泥鰍鰓出血病病原菌及其拮抗菌的分離鑒定

王倩楠，馮 妍，賈凌晨，劉有華，皮喬木，徐思琪，李聯(lián)泰,，蔡月鳳，安賢惠,

( 1.江蘇海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005 )

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)屬泥鰍科，為小型底棲淡水經(jīng)濟(jì)魚類。泥鰍對(duì)生活環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，一般生活在泥漿底部的靜止或緩慢流動(dòng)的水體中，也可以生活在潮濕營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境中，如湖底、池塘、溝渠和稻田底部。泥鰍主要分布在亞洲沿岸國(guó)家，如中國(guó)、日本、韓國(guó)和印度等；在我國(guó)廣泛分布于江西贛江支流、萍鄉(xiāng)等地的淡水流域[1]。泥鰍素有“水人參”[2]之稱，可直接加工食用也可干制入藥，因其富含蛋白質(zhì)且肉質(zhì)鮮嫩而備受人們喜愛，也是出口水產(chǎn)品之一[3]。

近年來，隨著市場(chǎng)需求的增加，泥鰍養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，規(guī)模也不斷擴(kuò)大，社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益顯著提高，養(yǎng)殖出口量占泥鰍總產(chǎn)量的20%～40%，每667 m2可產(chǎn)泥鰍超過1000 kg，可獲純利潤(rùn)至少5000元。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模和密度不斷增大，其發(fā)病率也逐步升高，泥鰍病害大量發(fā)生甚至死亡，產(chǎn)量大幅度下降，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。泥鰍病害主要為泥鰍出血病[4-5]、幼魚紅點(diǎn)病[6]、泥鰍腐皮病[7]等，致使其發(fā)病的病原菌主要有維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[8]、腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)[5]等，其中維氏氣單胞菌感染所引起的病例占比較高，但從水產(chǎn)動(dòng)物中分離得到其拮抗菌的報(bào)道較少[9-11]。

維氏氣單胞菌主要感染變溫動(dòng)物[12]，對(duì)魚類具有較強(qiáng)的致病性，也是泥鰍鰓出血病的主要致病菌之一[13]，該細(xì)菌能通過傷口感染、水源和食源等途徑傳播[14]。在孟加拉國(guó)，該細(xì)菌曾引起魚類流行性潰瘍綜合征[15]。據(jù)報(bào)道，自養(yǎng)殖場(chǎng)的水生生物體內(nèi)分離得到維氏氣單胞菌，通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)維氏氣單胞菌攜帶眾多致病因子，耐藥性也逐漸增強(qiáng)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的正常健康發(fā)展具有潛在的威脅[16]。有研究表明，維氏氣單胞菌能感染草魚(Ctenopharyngodonidella)[17]、大口黑鱸(Micropterussalmoides)[18]、斑點(diǎn)叉尾(Ietaluruspunetaus)[19]、大刺鰍(Mastacembelusarmatus)[20]、泥鰍[21]等。秦蕾等[22]最早從泥鰍病灶部位篩選出1株維氏氣單胞菌NQ，該菌導(dǎo)致泥鰍出現(xiàn)體表出血、皮膚潰瘍等癥狀，其致死率達(dá)60%；王穎等[4]自泥鰍肝臟及病灶處篩選出2株維氏氣單胞菌Q2和Q3，均使泥鰍出現(xiàn)出血癥狀；盧艷敏等[5]自患病泥鰍中篩選出致使泥鰍出血的維氏氣單胞菌2株；徐先棟等[6]自泥鰍幼魚的肝臟、脾臟、腎臟及病灶部位篩出使其出現(xiàn)紅點(diǎn)病的維氏氣單胞菌FZ2N，其半致死劑量為1.1×103cfu/g。

