基于轉(zhuǎn)錄組測序探究烏鱧皮膚白化的分子機(jī)制

李 巖，周 燕，雷 駱，蘇 建，樊 威，羅 煜，李俊婷，高 賀，周朝偉

( 1.西南大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，重慶 402460；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380；3.四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 內(nèi)江 641000 )

體色是脊椎動物最重要的表型特征之一，具有擇偶、物種識別、隱藏、警告等重要的功能[1]。色素沉著失調(diào)會引起體色的變異，其中最典型的表現(xiàn)是皮膚白化，通常被認(rèn)為是由先天性代謝紊亂所致[2]。目前，公認(rèn)的導(dǎo)致動物白化的原因主要有兩種：黑色素細(xì)胞缺乏和黑色素合成障礙。在魚類上，黑色素細(xì)胞合成載有大量黑色素的黑素體，黑素體的發(fā)育涉及到細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運，經(jīng)過4個不同的階段后，含有黑色素的成熟黑素體被轉(zhuǎn)運到角質(zhì)層，最終使魚體出現(xiàn)不同的體色[3-4]。若生理、環(huán)境或遺傳上的任何改變干擾了動物黑色素細(xì)胞發(fā)育與分化或黑色素合成過程中的任一環(huán)節(jié)，均會導(dǎo)致動物白化現(xiàn)象的發(fā)生，但是影響魚類皮膚色素沉著最基本的因素是遺傳[5]。魚類頻繁出現(xiàn)白化現(xiàn)象，如白化的斑馬魚(Daniorerio)[6]、骨頰海鲇(Osteogeneiosusmilitaris)[7]和叉牙鯛(Sarpasalpa)[8]等。然而，大量的研究集中在分離和鑒定與魚類白化性狀相關(guān)的基因方面，分子機(jī)制相關(guān)研究較為缺乏，有關(guān)色素沉著相關(guān)基因和其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的聯(lián)系仍需要進(jìn)一步探究。

烏鱧(Channaargus)屬鱸形目鱧屬，俗稱烏魚和黑魚，白烏鱧(C.argusvar.)為烏鱧白化變異種，俗稱白烏魚、白烏棒，主要分布于四川省嘉陵江中下游流域、沱江流域，是我國重要的肉食性經(jīng)濟(jì)魚類[9]。與普通烏鱧相比，白烏鱧由于其營養(yǎng)價值高、體色特殊受到了養(yǎng)殖戶及觀賞魚從業(yè)者的關(guān)注。截至目前，烏鱧白化形成的分子機(jī)制尚未查明。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可廣泛應(yīng)用于分析生物不同性狀、不同生理狀態(tài)和不同組織中基因表達(dá)變化情況，有利于挖掘與特定性狀密切相關(guān)的基因。筆者利用Illumina HiSeq技術(shù)對烏鱧和白烏鱧的體色差異進(jìn)行研究，探究烏鱧皮膚白化的分子調(diào)控機(jī)制，以期對其種質(zhì)資源保護(hù)和遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及樣品采集

試驗所用白烏鱧、烏鱧均由內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所提供，出苗時間、生長環(huán)境、喂養(yǎng)條件均一致。白烏鱧為烏鱧白化變異種，體色多為灰白色，縱觀背部到腹部，呈現(xiàn)出從青灰色到灰白色逐漸過渡的趨勢(圖1)；烏鱧身體背部較暗，呈黑褐色，腹部色淺，體側(cè)具多角形不規(guī)則深色斑紋(圖1)。隨機(jī)挑選健康狀況良好的白烏鱧和烏鱧各3尾，體長(38.00±2.09) cm，體質(zhì)量(513±23.78) g。取3尾白烏鱧的體側(cè)皮膚組織(圖1a)，標(biāo)記為白烏鱧1、白烏鱧2、白烏鱧3；取3尾烏鱧體側(cè)花色均勻的皮膚組織(圖1b)，標(biāo)記為烏鱧1、烏鱧2、烏鱧3；共6個組織樣品。將試驗魚用丁香酚麻醉后，快速取下其皮膚組織，置于 1.5 mL無酶EP管，迅速放入液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃中保存，用于隨后的轉(zhuǎn)錄組測定。另取15尾白烏鱧的體側(cè)皮膚組織和15尾烏鱧體側(cè)花色均勻的皮膚組織，每尾魚取3塊皮膚組織，凍存于-80 ℃，用于隨后的實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。

