工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)和功能分析

熊向英，王志成，劉旭佳，姚坤志，梁志輝

( 1.廣西海洋研究所有限責(zé)任公司，廣西 北海 536000；2.廣西科學(xué)院 廣西北部灣海洋研究中心，廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007 )

傳統(tǒng)漁業(yè)易造成環(huán)境污染、水資源短缺以及水產(chǎn)品質(zhì)量安全等一系列問(wèn)題。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)作為高密度集約化養(yǎng)魚的一種技術(shù)，可以在水資源利用率受到限制的情況下，通過(guò)許多不同的水處理方法使90%～99%的水得到循環(huán)利用[1]，是未來(lái)水產(chǎn)養(yǎng)殖模式的發(fā)展趨勢(shì)。在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，循環(huán)水養(yǎng)殖已相對(duì)成熟。在我國(guó)，循環(huán)水養(yǎng)殖近些年也得到了快速的發(fā)展。據(jù)2020年中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒資料，我國(guó)工廠化養(yǎng)殖2019年的產(chǎn)量達(dá)5.42×105t，其中山東和福建的產(chǎn)量占全國(guó)總量超過(guò)50%，達(dá)3.12×105t，主要集中在鲆鰈類、鱘魚、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、石斑魚和對(duì)蝦等產(chǎn)業(yè)[2-3]。筆者所在研究團(tuán)隊(duì)建立了一套適合應(yīng)用于廣西地區(qū)的工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，以近年來(lái)中國(guó)南方地區(qū)人工養(yǎng)殖常見(jiàn)品種紅鰭笛鯛(Lutjanuserythropterus)和珍珠龍膽石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus♂×E.lanceolatu♀)為養(yǎng)殖對(duì)象，在常規(guī)的水處理部分設(shè)計(jì)了沉淀池、蛋白分離池、生物過(guò)濾池外，還設(shè)計(jì)了海馬齒(Sesuviumportulacastrum)浮床池。海馬齒根系可對(duì)養(yǎng)殖水體中懸浮顆粒物起到清除作用[4]，并具有可充分利用環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)鹽的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)[5]，以達(dá)到生態(tài)修復(fù)的目的。

水產(chǎn)養(yǎng)殖中水質(zhì)變化與環(huán)境微生物緊密相關(guān)，微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)隨著養(yǎng)殖環(huán)境水體理化性質(zhì)的改變而改變[6]，而相比于更開(kāi)放的養(yǎng)殖系統(tǒng)，微生物群落在循環(huán)水養(yǎng)殖中發(fā)揮的作用更加重要[7]。全面解析循環(huán)水系統(tǒng)中各水處理單元細(xì)菌群落組成，比較各單元細(xì)菌群落組成、物種多樣性和功能的差異，可為構(gòu)建健康循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)提供理論依據(jù)。目前關(guān)于循環(huán)水系統(tǒng)細(xì)菌群落的研究方法包括PCR-DGGE[8-9]、16S rRNA基因克隆文庫(kù)[10]等傳統(tǒng)方法及基于高通量測(cè)序[11-12]的現(xiàn)代技術(shù)，且多集中于分析循環(huán)水生物濾池中生物載體上的微生物群落，而鮮見(jiàn)關(guān)于循環(huán)水系統(tǒng)中各單元之間細(xì)菌群落變化和功能方面的研究。筆者對(duì)該系統(tǒng)各水處理的單元水樣進(jìn)行基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)的高通量測(cè)序，分析其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成，并通過(guò)PICRUSt進(jìn)行菌群功能預(yù)測(cè)，以期探索循環(huán)水系統(tǒng)中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的變化，結(jié)果將有助于構(gòu)建健康的、適合于中國(guó)南方地區(qū)養(yǎng)殖的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)系統(tǒng)與養(yǎng)殖管理

