銀杏葉提取物對肺纖維化大鼠Th1/Th2細胞因子和NF-κB p65信號通路的影響

黃茹妍，張鵬飛，羅湘蓉，吳仰聰，潘 玲

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000；2. 柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545000；3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530000)

特發(fā)性肺纖維化是一種局限于肺部的慢性進行性纖維化間質(zhì)性肺炎，是一種原因不明且不可逆的嚴重肺部疾病，患者預(yù)后較差，生存率低于許多常見類型的癌癥[1-2]。目前臨床指南推薦用藥吡非尼酮和尼達尼布有一定延緩肺纖維化進展的作用[3-6]，但患者的肺功能仍會持續(xù)下降，最終發(fā)展到終末期呼吸衰竭、甚至死亡。因此，亟待尋找新的能有效減緩或治愈肺纖維化的方法。Kang等[7]實驗研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子κB (NF-κB )信號通路激活可加速由博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化進程，吡非尼酮干預(yù)可抑制NF-κB蛋白表達，提示調(diào)節(jié)NF-κB信號通路可能會延緩或改善肺纖維化。Xiao等[8]研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細胞外泌體通過抑制NF-κB信號通路而逆轉(zhuǎn)了由脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化進程。黃輝等[9]綜述了Th1/Th2 細胞平衡與多種器官纖維化之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)Th1/Th2分泌狀態(tài)可對多種器官的纖維化過程起到抑制或促進作用。近年來有研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物有改善或延緩肺纖維化進展的作用[10-13]，但其防治效果有待大樣本研究證實，且其作用機制尚不明確。受上述研究啟發(fā)，本實驗旨在通過觀察銀杏葉提取物對Th1/Th2細胞的標志性代表因子干擾素-γ(IFN-γ)/白細胞介素-4(IL-4)和NF-κB p65表達的影響，探討銀杏葉提取物能否發(fā)揮抑制肺纖維化的作用及其可能機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 72只SPF級雄性SD大鼠，體重180～200 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2016-0002。購回后飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心(溫度22～25 ℃，濕度60%～70%)，通風(fēng)良好，常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，可自由飲水及進食，適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察1周。動物實驗已通過學(xué)校倫理審核。

1.2主要試劑及儀器 NF-κB p65免疫組化試劑盒(武漢拜意爾生物有限公司)，博來霉素(索萊寶生物科技有限公司)，吡非尼酮(北京康蒂尼藥業(yè)有限公司，國藥準字H20133376，規(guī)格：100 mg/粒)，金納多銀杏葉提取物片(德國威瑪舒培博士藥廠，注冊證號H20140768，規(guī)格：40 mg/片)；顯微鏡(BX51T-PHD-J11型，日本奧林巴斯)，石蠟切片機(RM2015型，德國萊卡)，離心機(5430/5430R型，德國Eppendorf公司)，低溫冰箱(MDF-382E型，日本三洋)，恒溫水浴箱(DSHZ-300型，江蘇太倉醫(yī)用儀器廠)。

1.3實驗方法 將72只大鼠隨機分為正常組、模型組、吡非尼酮組及銀杏葉提取物高、中、低劑量組，每組12只。正常組大鼠氣管內(nèi)注射生理鹽水(1 mL/kg)，其余組大鼠氣管內(nèi)注射博來霉素溶液(5 mg/kg)制備肺纖維化模型。造模24 h后可正常飲水進食，常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)6 d。于第8天開始，正常組、模型組每日予1 mL生理鹽水灌胃；吡非尼酮組每日予50 mg/kg吡非尼酮溶液灌胃，銀杏葉提取物高、中、低劑量組每日分別予100 mg/kg、50 mg/kg、25mg/kg的銀杏葉片混懸液灌胃，給藥體積均為10 mL/kg。各組均連續(xù)灌胃21 d。

1.4觀察指標及方法

1.4.1肺組織病理形態(tài) 實驗第29天處死各組大鼠，取肺組織，采用4%多聚甲醛固定。取右肺葉行HE染色和Masson染色(嚴格按說明書執(zhí)行)，在光學(xué)顯微鏡下進行病理組織學(xué)觀察并攝片。根據(jù)Szapiel等[14]的方法，用HE染色切片評估肺組織炎癥情況，用Masson染色切片評估肺纖維化程度。0級(1分)：無肺泡炎、無纖維化改變；1級(2分)：輕度肺泡炎及纖維化，肺泡結(jié)構(gòu)良好，單核細胞浸潤使肺泡間隔增寬，炎癥及纖維化改變呈局灶性，病變范圍不到全肺的20%；2級(3分)：中度肺泡炎及纖維化，存在較廣泛的肺組織炎癥及纖維化改變，改變區(qū)域大部分從胸膜向內(nèi)延伸但仍主要以胸膜為主，病變面積占全肺的20%～50%；3級(4分)：重度肺泡炎及纖維化，病變面積超過全肺的50%，可見大小不等的囊氣腔，間質(zhì)和(或)肺泡內(nèi)可見一些出血區(qū)域，可見廣泛的肺實質(zhì)紊亂。