圖1 白烏鱧與烏鱧皮膚采樣部位Fig.1 Skin sampling location of albino northern snakehead C. argus var. and northern snakehead C. argus

1.2 RNA-seq文庫制備及測序

采用動物組織總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取總RNA，再通過1%的瓊脂糖凝膠電泳分析28S RNA和18S RNA降解程度以及是否有污染，使用NanoDrop 2000核酸檢測儀(Thermo公司,美國)檢測RNA純度,使用Qubit?2.0 Flurometer (Life Technologies，美國)測定總RNA濃度，用Agilent 2100(安捷倫科技公司，美國)精確檢測RNA的完整性。樣品檢測合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。隨后加入裂解緩沖液將mRNA打斷成短片段，以這些mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物random hexamers合成一鏈cDNA，加入緩沖液、dNTPs、DNA polymerase Ⅰ和RNase H，合成二鏈cDNA，用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA先進(jìn)行末端修復(fù)、加poly(A)尾并連接測序接頭，再用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇。最后進(jìn)行PCR富集得到最終的cDNA文庫。庫檢合格后，將不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求集中后進(jìn)行HiSeq雙端測序，每個樣本測6 Gb數(shù)據(jù)量，稱為原始測序數(shù)據(jù)(Raw reads)，并對其原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，去除含adapter和含N比例大于10%的數(shù)據(jù)，去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)(質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整條數(shù)據(jù)的50%以上)，得到的數(shù)據(jù)稱為過濾后數(shù)據(jù)(Clean reads)，用于后續(xù)的信息分析。試驗用6個樣品均由武漢菲沙基因信息有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及分析。

1.3 差異表達(dá)基因的組裝篩選、功能注釋和富集分析

以烏鱧的genome為參考基因(http://gigadb.org/dataset/100279)，對高質(zhì)量過濾后數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋。使用FPKM法[10]估算基因表達(dá)量，即基因的長度和比對到該基因的次數(shù)。用R語言包DEseq2進(jìn)行差異分析[11]，以|log2(fold change)|≥2且P≤0.05作為閾值。錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)是通過對差異顯著性P值進(jìn)行校正得到的。采用公認(rèn)的Benjamini-Hochberg校正方法對原有假設(shè)檢驗得到的顯著性P值進(jìn)行校正，并最終采用錯誤發(fā)現(xiàn)率作為差異表達(dá)基因篩選的關(guān)鍵指標(biāo)。利用Hyper-geometric distribution分析法，將差異基因、上調(diào)基因、下調(diào)基因分別進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，錯誤發(fā)現(xiàn)率≤0.05，表示差異基因顯著富集。

1.4 單核苷酸多態(tài)性、插入缺失標(biāo)記分析方法

用軟件Samtools進(jìn)行去重復(fù)(Mark duplicates)[12]和軟件GATK進(jìn)行局部重比對(Local realignment)、堿基質(zhì)量值校正(Base recalibration)[13]等處理，對烏鱧和白烏鱧共6個樣本進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性和插入缺失標(biāo)記檢測，取兩款軟件得到結(jié)果的交集，作為最終的高質(zhì)量突變。隨后，采用SnpEff(4.3p)軟件對各樣本進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性和插入缺失標(biāo)記注釋，以獲得單核苷酸多態(tài)性和插入缺失標(biāo)記的位置，明確其位于哪個基因/基因間區(qū)，是否為錯義突變等。對單核苷酸多態(tài)性、插入缺失標(biāo)記的檢測結(jié)果進(jìn)行注釋，從而實現(xiàn)DNA水平差異基因挖掘和差異基因功能注釋等。

