烏蘇里擬鲿igf基因克隆及其與生長性狀關聯(lián)分析

魏夢雅，王思夢，寧 靜，范 帆，朱傳坤

( 淮陰師范學院 生命科學學院，江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室，江蘇省特色水產(chǎn)繁育工程實驗室，江蘇省區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 淮安 223300 )

烏蘇里擬鲿(Pseudobagrusussuriensis)是鲇形目鲿科的一種底棲中型魚類，自然分布于黑龍江至珠江流域的水系中[7]。烏蘇里擬鲿肉質(zhì)細嫩、味道鮮美，粗脂肪含量高，較一般淡水魚適口性好，深受消費者喜愛，經(jīng)濟價值極高[8]。受環(huán)境污染、人類活動干擾及生境破壞等因素的影響，烏蘇里擬鲿資源量銳減，野生資源無法滿足市場需求，目前已在全國十余省份開展人工養(yǎng)殖[9]。與大多數(shù)養(yǎng)殖魚類面臨的問題類似，烏蘇里擬鲿養(yǎng)殖過程中也不可避免地出現(xiàn)了品質(zhì)退化現(xiàn)象，亟需開展其種質(zhì)改良及優(yōu)良品種選育工作。然而，由于對烏蘇里擬鲿的研究起步較晚，且主要集中于人工繁殖[10-12]、養(yǎng)殖模式改進[13-15]、性別決定[16-17]、遺傳分析[18-20]等方面。利用候選基因法篩選與特定性狀關聯(lián)的分子標記，對定向改良水產(chǎn)動物性狀具有重要作用，并已在多種魚類中篩選到與生長性狀關聯(lián)的優(yōu)勢基因型[21]。在烏蘇里擬鲿中，生長相關基因數(shù)據(jù)極少，對于下丘腦—垂體—肝生長調(diào)控軸中的相關基因，目前尚未見相關研究報道。因此，筆者通過轉(zhuǎn)錄組與二代基因組測序數(shù)據(jù)結(jié)合的基因克隆技術，擴增獲得烏蘇里擬鲿生長調(diào)控軸中igf1基因和igf2基因的DNA和cDNA序列，并分析基因序列中的多態(tài)位點與體質(zhì)量、體長等主要生長性狀間的關聯(lián)性，以期為烏蘇里擬鲿生長發(fā)育調(diào)控機制研究、基因進化研究以及采用候選基因法開展分子標記輔助育種等工作提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、數(shù)據(jù)采集及基因組DNA提取

烏蘇里擬鲿樣本均來自淮安市水產(chǎn)技術指導站，隨機挑選80尾當年繁殖、養(yǎng)殖至3月齡的同批次幼魚作為試驗魚。測量每尾個體的體質(zhì)量(m)、體寬、體長(L)、頭長，并計算其肥滿度指數(shù)(K)。

K=100m/L3

每尾個體剪取少量尾鰭組織，置于無水乙醇中，并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；另取部分尾鰭組織，采用通用的苯酚—氯仿法抽提基因組DNA[22]。

1.2 引物設計與igf基因片段克隆

烏蘇里擬鲿igf基因片段克隆所用引物依據(jù)轉(zhuǎn)錄組和基因組二代測序(數(shù)據(jù)未發(fā)表)所得部分片段及其近緣物種黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)(KX434878.1、HM210742.1)和斑點叉尾(AH015082.2、NM_001200295.1、AY615885.1)中igf1和igf2基因序列，利用Primer premier 5.0軟件設計(表1)。

表1 烏蘇里擬鲿igf1和igf2基因克隆和多態(tài)分析引物Tab.1 Primers used for cloning and polymorphic analysis of igf1 and igf2 genes in Ussuri catfish P. ussuriensis