拮抗菌的篩選已有報(bào)道。楊喬喬等[11]從泥鰍養(yǎng)殖場(chǎng)的水體中分離篩選得到泥鰍腐皮病的拮抗菌解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)；郝彥利[23]篩選得到副溶血弧菌的拮抗菌枯草芽孢桿菌(B.subtilis)H19；王侃[24]分離篩選得到1株海洋拮抗菌RF106。關(guān)于維氏氣單胞菌拮抗菌的篩選，國(guó)內(nèi)報(bào)道較少。凡飛等[25]曾篩選獲得1株熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)4-1-3；何濤等[9]從草魚中分離得到的拮抗菌為解淀粉芽孢桿菌。有研究表明，解淀粉芽孢桿菌拮抗物質(zhì)為糖類物質(zhì)[7]、脂肽類物質(zhì)[9]、伊枯草菌素和芬薺素等[26]，熒光假單胞菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)包括黃綠膿菌素、吩嗪、氫氰酸、生物表面活性劑、鄰氨基苯甲酸等[27]。而有研究表明，屬于熒光假單胞菌生物變種Ⅱ的邊緣假單胞菌(P.marginalis)可致植物病變[28]，能夠降解煙堿[29]，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖中未見有拮抗菌為邊緣假單胞菌的報(bào)道。筆者自出現(xiàn)鰓出血病癥狀的泥鰍病灶部位分離到泥鰍鰓出血病病原菌，并以此為指示菌對(duì)其拮抗菌進(jìn)行分離與篩選，以期為該菌的生態(tài)防治研究提供參考，并為維氏氣單胞菌引發(fā)的病害防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鰓出血病泥鰍活體、健康泥鰍、水體及池塘底泥均采自江蘇省連云港某泥鰍養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 主要試劑

Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、dNTP、DNA Ladder Mix maker、Dream Taq-TM DNA Polymerase均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病原菌的分離純化

隨機(jī)取鰓出血病泥鰍2尾，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇對(duì)樣品表面進(jìn)行消毒，用解剖刀取其病灶部位，在無菌條件下劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察菌落形態(tài)[30]。挑選不同形態(tài)、顏色、大小的單菌落進(jìn)行多次分離純化，直至獲得純培養(yǎng)物。

1.3.2 回歸感染試驗(yàn)

將分離出的純化物分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h，將菌液分別稀釋至1.0×108cfu/mL[4]，試驗(yàn)組泥鰍注射稀釋后的菌液0.1 mL/尾，對(duì)照組注射0.9%的無菌生理鹽水0.1 mL/尾[31]，每個(gè)菌株1組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行10尾。每隔24 h給泥鰍換水、投餌，每次換水1/3，觀察其生長(zhǎng)狀況，并對(duì)感染泥鰍的生存情況、死亡率和死魚的癥狀進(jìn)行觀察、記錄。

1.3.3 拮抗菌的分離

稱取泥鰍養(yǎng)殖場(chǎng)的底泥樣品5 g，放入盛有45 mL無菌水的三角燒瓶中，180 r/min振搖20 min，取1 mL放入盛有9 mL無菌水的試管中；取1 mL泥鰍養(yǎng)殖場(chǎng)的水體，放入盛有9 mL無菌水的試管中，分別以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋菌液，在無菌環(huán)境中將菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基，每個(gè)密度3組平行，28 ℃恒溫培養(yǎng)，24 h后觀察菌落形態(tài)，挑選不同形態(tài)、顏色、大小的單菌落進(jìn)行平板三區(qū)劃線，以達(dá)到分離純化的目的，重復(fù)挑單菌落劃線直至獲得純培養(yǎng)物。

1.3.4 拮抗菌的篩選——打孔抑菌圈法

利用打孔法[32]抑菌試驗(yàn)篩選拮抗菌，以無菌LB液體培養(yǎng)基作對(duì)照組，其中一個(gè)孔里加入50 μL LB液體培養(yǎng)基，其他孔分別加入各個(gè)純化物的過夜發(fā)酵菌液50 μL，每組3個(gè)平行，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，10 h后開始每隔2 h觀察抑菌圈生長(zhǎng)情況，直至長(zhǎng)出抑菌圈，并測(cè)量抑菌圈大小。從初篩結(jié)果中選出有抑菌圈的菌株，通過重復(fù)打孔法進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。