1.5 定量表達(dá)分析

為驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，利用qRT-PCR分析，挑選出轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中前10個具有差異表達(dá)的基因(干擾素誘導(dǎo)的GTP酶5樣基因、XLOC_000762、NLR家族CARD域基因、嘌呤核苷磷酸化酶樣異結(jié)構(gòu)X1基因、補(bǔ)體C7、角鯊烯單氧酶基因、XLOC_022395、C-C基序趨化因子17樣的基因、唾液酸結(jié)合凝集素、超長鏈?；o酶A合成酶樣的基因)和酪氨酸代謝通路中的4個差異表達(dá)基因[酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(tyrp1)基因、CF_GLEAN_10017395、乙醇脫氫酶5(adh5)基因、黑尿酸酶(hgd)基因]進(jìn)行驗證。使用與轉(zhuǎn)錄組測序同批次的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(白烏鱧皮膚組織樣本，n=15；烏鱧皮膚組織樣本，n=15)，cDNA的合成參照PrimerScript?RT reagent Kit (寶生物，中國)試劑盒說明書進(jìn)行。使用軟件Primer 6設(shè)計引物，以18S RNA和β-actin為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR驗證(表1)。使用SYBR?Premix Ex TaqTM (寶生物，中國)熒光定量試劑盒，利用qTOWER 3.0熒光定量Roche Light Cycler 96 (Roche，瑞士)熒光定量儀進(jìn)行qRT-PCR定量驗證。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個循環(huán)。采用2-△△Ct法對目的基因進(jìn)行相對定量分析；使用SPSS 22軟件進(jìn)行差異分析，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

表1 qRT-PCR驗證引物序列Tab.1 Sequences of qRT-PCR amplification

2 結(jié) 果

2.1 測序結(jié)果統(tǒng)計及質(zhì)量評估

利用3個白烏鱧皮膚組織和3個烏鱧皮膚組織，構(gòu)建了6個皮膚組織轉(zhuǎn)錄組文庫，得到209 332 480條過濾后數(shù)據(jù)，平均過濾后數(shù)據(jù)為34 888 747，Q20堿基百分比平均為 95.78%，Q30堿基百分比平均為90.19%，堿基G和C的數(shù)量總和占總堿基數(shù)量的百分比平均為47.31%，比對率平均為58.48%(表2)。本次測序結(jié)果中Q30堿基百分比平均在90%以上，Q20堿基百分比平均在95%以上(表2)。試驗結(jié)果表明，本次測序結(jié)果質(zhì)量較好。此外，為提高本試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，筆者分析了3個白烏鱧和3個烏鱧皮膚組織之間的相關(guān)性，結(jié)果表明，白烏鱧和烏鱧皮膚的RNA文庫中3個生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)性很高(圖2)。這說明筆者利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)測定獲得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和可靠性較高，可用于后續(xù)分析。

圖2 6個文庫相關(guān)性分析Fig.2 Clustering figure of correlation analysis of 6 libraries

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計Tab.2 Summary of RNA-seq data assessment

2.2 差異表達(dá)基因分析

通過R語言中的edgeR程序，計算得到694個差異表達(dá)基因(|log2(fold change)|≥2，P<0.01)，相對于烏鱧，白烏鱧皮膚中有223個表達(dá)上調(diào)基因和471個表達(dá)下調(diào)基因(圖3)。

圖3 烏鱧與白烏鱧皮膚差異表達(dá)基因火山圖(a)和柱形圖(b)Fig.3 Volcano plots (a) and column chart (b) of differentially expressed genes between the albino norther snakehead C. argus var. and norther snakehead C. argus

2.3 差異表達(dá)基因功能分析

對694個差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋，共注釋到1241個GO條目上(圖4)，其中：594條注釋到生物過程，包含了細(xì)胞進(jìn)程和代謝過程等；387條注釋到細(xì)胞組分，包括細(xì)胞器和細(xì)胞聯(lián)接等；260條注釋到分子功能，包括信號傳感器活性和轉(zhuǎn)運活性等。注釋的3個一級功能富集最多的GO條目分別為細(xì)胞過程(n=97)、膜(n=84)和結(jié)合功能(n=124)。

