health management during handling and live transport of crustaceans: a review [J]. Journal of Invertebrate Pathology, 106(1): 143-152.

G?DE G, GRAHAM R A, ELLINGTON W R, 1986. Metabolic disposition of lactate in the horseshoe craband the stone crab[J]. Marine Biology, 91(4): 473-479.

GRASSI S, BENEDITTE S, OPIZZIO M,, 2019. Meat and fish freshness assessment by a portable and simplified electronic nose system (Mastersense) [J]. Sensors, 19(14): 3225.

HAMMER K M, PEDERSEN S A, ST?RSETH T R, 2012. Elevated seawater levels of CO2change the metabolic fingerprint of tissues and hemolymph from the green shore crab[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics, 7(3): 292-302.

KONG X H, WANG G Z, LI S J, 2012. Effects of low temperature acclimation on antioxidant defenses and ATPase activities in the muscle of mud crab () [J]. Aquaculture, 370/371: 144-149.

LARADE K, STOREY K B, 2002. A profile of the metabolic responses to anoxia in marine invertebrates [J]. Cell and Molecular Response to Stress, 3: 27-46.

LEE G, CARROW R N, DUNCAN R R,, 2008. Synthesis of organic osmolytes and salt tolerance mechanisms in[J]. Environmental and Experimental Botany, 63(1/2/3): 19-27.

LEWIS L, AYERS J, 2014. Temperature preference and acclimation in the Jonah crab,[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 455: 7-13.

LIU C B, XIAO M, FENG Y H,, 2011. Effects of water dissolved oxygen level on physiological responses in(Miers, 1876) [J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 23(3): 506-513.

LOWERY T A, TATE L G, 1986. Effect of hypoxia on hemolymph lactate and behavior of the blue crabRathbun in the laboratory and field [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology, 85(4): 689-692.

LU Y L, WANG F, DONG S L, 2015. Energy response of swimming crabto thermal variation: implication for crab transport method [J]. Aquaculture, 441: 64-71.

LU Y L, ZHANG D, WANG F,, 2016. Hypothermal effects on survival, energy homeostasis and expression of energy-related genes of swimming crabsduring air exposure [J]. Journal of Thermal Biology, 60: 33-40.

MANRíQUEZ P H, GONZáLEZ C P, SEGUEL M,, 2021. The combined effects of ocean acidification and warming on a habitat-forming shell-crushing predatory crab [J]. Science of the Total Environment, 758: 143587.

MONSELISE E B I, PAROLA A H, KOST D, 2003. Low-frequency electromagnetic fields induce a stress effect upon higher plants, as evident by the universal stress signal, alanine [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 302(2): 427-434.

PEEL G J, MICKELBART M V, RHODES D, 2010. Choline metabolism in glycinebetaine accumulating and non-accumulating near-isogenic lines ofand[J]. Phytochemistry, 71(4): 404-414.

PRESTON R L, 1993. Transport of amino acids by marine invertebrates [J]. Journal of Experimental Zoology, 265(4): 410-421.

SHI C, YE Y F, PEI F,, 2021. Survival and metabolic modulation of swimming crabduring live transport [J]. Frontiers in Marine Science, 8: 724156.

SIMOLA M, H?NNINEN A L, STRANIUS S M,, 2000. Trehalose is required for conformational repair of heat-denatured proteins in the yeast endoplasmic reticulum but not for maintenance of membrane traffic functions after severe heat stress [J]. Molecular Microbiology, 37(1): 42-53.

UPMEIER B, GROSS W, K? STER S,, 1988. Purification and properties of-adenosyl-l-methionine: nicotinic acid--methyltransferase from cell suspension cultures ofL. [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 262(2): 445-454.

VAN AARDT W J, WOLMARANS C T, 1987. Effects of anoxia on the haemolymph physiology and lactate concentrations in the freshwater crabCalman [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology, 88(4): 671-675.

WEINRAUCH A M, BLEWETT T A, 2019. Anoxia tolerance in the sea cucumbersandreflects habitat use [J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 520: 151203.

XIAO C N, DAI H, LIU H B,, 2008. Revealing the metabonomic variation of rosemary extracts using1H NMR spectroscopy and multivariate data analysis [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56(21): 10142-10153.

YE Y F, AN Y P, LI R H,, 2014. Strategy of metabolic phenotype modulation inexposed to low salinity [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 62(15): 3496-3503.

YOLDAS T, ERISMIS U C, 2021. Response of Anatolian mountain frogs (and) to freezing, anoxia, and dehydration: glucose as a cryoprotectant [J]. Cryobiology, 98: 96-102.

ZHAO Q, PAN L Q, REN Q,, 2015. Identification of genes differentially expressed in swimming crabresponse to low temperature [J]. Aquaculture, 442: 21-28.

THE OPTIMAL TEMPERATURE AND SUPPLEMENTED OXYGEN AMOUNT FOR LIVEAND THE METABOLIC RESPONSE OF ITS ANTERIOR GILL

ZENG Ting-Lan1, CHEN Yan1, MU Chang-Kao1, 2, WANG Chun-Lin1, 2, SHI Ce1, 2, YE Yang-Fang1

(1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315832, China; 2. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ningbo University, Chinese Ministry of Education, Ningbo 315832, China)

To extend the post-capture survival time of swimming crab, the temperature and oxygen amount to keep swimming crab alive in a transport bag were optimized. The metabolic changes of anterior gills of the crabs kept in transport bag with or without oxygen supply were investigated using a nuclear magnetic resonance (NMR)-based metabolomics technique. Results showed that the highest survival rate of the crab occurred in 12 °C, under which 80% of them could survive up to 3.5 days. The survival rate of swimming crab increased with the supplemented oxygen amount; 3.6 L oxygen was enough to keep an adult swimming crab alive for more than three days. Therefore, the optimal conditions to keep a swimming crab alive are 12 °C and 3.6 L oxygen supply, respectively. Moreover, metabolites such as lactate, alanine, and glucose were rapidly accumulated in the anterior gill of the crab exposed to air. However, oxygen could inhibit the changes of these metabolites, indicating that oxygen can extend the survival time of swimming crab by mitigating the oxygen deficit and osmotic imbalance in the anterior gill. This study provides a potential method and theoretical reference for keeping swimming crab alive during shipping.

; keeping alive; oxygen; nuclear magnetic resonance; metabolomics

Q785; S942.5

10.11693/hyhz20220100025

*寧波市科技創(chuàng)新2025重大專項, 2019B10010號; 財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部: 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助。曾廷蘭, 碩士研究生, E-mail: 1182865178@qq.com

葉央芳, E-mail: yeyangfang@nbu.edu.cn

2022-01-27,

2022-04-23