1.4.2肺組織中IFN-γ及IL-4表達情況 取左上肺組織約50 mg，制備單細胞懸液。在含細胞的培養(yǎng)液中加入蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑，加入20 μL PE/Cy5標記anti-CD4進行細胞表面染色，混勻，室溫暗處孵育15 min，500 r/min離心5 min，棄上清。隨后進行固定和破膜，加入0.5 mL的固定劑室溫暗處孵15 min，加入PBS，500 r/min離心5 min，棄上清；加入1mL破膜劑室溫暗處孵10 min，加PBS洗液，500 r/min離心5 min，棄上清。最后進行細胞內(nèi)染色，加入熒光素標記抗體IFN-γ-PE、IL-4-PE, 混勻，室溫暗處孵育30 min。加洗液，500 r/min離心5 min，棄上清，加入0.5 mL PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測。

1.4.3肺組織中NF-κB p65陽性表達情況 取4%多聚甲醛固定的右肺葉，行石蠟切片脫蠟水化,PBS液浸泡,一抗孵育過夜,PBS沖洗,標記二抗,緩沖液沖洗后DAB顯色,自來水充分沖洗,復(fù)染,脫水,透明干燥,封片。鏡下觀察肺組織切片，并采用Image J軟件對免疫組化染色結(jié)果進行半定量分析,并計算積分光密度值(IOD)，IOD越大表示陽性反應(yīng)越強。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肺組織 HE染色和Masson染色病理表現(xiàn) 正常組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡內(nèi)無明顯炎癥細胞浸潤，未見病理改變及藍色膠原沉積；模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡萎縮或消失，肺泡間隔明顯增寬，肺泡內(nèi)可見大量炎癥細胞浸潤和藍色膠原纖維沉積，呈彌漫性纖維化改變；吡非尼酮組和銀杏葉提取物各組大鼠的肺泡結(jié)構(gòu)破壞程度、炎癥細胞浸潤、纖維化改變程度均較模型組輕，但銀杏葉提取物各組病理改變較吡非尼酮組明顯。見圖1及圖2。

圖1 正常組和肺纖維化各組大鼠肺組織HE染色情況(×200)

圖2 正常組和肺纖維化各組大鼠肺組織Masson染色情況(×200)

2.2各組大鼠肺組織炎癥及纖維化評分比較 模型組大鼠肺組織炎癥及纖維化評分均明顯高于正常組(P均<0.05)；吡非尼酮組和銀杏葉提取物各組大鼠肺組織炎癥及纖維化評分均明顯低于模型組(P均<0.05)，且吡非尼酮組均明顯低于銀杏葉提取物各組(P均<0.05)，銀杏葉提取物高劑量組均明顯低于銀杏葉提取物中、低劑量組(P均<0.05)，銀杏葉提取物中、低劑量組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 正常組和肺纖維化各組大鼠肺組織炎癥及纖維化程度評分比較分)

2.3各組大鼠肺組織中IFN-γ和IL-4表達率比較 與正常組比較，模型組大鼠肺組織中IFN-γ表達率明顯降低(P<0.05)，IL-4表達率明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，吡非尼酮組和銀杏葉提取物各組大鼠肺組織中IFN-γ表達率均明顯升高(P均<0.05)，IL-4表達率均明顯降低(P均<0.05)；與吡非尼酮組比較，銀杏葉提取物各組大鼠肺組織中IFN-γ和IL-4表達率均更高(P均<0.05)，銀杏葉提取物各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 正常組和肺纖維化各組大鼠肺組織中IFN-γ和IL-4表達率比較

2.4各組大鼠肺組織中NF-κB p65表達情況正常組、模型組、吡非尼酮組及銀杏葉提取物高、中、低劑量組大鼠肺組織中NF-κB p65表達IOD值分別為5.28±1.55，26.21±4.54，11.07±1.41，13.60±2.30，13.62±2.12，12.79±1.62，模型組明顯高于正常組(P<0.05)，吡非尼酮組和銀杏葉提取物各組均明顯低于模型組(P均<0.05)，吡非尼酮組和銀杏葉提取物各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

3 討 論

肺纖維化是肺泡上皮的持續(xù)損傷和病理損傷后的異常修復(fù)，而后繼續(xù)發(fā)展造成的膠原纖維過度沉積和肺組織瘢痕性變化的肺部疾病，其特征之一就是連續(xù)的急性肺損傷。目前炎癥也被認為是導(dǎo)致纖維化的因素之一[15]，因此通過抗炎療法有望延緩或改善肺纖維化。Yao等[16]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物干預(yù)可明顯下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)表達水平。Tao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物主要成分黃酮苷可通過抑制白細胞彈性蛋白酶的活性而發(fā)揮抗炎作用。本研究團隊前期實驗研究中也發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物可在一定程度上減輕或改善大鼠肺組織及肺血管周圍炎癥，抑制支氣管、肺血管結(jié)構(gòu)重塑，有一定延緩肺間質(zhì)纖維化進展的作用[18-20]。本實驗中，HE和Masson染色證實銀杏葉提取物可改善博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺組織炎癥及纖維化，且高濃度的改善效果優(yōu)于低濃度，但與吡非尼酮相比存在療效差異。因此筆者認為，銀杏葉提取物有改善肺組織炎癥及纖維化的作用，且治療劑量的選擇對于治療效果而言有著重要意義，但這需要更多的實驗研究來證實。