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)建于廣西北海市廣西海洋研究所海水增養(yǎng)殖基地試驗(yàn)車間，該車間用于試驗(yàn)養(yǎng)殖的水池13口，每口池面積5.1 m×3.4 m，養(yǎng)殖水深90 cm，有效養(yǎng)殖水體15.6 m3/口。自動(dòng)沉降池2口，蛋白分離器占1口池，生物過(guò)濾系統(tǒng)經(jīng)3口池改造，海馬齒浮床和紫外殺菌池各1口。生物過(guò)濾系統(tǒng)有A、B、C 3個(gè)過(guò)濾通道，每個(gè)通道又分別有三級(jí)生物過(guò)濾池，其中：A、B兩個(gè)通道相同，采用商品濾料，珊瑚石作為一、二級(jí)生物過(guò)濾，生化球作為三級(jí)過(guò)濾；C通道由珊瑚石作為一級(jí)過(guò)濾，椰子殼碎作為二、三級(jí)過(guò)濾。海馬齒浮床池用平均長(zhǎng)度5～10 cm、莖節(jié)數(shù)3～4節(jié)的枝條進(jìn)行扦插，保證1～2個(gè)莖節(jié)在水面下，便于其正常生根，共放有6個(gè)浮床，每個(gè)浮床約300個(gè)扦插植株。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)處理順序?yàn)轸~池→沉淀池→蛋白分離器→生物濾池→海馬齒浮床→紫外殺菌→魚池(圖1)。

圖1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)示意Fig.1 Schematic diagram of circulating aquaculture system

養(yǎng)殖品種為廣西養(yǎng)殖較多的珍珠龍膽石斑魚和紅鰭笛鯛,養(yǎng)殖試驗(yàn)周期為2018年8月22日—9月21日。珍珠龍膽石斑魚的養(yǎng)殖密度71尾/m3，平均體長(zhǎng)15.9 cm，體質(zhì)量136.4 g；紅鰭笛鯛的密度160尾/m3，平均體長(zhǎng)11.4 cm，體質(zhì)量42.1 g。養(yǎng)殖期間每日8:00和17:00定時(shí)投喂，投喂量約為魚體質(zhì)量3%～5%，攝食不佳時(shí)，及時(shí)調(diào)整投喂量。試驗(yàn)期間循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)條件為：水溫28.5～31.4 ℃，溶解氧質(zhì)量濃度7.87～9.05 mg/L，鹽度28～31，pH 7.8～8.1。

1.2 樣品采集和水質(zhì)分析

取樣時(shí)間點(diǎn)為掛膜30 d水質(zhì)穩(wěn)定后，此時(shí)生物濾池掛膜基本完成。各池取3個(gè)點(diǎn)，混合作為1個(gè)樣品，用抽濾泵過(guò)濾水樣后進(jìn)行水質(zhì)分析。采用清時(shí)捷TA-90紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定營(yíng)養(yǎng)鹽含量：氨氮含量采用納氏試劑分光光度法測(cè)量；亞硝態(tài)氮含量采用重氮偶合分光光度法測(cè)量；硝態(tài)氮含量采用麝香草酚分光光度法測(cè)量；化學(xué)需氧量采用堿性高錳酸鉀法測(cè)量；磷酸鹽采用磷鉬藍(lán)分光光度法測(cè)量。高通量測(cè)序分析采用多點(diǎn)取樣法取水樣，每池共取3 L水樣，共采集6個(gè)樣品，分別為珍珠龍膽石斑魚池、紅鰭笛鯛池、沉淀池、蛋白分離池、生物濾池、海馬齒浮床池。所有樣品采集后立即放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室做后續(xù)處理。