圖4 差異表達(dá)基因的GO富集分析結(jié)果Fig.4 The results of GO functional enrichment of the differentially expressed genes

對白烏鱧上調(diào)差異表達(dá)基因(223個)進(jìn)行KEGG通路富集，最顯著的前20條通路見圖5，包括吞噬體、細(xì)胞間受體相互作用、蛋白質(zhì)消化吸收、氨基糖和核苷酸糖代謝及HIF-1信號通路等。白烏鱧下調(diào)的471個差異表達(dá)基因富集最顯著的前20條KEGG通路見圖6，包括細(xì)胞黏附分子通路、凝血與補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)信號通路、視黃醇代謝通路、細(xì)胞色素P450外源物代謝通路和酪氨酸代謝等。

圖5 白烏鱧上調(diào)差異基因KEGG富集結(jié)果Fig.5 The results of KEGG enrichment of differentially up-regulated genes in albino northern snakehead C. argus var.

圖6 白烏鱧下調(diào)差異基因KEGG富集結(jié)果Fig.6 The results of KEGG enrichment of differentially down-regulated genes in albino northern snakehead C. argus var.

此外，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，酪氨酸代謝通路(Ko00350)為顯著的富集通路。此通路上共檢測到37個基因，比較白烏鱧和烏鱧皮膚組織基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，這37個基因里只有tyrp1、CF_GLEAN_10017395、adh5、hgd基因這4個基因為差異表達(dá)基因。

2.4 單核苷酸多態(tài)性、插入缺失標(biāo)記分析

利用Samtools和GATK檢測到純合型單核苷酸多態(tài)性位點最大值為12 152，最小值為5443，雜合型單核苷酸多態(tài)性位點最大值為54 382，最小值為5588；相較于烏鱧，白烏鱧純合型單核苷酸多態(tài)性位點數(shù)目多，而雜合型單核苷酸多態(tài)性位點數(shù)少(表3)。此外，純合型插入缺失標(biāo)記位點最大值為2003，最小值為916，雜合型插入缺失標(biāo)記位點最大值為1858，最小值為1072；相較于烏鱧，白烏鱧純合型插入缺失標(biāo)記位點數(shù)目多，雜合型插入缺失標(biāo)記位點數(shù)少(表4)。

表3 烏鱧及白烏鱧轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中單核苷酸多態(tài)性位點數(shù)量統(tǒng)計Tab.3 Summary of single nucleotide polymorphism (SNP) identified in the RNA-seq data of norther snakehead C. argus and albino northern snakehead C. argus var.

表4 烏鱧及白烏鱧轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中插入缺失標(biāo)記數(shù)量統(tǒng)計Tab.4 Summary of INDEL identified in the RNA-seq data of northern snakehead C. argus and albino northern snakehead C. argus var.

基于轉(zhuǎn)錄組單核苷酸多態(tài)性和插入缺失標(biāo)記的結(jié)果，在經(jīng)過篩選后的6578個基因里共找到18 767個單核苷酸多態(tài)性位點，其中10.03%屬于非同義編碼位點，33.31%為下游位點，16.89%為上游位點，2.88%的基因間位點，24.41%為同義編碼位點，12.32%為內(nèi)含子位點(圖7a)。在差異表達(dá)基因中找到3個基因符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，共發(fā)現(xiàn)5個突變位點(表5)，其中hgd、adh5基因?qū)儆诶野彼岽x通路里的差異表達(dá)基因，表明這2個單核苷酸多態(tài)性可能會造成黑色素合成受阻，從而導(dǎo)致白烏鱧皮膚白化。另外，在符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的804個基因中找到917個插入缺失標(biāo)記位點，其中0.87%屬于移碼位點，15.38%為內(nèi)含子位點，3.49%為基因間位點，51.69%為下游位點，28.57%為上游位點(圖7b)。將804個基因與色素沉淀及酪氨酸代謝相關(guān)基因比對，未找到符合條件的插入缺失標(biāo)記位點。