1.3.5 病原菌和拮抗菌的形態(tài)觀察及生理生化鑒定

取適量菌液涂片，涂片后進(jìn)行革蘭氏、芽孢和莢膜染色[33]。將拮抗菌以1∶100(體積比)的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中，過夜振蕩發(fā)酵培養(yǎng)，利用微量生化鑒定管和自制的大分子水解培養(yǎng)基進(jìn)行生理生化鑒定，并按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[33]操作。

1.3.6 16S rDNA序列的測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

提取篩選所得到的病原菌和拮抗菌總DNA，以細(xì)菌通用引物[21]1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)和27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)。

表1 PCR反應(yīng)程序Tab.1 PCR reaction procedure

PCR擴(kuò)增完成后，將產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。然后將目標(biāo)菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序完成后將所得序列提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中已存在的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行相似性的比較，運(yùn)用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.7 拮抗菌藥敏試驗(yàn)

將拮抗菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，在振蕩培養(yǎng)箱中以180 r/min、28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)定其D(600 nm)，采用藥敏紙片法做抑菌試驗(yàn)。將發(fā)酵好的菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，貼藥敏紙片：紅霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、頭孢克肟、慶大霉素、復(fù)方新諾明、利福平、阿莫西林、青霉素G、四環(huán)素、鏈霉素、磺胺異亞唑等，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑大小，以易華山等[34-35]提供的指標(biāo)作為藥物敏感度標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.8 拮抗菌抗菌譜

將本實(shí)驗(yàn)室保存的病原菌鰻弧菌(Vibrianguillaris)、哈維氏弧菌(V.havieri)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溫和氣單胞菌(A.sobria)、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)和豚鼠氣單胞菌(A.caviae)等接種于試管中活化，在28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以180 r/min過夜發(fā)酵。取不同的病原菌均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，采用打孔法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，將發(fā)酵液加入孔中，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后記錄抑菌圈直徑大小，每組3個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離

按1.3.1中的方法，取不同的菌落進(jìn)行觀察，經(jīng)多次分離，得到7株不同形態(tài)的單菌落，分別編號(hào)為JY1、JY2、JY3、JY4、JY5、JY6和JY7。

2.2 回歸感染及病原菌的篩選

用上述獲得的7株病原菌，按1.3.2方法進(jìn)行人工感染試驗(yàn)，結(jié)果表明，菌株JY2、JY5、JY6對(duì)泥鰍均有不同程度的致病性，且有明顯的鰓出血癥狀(圖1)，其中感染菌株JY5的泥鰍在第2天全部死亡，即死亡率100%(表2)。

圖1 初選病原菌回歸感染健康泥鰍后的病癥Fig.1 Primary symptoms of healthy loach M. anguillicaudatus exposed to re-infected with primary selective bacterial pathogens

表2 菌株JY2、JY5、JY6對(duì)泥鰍的回歸感染試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Regression infection test results of loach M. anguillicaudatus challenged with strains JY2,JY5 and JY6

2.3 拮抗菌的分離純化及篩選

經(jīng)過分離純化后得到28株不同形態(tài)的單菌落，其中菌株CJT4、CJT6、CJT10、CJT17-2和CJT23共5個(gè)純化物表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性。菌株CJT23的抑菌圈最大，因此確定菌株CJT23為目標(biāo)拮抗菌，其抑菌效果見圖2。