1.3 樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

將每口池3 L水樣混勻后，取其中1 L水樣先經(jīng)5 μm孔徑的混合纖維膜預(yù)過(guò)濾去除雜質(zhì)后用0.22 μm無(wú)菌聚醚砜膜(津騰，中國(guó))進(jìn)行抽濾，將帶有水體菌體的濾膜剪碎，用E.Z.N.A Water DNA Extraction Kit試劑盒(Omega Bio-Tek，USA)提取。對(duì)16S rRNA基因可變區(qū)V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物序列為細(xì)菌特異性引物：341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTA AT-3′)。PCR產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送百邁克生物信息公司(北京)進(jìn)行基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序的方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對(duì)原始測(cè)序序列使用FLASH 1.2.11軟件進(jìn)行拼接，將拼接得到的序列使用Trimmomatic 0.33軟件進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，并利用UCHIME 8.1軟件去除嵌合體，得到高質(zhì)量序列(Tags)。分析過(guò)程中刪除了古菌、葉綠體、未知序列以及只檢測(cè)到1次的序列。利用USEARCH 10.0軟件對(duì)所有樣品的Tags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為運(yùn)算分類單元(OTU)，與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行物種注釋分析。通過(guò)α多樣性分析，統(tǒng)計(jì)各樣品在97%相似度水平下的Ace、Chaol、香農(nóng)及辛普森指數(shù)，繪制樣品等級(jí)豐度曲線，研究單個(gè)樣品內(nèi)部的物種多樣性。將測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Greengenes database 13.8數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后生成得運(yùn)算分類單元表，根據(jù)其16S rRNA基因拷貝數(shù)劃分的每個(gè)運(yùn)算分類單元豐度將其均一化，再利用PICRUSt(http:// picrust.github.io/picrust/)分析獲得京都基因和基因組百科全書(KEGG)群落功能分類信息，對(duì)樣品進(jìn)行基因功能預(yù)測(cè)并計(jì)算功能基因豐度。

2 結(jié) 果

2.1 水質(zhì)分析結(jié)果

由水質(zhì)分析結(jié)果(表1)可知：各水質(zhì)指標(biāo)在養(yǎng)殖池水經(jīng)過(guò)沉淀池后均大幅降低，化學(xué)需氧量、氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和磷酸鹽去除率分別為58.44%、54.27%、65.64%、40.39%、70.21%；經(jīng)過(guò)蛋白分離池又有小幅度的升高，經(jīng)過(guò)生物濾池后化學(xué)需氧量、氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和磷酸鹽質(zhì)量濃度分別下降了14.12%、4.96%、36.78%、22.09%和36.78%；經(jīng)過(guò)海馬齒浮床池后，化學(xué)需氧量、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮又降低了18.04%、10.00%和34.37%，但氨氮和磷酸鹽質(zhì)量濃度反而升高了30.60%和12.73%。

表1 各樣品的水質(zhì)指標(biāo) mg/LTab.1 Water quality indices of each sample

2.2 高通量測(cè)序結(jié)果

6個(gè)樣品以97%相似性水平劃分運(yùn)算操作分類單元，珍珠龍膽石斑魚池、紅鰭笛鯛池、沉淀池、蛋白分離池、生物濾池、海馬齒浮床池中有效運(yùn)算分類單元數(shù)目分別為470、468、513、510、406和543個(gè)。

2.3 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)各單元微生物群落分析

運(yùn)算分類單元物種注釋結(jié)果顯示，在門分類水平上優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要為變形菌門、擬桿菌門和疣微菌門，這3個(gè)門類在除海馬齒浮床池外的其他池中相對(duì)豐度總和均達(dá)到90%以上，在海馬齒浮床池中也達(dá)到76.64%。另外海馬齒浮床池中相對(duì)豐度較高的細(xì)菌還有綠彎菌門(6.66%)、酸桿菌門(4.42%)和放線菌門(3.10%)。變形菌門在各池中均為最優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類，占比為47.45%～85.66%，但在各池中差異顯著，其中在紅鰭笛鯛池相對(duì)豐度高達(dá)85.66%，而在生物濾池和海馬齒浮床池中僅有49.36%和47.45%(圖2a)。進(jìn)一步從綱分類水平上分析發(fā)現(xiàn)，α-變形菌綱在生物濾池和海馬齒浮床池中的減少是造成這種差異的主要原因(圖2b)。擬桿菌門在各樣品中為占比次優(yōu)的細(xì)菌門類，相對(duì)豐度變化為5.23%～23.51%。擬桿菌門在各池之間也有明顯差異，在生物濾池和海馬齒浮床池中的相對(duì)豐度明顯高于其他池(圖2c)。占比第三的細(xì)菌門類為疣微菌門，在各池之間的變化為2.52%～22.84%，該門在生物濾池中的相對(duì)豐度為22.84%，顯著高于其他池的相對(duì)豐度(2.52%～13.57%)(圖2d)。由門分類水平上的各池中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)可以看出，生物濾池和海馬齒浮床池中的細(xì)菌群落組成與其他池有較大差異，存在其特殊的細(xì)菌種群。