圖7 單核苷酸多態(tài)性(a)和插入缺失標(biāo)記(b)的分布Fig.7 The distribution of SNPs (a) and INDELs (b)

表5 突變差異基因Tab.5 Mutation of DEGs

2.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗證

qRT-PCR結(jié)果顯示，選取的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中前10個具有差異表達(dá)的基因以及在酪氨酸代謝通路中4個差異表達(dá)基因，在烏鱧(n=15)與白烏鱧(n=15)皮膚組織中表達(dá)水平趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相吻合(圖8)，表明轉(zhuǎn)錄組結(jié)果是真實可信的。

圖8 轉(zhuǎn)錄組分析獲得的14個差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證結(jié)果Fig.8 Results of the qRT-PCR verification from 14 differentially expressed genes obtained by transcriptome analysis1.干擾素誘導(dǎo)的GTP酶5樣基因；2.XLOC_000762；3.NLR家族CARD域基因；4.嘌呤核苷磷酸化酶樣異結(jié)構(gòu)X1基因；5.補(bǔ)體C7基因；6.角鯊烯單氧酶基因；7.XLOC_022395；8.C-C基序趨化因子17樣的基因；9.唾液酸結(jié)合凝集素基因；10.超長鏈?；o酶A合成酶樣的基因；11.酪氨酸酶相關(guān)蛋白1基因；12.CF_GLEAN_10017395；13.乙醇脫氫酶5基因；14.黑尿酸酶基因.1.interferon-inducible GTPase 5-like gene;2.XLOC_000762;3.NACHT gene;4.purine nucleosidephosphorylase-like isoform X1 gene;5.complement component C7 gene;6.squalene monooxygenase gene;7.XLOC_022395;8.C-C motif chemokine 17-like gene;9.sialic acid-binding lectin-like gene;10.very long-chain acyl-CoA synthetase-like gene;11.tyrp1 gene;12.CF_GLEAN_10017395;13.adh5 gene;14.hgd gene.

3 討 論

白烏鱧作為我國名貴的經(jīng)濟(jì)魚類，皮膚顏色呈白色或灰白色，這種漂亮的體色常常成為其市場價值的判斷標(biāo)準(zhǔn)。為提供更多遺傳信息推動白烏鱧遺傳育種工作，筆者利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)從分子角度探究烏鱧和白烏鱧的皮膚顏色差異。受外界環(huán)境(光照、溫度和攝食)和自身遺傳學(xué)(基因)等多種因素的影響，體色變異在魚類發(fā)育過程中較為常見[14]，已有研究證明，遺傳因素是魚類體色變化的主要決定性因素，由許多基因構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同控制色素細(xì)胞的發(fā)育和形成，最終影響魚類體色變化[5]。隨著測序技術(shù)的不斷進(jìn)步，學(xué)者們利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)獲得大量測序數(shù)據(jù)，從而可以更深入地從遺傳學(xué)的角度揭示魚類皮膚顏色調(diào)控機(jī)制[12]。

3.1 差異表達(dá)基因分析

劉肖蓮等[15]對透明草金魚(Carassiusauratus)的研究表明，透明草金魚與不透明草金魚皮膚轉(zhuǎn)錄組共存在181條差異表達(dá)基因，主要富集在MAPK通路、嘌呤代謝通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工通路，推測草金魚皮膚透明機(jī)制的調(diào)節(jié)很可能與抑制黑色素形成以及虹彩細(xì)胞中鳥嘌呤合成、色素顆粒轉(zhuǎn)移過程有關(guān)。而史東杰等[16]對三色錦鯉(Cyprinuscarpiokoi)膚色調(diào)控基因的研究表明，采取墨色、紅色、白色部位皮膚樣品測序并兩兩比較，獲得的差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞過程和環(huán)境信息處理通路，說明三色錦鯉的皮膚生長代謝途徑可能與細(xì)胞增殖分化相關(guān)[16]。此外，普通鯉(C.carpio)和金邊鯉(C.carpiovar.jinbian)皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，2475個差異基因主要富集在半胱氨酸代謝途徑、cGMP-PKG信號通路和心肌細(xì)胞途徑，表明這些代謝途徑可能與金邊鯉皮膚顏色變異有關(guān)[17]。然而，通過對同屬鯉屬的甌江彩鯉(C.carpiovar.color)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)影響其皮膚不同顏色的主要代謝通路為嘌呤代謝通路、糖酵解與糖代謝合成通路和氧化磷酸化通路[18]。由此可見，魚類體色形成的機(jī)制十分復(fù)雜，關(guān)于魚類體色沉積的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，相關(guān)研究仍然十分匱乏。白烏鱧是烏鱧的白化變異種[19]，因其體色特殊極具觀賞價值。本研究中，對烏鱧和白烏鱧皮膚組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序得到694個差異表達(dá)基因，結(jié)合上述研究，可以推測這694個差異表達(dá)基因可能參與皮膚顏色的調(diào)控。