PCR反應體系總體積為50 μL：10×PCR buffer 5 μL、滅菌超純水37.4 μL、引物(2.5 μmol/L)1.6 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)1.6 μL、模板DNA 4 μL(約500 ng)、Taq DNA聚合酶0.4 μL(北京康為世紀公司)。PCR反應在96孔PCR儀中運行，反應程序如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，適宜溫度條件下退火40 s，72 ℃延伸45 s，共36個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分型，并采用回收試劑盒進行切膠回收純化。純化產(chǎn)物于16 ℃條件下過夜連接12 h，連接到pMD18-T載體中[寶生物工程(大連)有限公司]，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5α大腸桿菌(Escherichiacoli)中。陽性克隆通過PCR檢測后，利用武漢艾康健生物科技有限公司的ABI DNA3730測序儀進行測序。

1.3 igf基因序列分析

通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中所得igf基因的cDNA序列與克隆所得DNA序列比對分析，參照黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)和斑點叉尾的igf基因序列，確定烏蘇里擬鲿igf基因的外顯子和內(nèi)含子邊界(GT-AG)。igf基因的氨基酸序列通過在線工具包Sequence Manipulation Suite(https://www.biosoft.net/sms/)進行預測，并同時進行氨基酸序列的一致性和相似性分析。分別利用SignalP v.4.0 server(https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和ProP 1.0 web server (https://www.cbs.dtu.dk/servi ces/ProP/)進行信號肽和成熟肽的預測。

為分析烏蘇里擬鲿igf基因與其他物種的進化關系，將烏蘇里擬鲿igf基因編碼序列與其他魚類igf基因編碼序列進行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。用于比較的近源物種共包括鲇形目2種、鯉形目3種、鱸形目2種、鮭形目2種、鲉形目1種、外源物種1個(表2)。利用ClustalX軟件進行聚類分析，利用MEGA 7.0軟件的鄰接法對聚類分析后的igf基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，自展次數(shù)設置為1000次，以斑馬魚igf3基因為外類群。

表2 系統(tǒng)進化分析物種的igf基因序列信息Tab.2 Information on igf genes of species used for phylogenetic analysis

1.4 多態(tài)位點篩選及其與生長性狀的關聯(lián)分析

利用克隆烏蘇里擬鲿igf基因的引物對所得igf基因序列進行分段分析，查找多態(tài)位點。將各引物在10尾個體中擴增后，進行PCR產(chǎn)物測序。PCR體系組成和反應程序與1.2中所述一致。測序所得序列通過ClustalX軟件比對，結(jié)合對測序峰圖的觀察，來篩選igf基因中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點。

將包含SNP位點的引物在80尾個體中進行PCR擴增及PCR產(chǎn)物測序，通過測序峰圖對每個個體進行基因分型。分型完成后，利用軟件Popgene 32和Arlequin 3.11進行期望雜合度、觀測雜合度、多態(tài)信息含量、哈迪—溫伯格偏離指數(shù)、連鎖不平衡等多態(tài)性分析。

利用SPSS 18.0軟件中的一般線性模型進行多態(tài)位點不同基因型與體質(zhì)量、體寬、體長、頭長和肥滿度等生長性狀間的關聯(lián)分析。由于試驗魚為同齡且養(yǎng)殖于相同環(huán)境，因此關聯(lián)分析時不考慮世代、環(huán)境等因素影響，所用模型為：

Y=μ+G+e

式中，Y為體質(zhì)量、體寬、體長、頭長和肥滿度生長性狀的觀測值，μ為各生長性狀的平均值，G為各基因型的固定效應，e為隨機殘差。

利用鄧肯多重比較來評估差異顯著性，當P<0.05時為差異顯著，當P<0.01時為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 烏蘇里擬鲿igf基因結(jié)構(gòu)分析