圖2 各樣品中的主要菌群相對(duì)豐度的差異Fig.2 The variation in relative abundance of the most dominant bacterial communities in different samplesEpiPro.珍珠龍膽石斑魚池；LutPro.紅鰭笛鯛池；Sed.沉淀池；Ozo.蛋白分離池；Bio.生物濾池；Pla.海馬齒浮床池；下同.EpiPro.E. fuscoguttatus ♂×E. lanceolatu ♀ tank；LutPro.L. erythropterus tank；Sed.Sedimentation filter tank；Ozo.Protein skimmer tank；Bio.Biofilter tank；Pla.S. portulacastrum floating bed tank；et sequentia.

進(jìn)一步對(duì)該循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在所有樣品中，交替赤桿菌屬(Altererythrobacter)(1.96%～38.64%)、Loktanella(6.62%～20.36%)、Rubritalea(2.38%～22.72%)、NS3a_ marine_ group(0.91%～7.24%)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(0.25%～17.68%)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)(1.10%～7.63%)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)(0.58%～8.61%)7個(gè)屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。對(duì)比水處理池和養(yǎng)殖池的優(yōu)勢(shì)菌發(fā)現(xiàn)，Loktanella在沉淀池和蛋白分離池中的占比(20.36%，18.20%)是其他池的2～3倍(6.62%～11.10%)，Rubritalea在生物濾池中的占比(22.72%)明顯高于其他池(2.38%～11.43%)(圖3)。

圖3 屬水平的菌群相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of genus-level bacterial communities

選取豐度占前30的菌群構(gòu)建屬水平物種豐度聚類熱圖，比較樣品之間群落組成的相似性和差異性。結(jié)果顯示，沉淀池和蛋白分離池聚為一支且支長(zhǎng)最短，生物濾池和海馬齒浮床池聚為一支，表明沉淀池和蛋白分離池的菌群相似度高，其次生物濾池和海馬齒浮床池菌群組成較相似(圖4)。

圖4 核心微生物屬水平的物種豐度聚類Fig.4 Heatmap of core microbiome at genus level

2.4 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)各單元微生物多樣性分析

各樣品的運(yùn)算分類單元覆蓋率均在99.7%以上，說(shuō)明本次測(cè)序較好地代表了樣品中菌群的真實(shí)情況。α多樣性可以反映單個(gè)樣品菌群豐度和菌群多樣性。由Ace和Chaol指數(shù)可以看出，海馬齒浮床池菌群豐度最高，生物濾池的菌群豐度最低。海馬齒浮床池香農(nóng)指數(shù)最大，辛普森指數(shù)最低，表明其菌群多樣性最高，生物濾池菌群多樣性較低。另外沉淀池和蛋白分離池的菌群豐度和菌群多樣性差別不大。珍珠龍膽石斑魚池和紅鰭笛鯛池菌群豐度相似，但紅鰭笛鯛池菌群多樣性在所有樣品中最低(表2)。

表2 各樣品的α多樣性指數(shù)Tab.2 α-diversity indices of each sample

2.5 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)各單元微生物群落功能分析

KEGG二級(jí)代謝途徑所有樣品共注釋到44種功能中，除去相對(duì)豐度小于1%的代謝途徑，做代謝途徑比較圖，結(jié)果顯示，6個(gè)樣品中基因相對(duì)豐度較高的功能包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、全局和概述地圖、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝、外來(lái)物質(zhì)的降解和代謝(圖5)?？傮w而言，該循環(huán)水系統(tǒng)中細(xì)菌群落占優(yōu)勢(shì)的功能類群主要在新陳代謝方面。