3.2 差異表達(dá)基因功能分析

將得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集，發(fā)現(xiàn)其主要與能量代謝、細(xì)胞聯(lián)接及酪氨酸代謝通路有關(guān)，尤其是酪氨酸代謝通路被顯著富集。在脊椎動物中，酪氨酸代謝通路已被證實與黑色素合成相關(guān)[20]。酪氨酸酶(Tyr)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(Tyrp-1)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(Tyrp-2)這3種限制酶是催化真黑色素形成的關(guān)鍵酶，三者協(xié)同調(diào)控合成黑色素[21]。在本研究中，酪氨酸代謝通路上的tyrp1基因表達(dá)量顯著上調(diào)，tyrp1能抑制黑色素細(xì)胞死亡，與魚類體表色素合成緊密相關(guān)。在褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)中也發(fā)現(xiàn)了與本研究結(jié)果類似的結(jié)果，正常褐牙鲆皮膚中tyrp1a基因表達(dá)量遠(yuǎn)高于白化褐牙鲆[22]；tyrp1a、tyrp1b基因為tyrp1基因的同源基因，主要存在于絕大多數(shù)的硬骨魚類中[23]。湖棲鰭蝦虎魚(Gobiopteruslacustris)皮膚轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析顯示，酪氨酸代謝通路上的tyr、tyrp1、tyrp2基因表達(dá)量均顯著下降，這很可能是造成湖棲鰭蝦虎魚皮膚呈透明狀的原因[24]。Zhou等[9]研究指出，烏鱧幼魚皮膚中的與黑色素合成緊密相關(guān)的tyr基因的表達(dá)量均高于白烏鱧幼魚；但在本研究中，成年白烏鱧和成年烏鱧的tyr、tyrp2基因表達(dá)量無顯著變化。tyr基因家族作為調(diào)節(jié)黑色素合成的關(guān)鍵基因，其表達(dá)量在魚的不同生長階段存在顯著差異，這可能是幼魚的色素模式逐漸向成魚的色素模式過渡所導(dǎo)致的[25]。類似的研究結(jié)果在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和金鱒(黃色突變型虹鱒)中也有報道，虹鱒的tyr基因的表達(dá)量在早期發(fā)育階段顯著高于金鱒，然而在12月齡時虹鱒和金鱒tyr基因的表達(dá)量無顯著差異[26]。tyr基因是影響魚類皮膚白化的關(guān)鍵基因，但對魚類皮膚白化調(diào)控的分子機(jī)制存在種間特異性[27]。