克隆獲得了烏蘇里擬鲿igf1和igf2的基因序列。其中所得igf1基因cDNA長度為1241 bp，包括5′非編碼區(qū)(UTR)290 bp，開放閱讀框(ORF)477 bp，3′非編碼區(qū)474 bp。由于內(nèi)含子序列過長，未獲得igf1基因DNA完整序列，獲得的igf1基因部分DNA序列長度為10 922 bp；烏蘇里擬鲿igf1基因共包含5個外顯子和4個內(nèi)含子；外顯子1～5的序列長度分別為33、166、182、36、60 bp；內(nèi)含子1所得部分長度為1101 bp，內(nèi)含子2所得部分長度為6222 bp，內(nèi)含子3長度為995 bp，內(nèi)含子4部分長度為2127 bp(圖1a)。所得igf2基因cDNA長度為2008 bp，包括5′非編碼區(qū) 26 bp，開放閱讀框741 bp，3′非編碼區(qū)1241 bp。所得igf2基因DNA序列分析結(jié)果顯示：該基因由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成；外顯子1長度為171 bp，外顯子2為151 bp，外顯子3為182 bp，外顯子4為237 bp；內(nèi)含子1部分長度為789 bp，內(nèi)含子2長度為1649 bp，內(nèi)含子3長度為521 bp(圖1b)。烏蘇里擬鲿igf1和igf2基因內(nèi)含子和外顯子間均具有顯著的GT-AG邊界特征。

圖1 烏蘇里擬鲿igf1(a)和igf2(b)基因結(jié)構(gòu)示意Fig.1 Diagram of the gene structures for igf1 (a) and igf2 (b) in Ussuri catfish P. ussuriensis

烏蘇里擬鲿igf1基因編碼多肽鏈長度為158個氨基酸，包括含41個氨基酸的信號肽序列，含70個氨基酸的B-C-A-D結(jié)構(gòu)域以及含47個氨基酸的E結(jié)構(gòu)域，此外，在第47、59、88、89、93和102位為6個保守的參與形成二硫鍵的半胱氨酸(圖2)。與其他物種IGF1氨基酸序列相似性分析結(jié)果顯示，烏蘇里擬鲿與鲇形目鲿科魚類黃顙魚IGF1一致性(96.9%)和相似性(97.5%)均最高，其次為鲇形目科的斑點叉尾(93.7%和95.6%)，與鯉形目3種魚類的一致性相同，均為76.1%，與其他目魚類的一致性相對較低(表3)。烏蘇里擬鲿igf2基因編碼246個氨基酸，其中信號肽長度為47個氨基酸，B-C-A-D結(jié)構(gòu)域長度為70個氨基酸，E結(jié)構(gòu)域由97個氨基酸組成，序列中也包含6個保守的半胱氨酸，分別位于第56、68、96、97、101和110位(圖3)。與IGF1類似，烏蘇里擬鲿IGF2與黃顙魚的一致性(96.7%)和相似性(97.2%)最高，其次為斑點叉尾(88.8%和90.2%)，所不同的是IGF2與鮭形目、鱸形目等魚類間的一致性和相似性高于IGF1(表3)。

圖2 烏蘇里擬鲿與其他物種IGF1氨基酸序列比對結(jié)果Fig.2 Alignment results between Ussuri catfish P. ussuriensis and other species based on amino acid sequences of IGF1 peptides單線標注的為信號肽，雙線標注的為B-C-A-D結(jié)構(gòu)域，虛線標注的為E結(jié)構(gòu)域，箭頭所示的為6個保守的半胱氨酸；下同.The signal peptide is marked with a single line,the B-C-A-D domain is marked with a double line,the E domain is marked with a dotted line,and the six conserved cysteines are marked with arrows;et sequentia.

圖3 烏蘇里擬鲿與其他物種IGF2氨基酸序列比對結(jié)果Fig.3 Alignment results between Ussuri catfish P. ussuriensis and other species based on amino acid sequences of IGF2 peptides

表3 烏蘇里擬鲿igf1和igf2基因編碼氨基酸序列與部分物種的一致性和相似性分析結(jié)果Tab.3 Results of identity and similarity analyses between Ussuri catfish P. ussuriensis and other species based on amino acid sequences coding by igf1 and igf2 genes