圖5 不同樣品相對(duì)豐度大于1%的KEGG代謝途徑(二級(jí)功能層)Fig.5 KEGG pathway of relative abundance exceeding 1% of samples in different samples (hierarchy level 2)A.氨基酸代謝；B.其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成；C.碳水化合物代謝；D.細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；E.能量代謝；F.折疊、分揀和降解；G.全局和概述地圖；H.糖鏈的生物合成和代謝；I.類脂化合物的代謝；J.膜轉(zhuǎn)運(yùn)；K.輔助因子和維生素代謝；L.其他氨基酸代謝；M.萜類和酮類化合物的代謝；N.核苷酸代謝；O.復(fù)制與修復(fù)；P.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；Q.翻譯；R.外來(lái)物質(zhì)的降解和代謝；下同.A.amino acid metabolism;B.biosynthesis of other secondary metabolites;C.carbohydrate metabolism;D.cell motility;E.energy metabolism;F.folding,sorting and degradation;G.global and overview map;H.glycan biosynthesis and metabolism;I.lipid metabolism;J.membrane transport;K.metabolism of cofactors and vitamins;L.metabolism of other amino acids;M.metabolism of terpenoids and polyketides;N.nucleotide metabolism;O.replication and repair;P.signal transduction;Q.translation;R.xenobiotics biodegradation and metabolism;et sequentia.

為比較不同樣品在代謝上的差異，將KEGG第二層級(jí)代謝途徑的豐度相似性進(jìn)行聚類。結(jié)果顯示，生物濾池和海馬齒浮床池聚為一支，沉淀池和蛋白分離池聚為一支，紅鰭笛鯛單獨(dú)為一支，這與核心微生物屬水平的物種豐度聚類結(jié)果類似(圖6)，表明沉淀池和蛋白分離池以及生物濾池和海馬齒浮床池的細(xì)菌群落行使的功能相似。

圖6 不同樣品KEGG代謝途徑聚類Fig.6 Heatmap of KEGG pathway in different samples

比較循環(huán)水系統(tǒng)不同組分中氮循環(huán)基因功能的差異，由KEGG第三層級(jí)代謝途徑下的氮代謝在各樣品中的相對(duì)豐度可以看出，海馬齒浮床池氮代謝的比例明顯高于其他池(圖7)。

圖7 基于PICRUSt預(yù)測(cè)的不同樣品中氮代謝相關(guān)基因相對(duì)豐度Fig.7 Relative abundances of genes relevant with N metabolism based on PICRUSt prediction in different samples

3 討 論

在廣西地區(qū)建立了一套適合南方養(yǎng)殖品種的工廠化循環(huán)水系統(tǒng)，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析了該系統(tǒng)中各水處理單元以及養(yǎng)殖池中水體菌群群落組成和功能差異，可為循環(huán)水養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