圖2 CJT23抑制JY5效果Fig.2 Effect diagram of JY5 inhibited by CJT23

2.4 病原菌和拮抗菌的形態(tài)特征及生理生化鑒定

將菌株JY5和CJT23在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌株JY5形態(tài)特征：菌落呈圓形，灰白色，不透明，中央稍凸起，表面光滑，邊緣整齊；革蘭氏陰性菌，短桿狀(圖3a～b)。菌株CJT23形態(tài)特征：菌落呈圓形，白色，半透明，中央凸起，邊緣整齊光滑，黏稠不易挑起；革蘭氏陰性菌，短桿狀，無芽孢，有莢膜，有運(yùn)動(dòng)性(圖3c～d)。

圖3 菌落形態(tài)及革蘭氏染色Fig.3 Colony morphology and Gram staininga、b.病原菌JY5；c、d.拮抗菌CJT23.a,b.pathogenic bacterium JY5；c,d.antagonistic bacterium CJT23.

病原菌JY5大分子水解培養(yǎng)基結(jié)果(圖4)表明：淀粉水解培養(yǎng)基中出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉已被水解，為陽性；油脂水解培養(yǎng)基中出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，說明脂肪已被水解，為陽性；明膠水解培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)(對(duì)照組呈凝固狀態(tài))，說明明膠被水解，為陽性。拮抗菌CJT23淀粉水解、油脂水解、明膠水解結(jié)果分別呈現(xiàn)出無色透明圈、紅色斑點(diǎn)、明膠液態(tài)化，說明淀粉、脂肪、明膠均被水解，為陽性(圖4)。

圖4 病原菌JY5和拮抗菌CJT23對(duì)大分子物質(zhì)水解反應(yīng)Fig.4 Hydrolysis of macromolecules by pathogenic bacterium JY5 and antagonistic bacterium CJT23A.病原菌JY5；B.拮抗菌CJT23；a.淀粉水解；b.油脂水解；c.明膠水解；1.對(duì)照組；2.試驗(yàn)組.A.pathogenic bacterium JY5；B.antagonistic bacterium CJT23；a.starch hydrolysis；b.oil hydrolysis；c.gelatin hydrolysis；1.control group；2.experimental group.

病原菌JY5和拮抗菌CJT23的生理生化鑒定結(jié)果見表3、表4。病原菌JY5能夠利用葡萄糖、甘露醇、果糖肉湯等，而不能利用赤蘚醇、乳糖、苯丙氨酸等。拮抗菌CJT23能利用葡萄糖、七葉苷、西蒙氏枸櫞酸鹽、賴氨酸脫羧酶等，不能利用木糖、酒石酸鹽、阿拉伯醇、硝酸鹽等。

表3 病原菌JY5的生理生化特性Tab.3 The physiological and biochemical characteristics of the pathogenic bacterium JY5

表4 菌株CJT23的生理生化特性Tab.4 The physiological and biochemical characteristics of the antagonistic bacterium CJT23

2.5 病原菌和拮抗菌16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

按1.3.6方法，將病原菌JY5和拮抗菌CJT23測(cè)序所得序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，病原菌JY5與維氏氣單胞菌同源性達(dá)到100%，拮抗菌CJT23與邊緣假單胞菌同源性達(dá)到99%。由MEGA 7.0構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5、圖6。病原菌JY5與維氏氣單胞菌聚為一支，同時(shí)根據(jù)其菌落形態(tài)及生理生化特性，將該菌暫定名為維氏氣單胞菌JY5(GeneBank登錄號(hào)MW418195)；拮抗菌CJT23與邊緣假單胞菌聚為一支，且菌落形態(tài)及生理生化特性與其相似，因此，將CJT23初步命名為邊緣假單胞菌CJT23(GeneBank登錄號(hào)MW418194)。

圖5 基于16S rDNA序列BLAST結(jié)果構(gòu)建的細(xì)菌JY5的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of bacterial JY5 based on 16s rDNA sequence BLAST

圖6 基于16S rDNA序列BLAST結(jié)果構(gòu)建的細(xì)菌CJT23的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of bacterial CJT23 based on 16s rDNA sequence BLAST