因此，本研究中烏鱧皮膚白化機(jī)制中很可能存在其他調(diào)節(jié)色素沉著的因素，而tyr、tyrp2基因可能不是影響其色素沉著的關(guān)鍵基因。已有研究表明，皮膚中的黑色素沉著還與黑色素小體形成、黑色素小體轉(zhuǎn)運等因素密切相關(guān)，大量載有黑色素的黑色素小體被轉(zhuǎn)運至鄰近的皮膚角質(zhì)細(xì)胞，使黑色素最終在皮膚角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)沉積[28]。在對虹鱒皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的研究中發(fā)現(xiàn)，虹鱒皮膚上的黑色斑點區(qū)域差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞聯(lián)接進(jìn)程上，如細(xì)胞黏附分子通路[29]。這一研究結(jié)果與本研究結(jié)果相同，表明在烏鱧中細(xì)胞黏附分子通路上的差異表達(dá)基因表達(dá)量上調(diào)也可能是影響真皮層黑色素細(xì)胞沉積的關(guān)鍵因素之一。然而，在本研究中，酪氨酸代謝通路上的adh5和hgd基因表達(dá)量同樣也出現(xiàn)顯著上調(diào)。乙醇脫氫酶是參與機(jī)體乙醇代謝的重要酶，已在人體上鑒定出5種，adh5基因編碼乙醇脫氫酶5[30]。哺乳動物相關(guān)研究表明，乙醇脫氫酶不僅參與乙醇代謝，還參與腎上腺素、多巴胺、脂肪酸等物質(zhì)的代謝[31]，而其對黑色素合成的影響還未在其他物種中報道。hgd基因編碼尿黑酸酶，尿黑酸酶可以降解苯丙氨酸和酪氨酸分子[32]。

3.3 單核苷酸多態(tài)性、插入缺失標(biāo)記分析

在對烏鱧和白烏鱧皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)突變位點分析中，共在6578個基因里找到18 767個單核苷酸多態(tài)性位點，針對酪氨酸代謝通路上的差異表達(dá)基因，筆者通過與烏鱧全基因組比對，經(jīng)過單核苷酸多態(tài)性位點預(yù)測，在hgd和adh5基因上發(fā)現(xiàn)了錯義突變，而與黑色素合成緊密相關(guān)的tyr基因在兩種魚中無顯著差異。有研究報道，魚類的白化可能受一個或多個基因影響，不同物種間存在差異[33]。研究表明：hps4基因上內(nèi)含子2和外顯子3交界處99 bp片段缺失可能導(dǎo)致斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)白化[34]；不僅tyrp1a基因發(fā)生突變可導(dǎo)致斑馬魚(Daniorerio)黑色素細(xì)胞死亡[35]，oca2基因突變也可造成斑馬魚白化[36]；對斑馬魚胚胎的研究表明，單獨敲除tyrp1的1個等位基因并不會造成色素缺失，而同時敲除2個等位基因，導(dǎo)致嚴(yán)重黑色素缺失[23]；oca2和mclr基因的突變都可能改變麗脂鯉(Astyanax)的體色[37-38]；有學(xué)者利用轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，與體色緊密相關(guān)的差異基因在野生型黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)和白化型黃顙魚皮膚中的表達(dá)量差異顯著，而單核苷酸多態(tài)性、插入缺失標(biāo)記分析未發(fā)現(xiàn)可能導(dǎo)致白化的突變位點[39]。因此結(jié)合本研究結(jié)果和已有報道可以推測，烏鱧白化并不是由某一個基因突變或某一個基因的表達(dá)量減少造成的，而主要由兩種機(jī)制共同進(jìn)行調(diào)控：(1)hgd和adh5基因上單核苷酸多態(tài)性產(chǎn)生錯義突變導(dǎo)致黑色素沉著缺乏；(2)酪氨酸代謝通路中的差異基因在白烏鱧皮膚中表達(dá)量下降，導(dǎo)致黑色素沉著量降低。

4 結(jié) 論

筆者從分子角度對烏鱧的白化機(jī)制進(jìn)行解釋，通過高通量測序技術(shù)對烏鱧與白烏鱧皮膚組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出694個差異表達(dá)基因，通過功能注釋發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要富集在酪氨酸通路上。此外，分析單核苷酸多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，位于酪氨酸通路上的hgd和adh5基因產(chǎn)生錯義突變，這可為烏鱧后續(xù)的多態(tài)性檢測、群體遺傳多樣性分析等奠定基礎(chǔ)，但有關(guān)遺傳機(jī)制的細(xì)節(jié)還有待進(jìn)一步的研究。