3.1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)各單元微生物群落分析

變形菌門是海洋環(huán)境中的主要異養(yǎng)菌，其中占主導(dǎo)地位的是α-變形菌綱和γ-變形菌綱[6,13]。擬桿菌門是海洋環(huán)境重要的微生物類群，是溶解性有機(jī)物的主要消費(fèi)者[14]，能降解養(yǎng)殖系統(tǒng)中的溶解性有機(jī)物，起到凈化水質(zhì)的作用。這兩種是大多數(shù)海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中最主要的細(xì)菌門類。Martins等[15]研究了大菱鲆(Scophthalmusmaximus)和賽納加爾鰨(Soleasenegalensis)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中各水處理單元的菌群組成，發(fā)現(xiàn)變形菌門是其中最優(yōu)勢(shì)菌群，其次為擬桿菌門。吳越等[16]發(fā)現(xiàn)，變形菌門是石斑魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中最豐富的微生物群落。本研究結(jié)果顯示，在門分類水平上，該系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門、擬桿菌門，其次為疣微菌門。比較循環(huán)水系統(tǒng)各單元之間細(xì)菌群落的變化發(fā)現(xiàn)：α-變形菌綱在生物濾池和海馬齒浮床池中顯著減少，擬桿菌門在生物濾池和海馬齒浮床池中的相對(duì)豐度明顯升高，疣微菌門在生物濾池中的相對(duì)豐度為22.84%，顯著高于其他池的相對(duì)豐度(2.52%～13.57%)。疣微菌門細(xì)菌是水生和陸地生態(tài)系統(tǒng)中數(shù)量最多和最關(guān)鍵的門類之一[17]，但由于疣微菌門的細(xì)菌多為不可培養(yǎng)的微生物，其功能還鮮為人知。有研究表明，環(huán)境中氮、磷含量會(huì)影響?zhàn)辔⒕T的群落組成和相對(duì)豐度[18-20]。侯婷婷等[21]發(fā)現(xiàn)，工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖青石斑魚(E.awoara)系統(tǒng)中疣微菌門的平均相對(duì)豐度較高，認(rèn)為是循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)正向選擇的結(jié)果。由門分類水平上的各池中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)可以看出，生物濾池和海馬齒浮床池中的細(xì)菌群落組成與其他池有較大差異，擬桿菌門和疣微菌門相對(duì)豐度均較高。進(jìn)一步從屬水平分析，該循環(huán)水系統(tǒng)所有樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬為交替赤桿菌屬、Loktanella、Rubritalea、NS3a_ marine_ group、假單胞菌屬和假交替單胞菌屬和發(fā)光桿菌屬。交替赤桿菌屬對(duì)水體中的污染物多環(huán)芳烴的降解發(fā)揮著重要的作用[22]。Loktanella屬紅桿菌科，在海水生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在，其在生態(tài)系統(tǒng)中的作用還未可知，但紅細(xì)桿菌科細(xì)菌已被鑒定為對(duì)含氮污染物的去除具有主要作用的菌群[23]。Rubritalea能將硝態(tài)氮還原成亞硝態(tài)氮，氧化多種有機(jī)分子進(jìn)行生長(zhǎng)[24]。已知的許多假單胞菌屬細(xì)菌同時(shí)兼具異養(yǎng)硝化和好氧反硝化雙重功能[25]，并參與磷的轉(zhuǎn)化和循環(huán)[26]，有較強(qiáng)的脫氮除磷能力。假交替單胞菌屬能分泌抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、殺藻、溶瓊脂和細(xì)胞毒素等生物活性物質(zhì)[27]，在水產(chǎn)上能起到防治病害和赤潮等作用。以上結(jié)果說(shuō)明各池的優(yōu)勢(shì)菌群在整個(gè)系統(tǒng)中能起到積極的作用。

3.2 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)微生物多樣性分析

微生物多樣性結(jié)果顯示，珍珠龍膽石斑魚池和紅鰭笛鯛池菌群豐度相似，但紅鰭笛鯛池菌群多樣性在所有樣品中最低，這可能與養(yǎng)殖品種的不同有關(guān)。另外，沉淀池和蛋白分離池的菌群豐度和菌群多樣性差別都不大。生物濾池對(duì)降解整個(gè)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中無(wú)機(jī)氮起著重要的作用[28]。有研究顯示，生物濾池微生物含量會(huì)通過(guò)生物濾膜表層細(xì)菌的脫落進(jìn)入水體而增加[29]。吳越等[16]在研究石斑魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，生物濾池中微生物數(shù)量較多，多樣性較為豐富。在本研究中表現(xiàn)出不同的結(jié)果，從運(yùn)算分類單元數(shù)目和α多樣性指數(shù)分析可見(jiàn)，生物濾池中菌群豐度最低，菌群多樣性也較低。但養(yǎng)殖水經(jīng)過(guò)生物濾池后，水凈化效果顯著，這可能是因?yàn)殡m然生物濾池的菌群豐度和多樣性不高，但參與氮、磷代謝的功能菌較多，或是生物填料里生物膜上菌群很豐富，因此水處理效果明顯。另外海馬齒浮床池菌群豐度和菌群多樣性均最高，這是因?yàn)橹参锔H能分泌根際微生物所需的碳源和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而影響根際微生物的群落結(jié)構(gòu)[30]。