2.2 烏蘇里擬鲿與其他物種igf基因系統(tǒng)進化分析

將烏蘇里擬鲿igf1和igf2基因編碼區(qū)與鲇形目的黃顙魚、斑點叉尾，鯉形目的斑馬魚、草魚、團頭魴，鱸形目的尼羅羅非魚、金頭鯛，鮭形目的北極紅點鮭、大西洋鮭，鲉形目的若鲉杜父魚及外類群牛，進行系統(tǒng)進化分析。鄰接系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，igf1基因和igf2基因明顯分為兩大分支，分別包含上述物種。在每一分支中，烏蘇里擬鲿首先與其所在鲇形目的魚類黃顙魚和斑點叉尾聚為一支，然后與鯉形目魚類聚為一支，而鱸形目、鮭形目和鲉形目則聚為另一支，因此，這也反映出烏蘇里擬鲿所在鲇形目與鯉形目的親緣關系較近(圖4)。

圖4 基于烏蘇里擬鲿與其他魚類igf基因編碼區(qū)的鄰接系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.4 The Neighbor-Joining phylogenetic tree between Ussuri catfish P. ussuriensis and other species based on coding regions of igf genes

2.3 烏蘇里擬鲿igf1和igf2基因多態(tài)位點篩選

對烏蘇里擬鲿igf1和igf2基因的多態(tài)性進行了分段分析，結(jié)果顯示，在igf1基因中共檢測到5個SNP位點，其中1個位于外顯子3上(g.8703A>G)，其余4個集中于內(nèi)含子4中(g.10021T>C、g.10034G>T、g.10210C>T和g.10211C>A)(圖5)。此外，在igf1基因內(nèi)含子中共發(fā)現(xiàn)7個微衛(wèi)星序列，其中：內(nèi)含子1中包含3個，分別為(GAAA)8、(TC)5和(TC)11CCTTC(CT)7；內(nèi)含子2中包含3個，分別為(TCT)11、(TATT)8和(TG)5；內(nèi)含子4中包含1個(CT)15微衛(wèi)星序列。在烏蘇里擬鲿igf2基因中共發(fā)現(xiàn)SNP位點5個，其中：1個位于外顯子3中(g.2975C>T)，2個位于內(nèi)含子1中(g.228A>C和g.296A>C)，2個位于內(nèi)含子2中(g.1371A>G和g.1431C>T)(圖6)。在igf2基因中共檢測出5個微衛(wèi)星位點，其中：內(nèi)含子1中包含3個，分別為(TG)15N(TG)4(AG)5CGAGT(GA)4GTA(TG)13、(GA)5TAA(AG)5和(AG)6；內(nèi)含子2中包含2個，分別為(TA)6CAC(GT)5和(TC)7。

圖6 烏蘇里擬鲿igf2基因中的SNP位點Fig.6 Positions of SNPs in the igf2 gene of Ussuri catfish P. ussuriensis

2.4 烏蘇里擬鲿igf1和igf2基因中SNP與生長性狀關聯(lián)性分析

選取igf1基因外顯子3中的SNP位點g.8703A>G和igf2基因外顯子3中的SNP位點g.2975C>T開展基因型與體質(zhì)量、體長、體寬、頭長和肥滿度5個生長性狀間的關聯(lián)性分析。多態(tài)性分析結(jié)果顯示：g.8703A>G含2個等位基因，觀測雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.374、0.502和0.450，符合哈迪—溫伯格平衡(P>0.05)(表4)；g.2975C>T也含2個等位基因，觀測雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.374、0.501和0.413，也未偏離哈迪—溫伯格平衡(P>0.05)(表4)，兩位點間不存在連鎖不平衡現(xiàn)象(P>0.05)。在位點g.8703A>G處，A和G等位基因頻率分別為47.50%和52.50%，共檢測到3種基因型，其中：雜合基因型AG的基因型頻率最高，為45.00%；AA和GG的基因型頻率分別為25.00%和 30.00%(表5)。在g.2975C>T位點處，堿基C和T的等位基因頻率分別為46.88%和53.12%，CC、CT和TT 3種基因型頻率分別為26.25%、41.25%和32.50%，仍然是雜合基因型的頻率最高(表5)。關聯(lián)分析結(jié)果顯示，這兩個多態(tài)位點的基因型與生長性狀間均無顯著關聯(lián)性(P>0.05)(表5)。