2.6 拮抗菌藥敏性

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，邊緣假單胞菌CJT23對(duì)環(huán)丙沙星、諾氟沙星、慶大霉素、鏈霉素、恩諾沙星、復(fù)方新諾明敏感性較強(qiáng)(表5)，用邊緣假單胞菌CJT23防治維氏氣單胞菌時(shí)應(yīng)避免使用以上敏感藥物和中敏藥物。

表5 菌株CJT23的藥敏性Tab.5 Drug sensitivity of bacterium CJT23

2.7 拮抗菌的抗菌譜

拮抗譜結(jié)果表明，邊緣假單胞菌CJT23對(duì)不同的病原菌表現(xiàn)出不同的拮抗作用，其中：對(duì)維氏氣單胞菌JY5的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑最大達(dá)(21.00±0.41) mm；對(duì)副溶血弧菌和鰻弧菌拮抗性較強(qiáng)，抑菌圈直徑分別為(17.97±0.21)、(15.93±0.26) mm；創(chuàng)傷弧菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、哈維氏弧菌抑菌圈直徑分別為(12.73±0.26)、(12.63±0.17)、(12.57±0.12)、(11.47±0.17) mm；對(duì)豚鼠氣單胞菌無抑菌效果(圖7)。故菌株CJT23對(duì)防治由維氏氣單胞菌、副溶血弧菌、鰻弧菌引起的病害可能會(huì)有更好的效果。

圖7 拮抗菌的抗菌譜Fig.7 Antimicrobial spectrum of antagonistic bacteriuma.維氏氣單胞菌JY5；b.副溶血弧菌；c.鰻弧菌；d.創(chuàng)傷弧菌；e.哈維氏弧菌；f.嗜水氣單胞菌；g.溫和氣單胞菌；h.豚鼠氣單胞菌；A.無菌LB液體培養(yǎng)基；B.發(fā)酵液.a.A. sveronii JY5；b.V. parahaemolyticus；c.V. anguillaris；d.V. vulnificus；e.V. havieri；f.A. hydrophila；g.A. sobria；h.A. caviae；A.sterile LB liquid medium；B.the fermented liquid.

3 討 論

3.1 深入研究需增加管家基因序列測(cè)序

本試驗(yàn)中，因基于生產(chǎn)實(shí)踐，以快速得到大致結(jié)果服務(wù)于生產(chǎn)，故只從菌種形態(tài)觀察、生理生化鑒定、16S rDNA序列分析方面進(jìn)行了初步鑒定。如果要在理論上進(jìn)一步深入研究本試驗(yàn)涉及的2個(gè)菌株，則需要增加管家基因，如gyrB、cpn60、dnaJ等基因。

3.2 試驗(yàn)用病原菌維氏氣單胞菌源于生產(chǎn)實(shí)踐

維氏氣單胞菌對(duì)魚類具有較強(qiáng)的致病性，有研究表明，維氏氣單胞菌能感染泥鰍[21]。筆者根據(jù)連云港某泥鰍養(yǎng)殖場(chǎng)泥鰍養(yǎng)殖過程中發(fā)生的鰓出血病，有針對(duì)性地分離得到1株致病性較強(qiáng)的菌株JY5，從形態(tài)特征、生理生化鑒定和16S rDNA序列分析等，初步判斷該菌株為維氏氣單胞菌，其結(jié)果與王穎等[4-6,22]的結(jié)果基本一致。有學(xué)者從泥鰍病灶部位篩選出維氏氣單胞菌，魚體有體表出血癥狀[4-5,22]，但鰓出血癥狀未見報(bào)道。同時(shí)關(guān)于該病原菌的致病機(jī)理、致病途徑等諸多方面的深化研究均有待進(jìn)一步開展。