3.3 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)各單元微生物群落功能分析

海洋環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含有量與微生物群落結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)[31]，水體營(yíng)養(yǎng)水平的變化不僅能改變微生物的豐度和多樣性[32]，還能顯著影響微生物群落功能[33]。循環(huán)水各單元微生物群落基因功能共注釋到44種功能，結(jié)果顯示，該循環(huán)水系統(tǒng)中細(xì)菌群落占優(yōu)勢(shì)的功能類群主要在氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝等方面。KEGG第二層級(jí)代謝途徑的功能聚類熱圖結(jié)果與核心微生物屬水平物種豐度聚類熱圖結(jié)果類似，沉淀池和蛋白分離池聚為一支且支長(zhǎng)最短，生物濾池和海馬齒浮床池聚為一支，表明相似的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)行使的功能也類似。循環(huán)水養(yǎng)殖模式屬于高密度集約化養(yǎng)殖，其養(yǎng)殖過(guò)程中由殘餌、糞便產(chǎn)生的氨氮、亞硝態(tài)氮是整個(gè)系統(tǒng)中主要的代謝廢物，也是重點(diǎn)去除對(duì)象。沉淀池主要用于大顆粒懸浮物沉降，該系統(tǒng)中沉淀池面積約占15%，養(yǎng)殖水經(jīng)過(guò)沉淀池后，由于大顆粒懸浮物清除作用，化學(xué)需氧量、氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮和磷酸鹽的質(zhì)量濃度大幅下降。但經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)分離池后，各水質(zhì)指標(biāo)又略微升高。再經(jīng)過(guò)生物濾池的凈化處理，各水質(zhì)指標(biāo)均有不同程度的下降，尤其是硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和磷酸鹽質(zhì)量濃度下降明顯，去除率分別為36.78%、22.09%和36.78%，最后經(jīng)過(guò)海馬齒浮床池后，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度又下降了34.37%，說(shuō)明該系統(tǒng)中生物濾池和海馬齒浮床池菌群有較好的水處理效果，海馬齒浮床池中氮代謝相關(guān)功能基因相對(duì)豐度明顯高于其他樣品也證實(shí)了這一點(diǎn)。根際微生物在植物對(duì)污染物的吸附和積累以及污染物的降解和轉(zhuǎn)化中起著關(guān)鍵作用[34]。海馬齒在水體富營(yíng)養(yǎng)化治理和生物修復(fù)中取得了良好的效果，如在湛江地區(qū)用海馬齒浮床在對(duì)蝦精養(yǎng)池塘中吸收養(yǎng)殖水體中富含的氨氮、亞硝態(tài)氮、磷酸鹽等營(yíng)養(yǎng)鹽[35]；通過(guò)構(gòu)建室內(nèi)模擬海水養(yǎng)殖系統(tǒng)海馬齒生物浮床發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)中氮、磷去除能力有顯著提高[36]。由于生物浮床系統(tǒng)具有成本小、耗能低以及無(wú)二次污染等特點(diǎn)，因此海馬齒浮床可在海水循環(huán)水養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用。

4 結(jié) 論

綜上所述，生物濾池和海馬齒浮床池中α-變形菌綱相對(duì)豐度顯著減少，擬桿菌門明顯增多，同時(shí)疣微菌門在生物濾池中的相對(duì)豐度顯著高于其他池。從屬的水平分析，優(yōu)勢(shì)菌Loktanella在沉淀池和蛋白分離池中的占比是其他池的2～3倍，Rubritalea在生物濾池中的占比明顯高于其他池。海馬齒浮床池菌群豐度和菌群多樣性均最高，生物濾池菌群豐度最低。在群落組成和結(jié)構(gòu)方面，生物濾池和海馬齒浮床池樣品與其他樣品相似度最低。