表4 烏蘇里擬鲿igf1和igf2基因中外顯子SNP位點的多態(tài)性信息Tab.4 Polymorphic information of SNPs in exons of igf1 and igf2 genes in Ussuri catfish P. ussuriensis

表5 烏蘇里擬鲿igf1和igf2基因編碼區(qū)SNP位點與生長性狀關聯(lián)分析結(jié)果Tab.5 Results of association analysis between growth traits and SNPs from coding region of igf1 and igf2 genes in Ussuri catfish P. ussuriensis

3 討 論

3.1 igf1和igf2基因結(jié)構(gòu)

在魚類中，igf1和igf2基因的cDNA序列已被廣泛報道，DNA則相對較少。目前的研究結(jié)果顯示，魚類igf1基因的序列長度差異較大，但均不超過20 kb，絕大多數(shù)魚類的igf1基因均由5個外顯子和4個內(nèi)含子構(gòu)成，并且內(nèi)含子2的長度為4個內(nèi)含子中最長[3,23-25]。本研究中，獲得的烏蘇里擬鲿igf1基因部分DNA長度10 922 bp，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，與其他魚類中報道結(jié)果類似，內(nèi)含子2是4個內(nèi)含子中最長的，長度大于6222 bp。在斑馬魚、金魚(Carassiusauratus)等已報道魚類中，igf2基因的DNA長度均小于igf1基因，外顯子和內(nèi)含子數(shù)目也不同于igf1基因，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成[26-27]。本研究中，所得烏蘇里擬鲿igf2基因部分DNA序列長度為3700 bp，也由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成。以上研究結(jié)果表明，烏蘇里擬鲿igf1和igf2基因的結(jié)構(gòu)與目前在其他魚類中已報道的結(jié)構(gòu)類似，這也反映出這兩個基因在魚類中具有較高的保守性。

3.2 igf1和igf2基因編碼多肽的結(jié)構(gòu)特征及進化分析

烏蘇里擬鲿igf1和igf2基因的開放閱讀框長度分別為477 bp和741 bp，編碼氨基酸數(shù)目分別為158個和246個。烏蘇里擬鲿IGF1的158個氨基酸序列由41個氨基酸組成的信號肽、70個氨基酸構(gòu)成的成熟肽(B-C-A-D結(jié)構(gòu)域)和47個氨基酸形成的E肽(E結(jié)構(gòu)域)構(gòu)成，其中包含6個保守的參與形成二硫鍵的半胱氨酸，這與在黃顙魚[28]、金錢魚[4]、白梭吻鱸(Sanderlucioperca)[29]等魚類中報道的結(jié)構(gòu)類似。烏蘇里擬鲿IGF2肽鏈由246個氨基酸組成，成熟肽長度也為70個氨基酸，與IGF1成熟肽長度一致，序列中也包含6個保守的半胱氨酸，其結(jié)構(gòu)與金錢魚[4]、雙棘黃姑魚(Protonibeadiacanthus)[30]、白梭吻鱸[29]的IGF2結(jié)構(gòu)類似。烏蘇里擬鲿IGF1和IGF2氨基酸與鲇形目鲿科的黃顙魚相應序列的一致性和相似性均最高，其次為鲇形目科的斑點叉尾和與鯉形目魚類，這也與它們的分類地位相對應。此外，所不同的是烏蘇里擬鲿的IGF2與鮭形目、鱸形目等魚類IGF2間的一致性和相似性均高于IGF1，說明igf1基因進化過程中的變異程度高于igf2基因，因此，IGF2在魚類中保守性較IGF1高。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，igf1基因和igf2基因明顯分為兩支，烏蘇里擬鲿的igf1基因和igf2基因分別首先與鲇形目魚類聚為一支，然后和鯉形目魚類聚為一支，最后和外類群牛聚為一支。該聚類結(jié)果表明，脊椎動物igf1基因和igf2基因間的分化時間要早于物種的分化，其他魚類中的研究結(jié)果也均支持這一觀點[4,31-32]。