在正常情況下，Th1、Th2細胞因子處于動態(tài)平衡狀態(tài)，一旦受到刺激則容易失衡而引起機體相應(yīng)變化，有研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)Th1、Th2細胞因子之間的平衡可影響肺纖維化的進展[21]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與器官纖維化的病理生理發(fā)生過程關(guān)系密切[22]，其中TGF-β是誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生的重要因子之一。作為Th1生物標志物之一的IFN-γ是一種有效的TGF-β抑制劑，因此IFN-γ療法有望成為一種新的治療手段。Fusiak等[23]發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化患者經(jīng)IFN-γ吸入治療后，患者肺功能沒有經(jīng)歷持續(xù)下降的情況，且處于一個疾病穩(wěn)定的狀態(tài)。 Wang等[24]研究中發(fā)現(xiàn)吸入IFN-γ 可以改變下呼吸道黏膜的多種免疫和組織修復(fù)途徑，這與下呼吸道微生物群的分類組成與多種免疫途徑顯著相關(guān)，這些途徑可能在特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化的肺實質(zhì)損傷/修復(fù)過程中起作用。IL-4是Th2細胞的標志性代表因子，Th2細胞作為Th1細胞的公認對手，可以改變與Th1相關(guān)的IFN-γ表達水平。李娟等[25]研究發(fā)現(xiàn)，隨著矽肺大鼠肺纖維化的進展，IFN-γ表達減弱,IL-4表達增強。Xiong等[26]研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)可通過促進纖維細胞積累，減弱Th17反應(yīng)和調(diào)節(jié)肺組織中的Th1/Th2細胞因子平衡而參與輻射誘導(dǎo)的肺纖維化，Treg耗竭可破壞Th1/Th2的平衡，增強Th1細胞因子的優(yōu)勢(如促進IFN-γ產(chǎn)生)，減少Th2細胞因子(如IL-4)的產(chǎn)生，通過治療性調(diào)節(jié)Treg可減慢輻射誘發(fā)的肺纖維化進程。本實驗以細胞內(nèi)高表達的IFN-γ代表Th1型細胞,IL-4代表Th2型細胞, 結(jié)果顯示模型組IFN-γ表達率降低而IL-4表達率升高，吡非尼酮組及銀杏葉提取物各組IFN-γ表達率較模型組高而IL-4表達率較模型組低，這與既往研究結(jié)果一致。Th1/Th2作為不同的Th細胞亞群，除了標志性代表因子IFN-γ/IL-4之外，尚分泌不同的細胞因子，因此僅觀察IFN-γ/IL-4的表達變化尚不能完全反映Th1/Th2細胞的平衡改變對肺纖維化的影響，但這為臨床提供了一條銀杏葉提取物通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞因子平衡而改善肺纖維化的治療思路。

NF-κB 是調(diào)控炎癥和免疫反應(yīng)的主要核轉(zhuǎn)錄因子之一，其中起主要調(diào)控作用的是由P50和P65亞基組成的異源二聚體[27]。NF-κB被誘導(dǎo)激活時，可促進多種炎癥因子的大量釋放，刺激成纖維細胞的增生和膠原纖維的沉積，從而促進器官纖維化的發(fā)生發(fā)展[28]。彭艷芳等[29]和劉衛(wèi)東等[30]實驗研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路可改善博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。盧林明等[31]的細胞實驗結(jié)果表明，白楊素能通過影響NF-κB信號通路而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，進而產(chǎn)生抗纖維化作用，其機制可能與抑制NF-κB p65的磷酸化和其核轉(zhuǎn)移有關(guān)。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組NF-κB p65的陽性顆粒呈優(yōu)勢表達，而吡非尼酮組及銀杏葉提取物各組陽性顆粒表達低于模型組。提示銀杏葉提取物有可能通過阻斷NF-κB p65信號通路，進一步抑制炎癥因子的釋放，從而延緩肺纖維化的進展。

綜上所述，推測銀杏葉提取物一方面通過對Th1/Th2標志性代表細胞因子IFN-γ/IL-4的平衡調(diào)節(jié)，抑制成纖維細胞的積累而起到減輕纖維化的作用；另一方面通過抑制NF-κB p65通路的激活而減輕炎癥反應(yīng)，從而改善纖維化。但該實驗存在實驗樣本量較少、未動態(tài)觀察各指標變化情況、未觀察檢測指標上下游信號通路的相關(guān)分子變化等不足，仍需進一步實驗加以證實。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。