3.3 維氏氣單胞菌拮抗菌篩選可為生物防治提供參考

近年來，篩選拮抗菌防治水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的研究越來越多，拮抗菌作為生物防治的一種有效且環(huán)保的防治方法，目前被廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)中，有針對(duì)性地篩選維氏氣單胞菌JY5的拮抗菌，獲得具有較強(qiáng)拮抗作用的菌株CJT23。從形態(tài)特征、生理生化鑒定和16S rDNA序列分析等方面，初步判斷該菌株為邊緣假單胞菌，結(jié)果與甘琴華等[28]結(jié)果基本一致。關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物拮抗菌的篩選已有報(bào)道，已篩選出的菌株有解淀粉芽孢桿菌[9,11]、枯草芽孢桿菌[23]、熒光假單胞菌[25]等，但邊緣假單胞菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為拮抗菌且其活性物質(zhì)的研究尚未見報(bào)道。這一試驗(yàn)結(jié)果擴(kuò)充了維氏氣單胞菌拮抗菌的類型，豐富了維氏氣單胞菌拮抗菌資源庫(kù)，為維氏氣單胞菌引發(fā)的病害防治奠定了材料基礎(chǔ)。筆者后續(xù)工作將分離純化并鑒定邊緣假單胞菌CJT23的活性物質(zhì)，為揭示其拮抗機(jī)理以進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

3.4 拮抗菌的研發(fā)使用為泥鰍養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和環(huán)境保護(hù)提供基礎(chǔ)

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，傳統(tǒng)防治病害的方法是使用化學(xué)藥品和抗生素[22]。由于化學(xué)藥品和抗生素的濫用，出現(xiàn)了諸多弊病。如藥物殘留，間接危害人體健康[36]，破壞機(jī)體內(nèi)微環(huán)境，破壞水環(huán)境的微生態(tài)平衡，使養(yǎng)殖水產(chǎn)品和病原菌產(chǎn)生耐藥性并污染環(huán)境[37]。筆者主要對(duì)拮抗菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，旨在在水產(chǎn)養(yǎng)殖中利用邊緣假單胞菌抑制維氏氣單胞菌時(shí)避免使用對(duì)邊緣假單胞菌呈現(xiàn)敏感及中敏的藥物。根據(jù)目前查閱的資料，國(guó)內(nèi)外對(duì)維氏氣單胞菌疫苗研究的報(bào)道較少[19,38]，因此，研發(fā)新型微生物制劑或疫苗引起了科研工作者的關(guān)注，成為生物防治的研究熱點(diǎn)[39]。通過生物防治的途徑，可有效減少水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中水生動(dòng)物病害的發(fā)生，能夠有針對(duì)性地解決魚類疾病，減少水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中魚類的發(fā)病率，降低水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的損失，同時(shí)避免水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用抗生素而造成環(huán)境污染及藥物殘留，為水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)性發(fā)展和環(huán)境保護(hù)提供基礎(chǔ)資源。

4 結(jié) 論

連云港某泥鰍養(yǎng)殖場(chǎng)的泥鰍出現(xiàn)鰓出血病是因?yàn)楦腥玖司S氏氣單胞菌JY5，以維氏氣單胞菌為指示菌分離篩選得到其拮抗菌邊緣假單胞菌CJT23。邊緣假單胞菌CJT23菌落呈圓形，白色，半透明，中央凸起，邊緣整齊光滑，黏稠不易挑起；屬革蘭氏陰性菌，短桿狀，無芽孢，有莢膜，有運(yùn)動(dòng)性。邊緣假單胞菌CJT23淀粉水解、油脂水解、明膠水解均為陽性。邊緣假單胞菌CJT23對(duì)環(huán)丙沙星、諾氟沙星、慶大霉素、鏈霉素、氯霉素、恩諾沙星、復(fù)方新諾明敏感性較強(qiáng)。邊緣假單胞菌CJT23對(duì)維氏氣單胞菌JY5抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑最大達(dá)到(21.00±0.41) mm；對(duì)副溶血弧菌和鰻弧菌拮抗性較強(qiáng)，抑菌圈直徑分別為(17.97±0.21)、(15.93±0.26) mm。