3.3 igf1和igf2基因多態(tài)性及其與生長性狀關聯(lián)分析

對igf1和igf2基因多態(tài)性及其與經(jīng)濟性狀的關聯(lián)分析在畜禽中開展較早，并有大量研究報道。目前igf1和igf2基因的多態(tài)性及與目標性狀的相關性分析在魚類中也有較多報道，如：在鯉(Cyprinuscarpio)中，研究人員從igf1基因中檢測到4個SNP位點，發(fā)現(xiàn)其中有2個與體質(zhì)量和體長相關[33]；阮瑞霞等[34]在吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)igf1基因中檢測出3個SNP位點，發(fā)現(xiàn)2個與生長性狀相關的SNP位點，并且其中一個與雄魚質(zhì)量增加、體寬/體長顯著相關，另一個除與雄魚體高/體長相關外，也與雌、雄魚的質(zhì)量增加顯著相關；此外，在大西洋鮭、大口黑鱸(Micropterussalmoide)、白梭吻鱸等魚類的igf1基因中也發(fā)現(xiàn)了較多與生長性狀關聯(lián)的多態(tài)位點[29,35-36]。魚類igf2基因中多態(tài)性及關聯(lián)分析也已有報道，如：在半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)中，igf2基因編碼區(qū)的SNP位點多態(tài)性與雄性生長性狀、血液生化和基因表達顯著相關[37]；在羅非魚中，研究人員在igf2基因內(nèi)共鑒定出11個SNP位點，其中部分位點與羅非魚體型和體質(zhì)量等性狀顯著相關[38]。筆者在烏蘇里擬鲿igf1基因中共檢測到5個SNP位點和7個微衛(wèi)星序列，其中1個SNP位點(g.8703A>G)位于外顯子3上；在igf2基因中共發(fā)現(xiàn)5個SNP位點和5個微衛(wèi)星位點，其中1個SNP位點(g.2975C>T)位于外顯子3上。在igf1和igf2基因的各5個SNP位點中，均有3個是由堿基轉(zhuǎn)換產(chǎn)生，另外2個為顛換；微衛(wèi)星位點的比較發(fā)現(xiàn)，igf1基因中多堿基重復類型所占比例較高，而igf2基因中則均為二堿基重復類型。將igf1和igf2基因外顯子中的SNP位點與生長性狀進行了關聯(lián)分析，其不同基因型個體的體質(zhì)量、體長、體寬、頭長、肥滿度等生長性狀均差異不顯著，因此未檢測到這兩個位點與生長性狀的關聯(lián)性。類似結(jié)果在其他魚類中也有廣泛報道[33-34,39]。通過對編碼氨基酸的分析，發(fā)現(xiàn)主要原因是烏蘇里擬鲿igf1和igf2基因外顯子上這兩個SNP位點均為同義突變，堿基的改變并未引起氨基酸的變化，對表達產(chǎn)物也沒有影響，無法影響生長性狀。筆者所獲得的igf1和igf2基因序列及多態(tài)性信息可為在烏蘇里擬鲿中深入挖掘該基因功能、摸清其對生長發(fā)育的調(diào)控機制及分子標記輔助育種等研究提供基本數(shù)據(jù)。

4 結(jié) 論

烏蘇里擬鲿igf1和igf2基因外顯子和內(nèi)含子數(shù)均與已報道硬骨魚類相應基因中的數(shù)目一致，兩基因編碼氨基酸序列組成也與其他魚類中報道的類似。烏蘇里擬鲿igf1和igf2基因中均存在較多多態(tài)位點，并且均包含位于外顯子中的SNP位點，但均為同義突變，與生長性狀無顯著關聯(lián)性。