• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    阿格列汀通過miR-497-5p/GPLD1信號通路抑制高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞纖維化的研究

    2022-09-21 11:43:40楊俊靜趙艷榮
    關(guān)鍵詞:阿格列汀高糖

    常 楊,楊俊靜,趙艷榮

    (河北省秦皇島市第二醫(yī)院血液內(nèi)分泌科,河北 秦皇島 066600)

    糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是由糖尿病引起的一種可導(dǎo)致心力衰竭的心肌病,主要病理特征為心肌纖維化引起的系列心功能不全[1]。糖尿病患者發(fā)生心力衰竭的概率在16%~29%,其病死率呈逐年上升趨勢[2]。因?yàn)镈CM的病理生理機(jī)制并未完全清楚,針對該病缺少有效的靶向藥物。格列汀類藥物是目前針對該病的一類臨床高效治療藥物,阿格列汀是其中一種新開發(fā)的藥物,2012年在日本被批準(zhǔn)用于患者[3]。阿格列汀是一種氨基酸酰胺,對二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4,DPP-4)具有長期有效的抑制作用。DPP-4抑制劑通過增強(qiáng)β細(xì)胞的胰島素分泌,抑制腸促胰島素激素的降解,降低高血糖[4]。據(jù)報(bào)道,阿格列汀通過抑制DPP-4對核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)的激活,發(fā)揮對巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和小鼠肝臟的抗炎活性[5]。但是其對DCM患者心肌纖維化的過程是否具有調(diào)控作用,及其發(fā)揮作用的機(jī)制均尚未有人研究。微小核糖核苷酸(microribonucleotide,miRNA)是長度在18~25個核苷酸之間的內(nèi)源性保守穩(wěn)定的單鏈非編碼RNA,其通過阻滯靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程抑制靶基因表達(dá)而參與人類疾病的調(diào)控[6]。miR-497-5p是最近新發(fā)現(xiàn)的一種參與DCM發(fā)展的關(guān)鍵miRNA[7],但是其是否與阿格列汀的治療功能有關(guān)尚未可知。本研究擬以高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞MCFs為研究對象,觀察阿格列汀、miR-497-5p對MCFs細(xì)胞纖維化的作用,揭示阿格列汀通過上調(diào)miR-497-5p抑制其靶基因糖基磷脂酰肌醇特異性磷脂酶D(glycosylphosphatidylinositol specific phospholipase D,GPLD1)發(fā)揮抗纖維化的功效,為阿格列汀的臨床推廣提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1材料 小鼠心肌成纖維細(xì)胞(mouse cardiac fibroblasts,MCFs)購自北京北納生物公司;RPMI-1640購自美國Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購自杭州四季青公司;阿格列汀(國藥準(zhǔn)字:H20130548;生產(chǎn)批號:121105)購自日本武田公司;RIPA裂解液購自(碧云天生物技術(shù)有限公司);兔抗α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)單克隆抗體、兔抗膠原Ⅰ(collagenⅠ,ColⅠ)多克隆抗體、兔抗ColⅢ單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自上海艾博抗公司;RT-qPCR試劑盒購自日本Takera公司;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自上海碧云天研究所。

    1.2方法

    1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng) 使用90%的RPMI-1640+10%的FBS細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)MCFs細(xì)胞,置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2 d更換一次培養(yǎng)液。

    1.2.2分組與處理 正常培養(yǎng)的MCFs細(xì)胞隨機(jī)分為NG組(5.50 mmol/L葡萄糖)、HG組(25.00 mmol/L葡萄糖),使用5.50、25.00 mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)MCFs。將HG組細(xì)胞分為阿格列汀低劑量(0.05 μmol/L)組、阿格列汀中劑量(0.10 μmol/L)組、阿格列汀高劑量(0.20 μmol/L)組,篩選0.10 μmol/L阿格列汀處理6 h的HG組細(xì)胞標(biāo)記為阿格列汀最適濃度。使用LipofectamineTM3000將mimics-NC組(轉(zhuǎn)染mimics-NC)、miR-497-5p組(轉(zhuǎn)染miR-497-5p)、anti-NC組(轉(zhuǎn)染anti-NC)、anti-miR-497-5p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-497-5p)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-GPLD1組(轉(zhuǎn)染si-GPLD1)、阿格列汀+mimics-NC組(轉(zhuǎn)染mimics-NC)、阿格列汀+miR-497-5p組(轉(zhuǎn)染miR-497-5p)、阿格列汀+miR-497-5p+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-497-5p和pcDNA)、阿格列汀+miR-497-5p+pcDNA-GPLD1組(共轉(zhuǎn)染miR-497-5p和pcDNA-GPLD1)轉(zhuǎn)染至MCFs細(xì)胞,轉(zhuǎn)染12 h后更換新培養(yǎng)液,再用25.00 mmol/L葡萄糖(處理48 h)或0.10 μmol/L的阿格列汀(處理6 h)培養(yǎng)。RT-qPCR法鑒定轉(zhuǎn)染的效率,確定轉(zhuǎn)染成功后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.3WB實(shí)驗(yàn) 收集需要檢測的各組細(xì)胞,將細(xì)胞使用RIPA裂解液冰上充分裂解30 min。提取總蛋白,定量變性。使用變性后的上清液進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳,將蛋白沉積在瓊脂凝膠上。通過轉(zhuǎn)膜儀將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜,整個轉(zhuǎn)膜過程需在0 ℃低溫環(huán)境下操作完成。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜用2.5%的脫脂奶粉37 ℃封閉2 h。封閉結(jié)束后,洗膜,轉(zhuǎn)移至稀釋過的一抗溶液(兔抗α-SMA單克隆抗體1∶1 000、兔抗ColⅠ多克隆抗體1∶800、兔抗ColⅢ單克隆抗體1∶1 000)中,4 ℃冰箱中孵育過夜。取出膜充分清洗,再轉(zhuǎn)移至稀釋過的二抗溶液(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔1∶500)中,37 ℃孵育1.5 h。結(jié)束后使用ECL電化學(xué)發(fā)光試劑盒對膜顯影、定影。Image J分析條帶灰度值,確定目的蛋白的相對表達(dá)量。

    1.2.4RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 收集待檢測的各組細(xì)胞,使用Trizol液提取細(xì)胞的總RNA,并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其合成cDNA,作為模板。使用qPCR試劑盒檢測上述cDNA中miR-497-5p、GPLD1的表達(dá)。以U6、GAPDH為內(nèi)參,2-△△Ct法計(jì)算miR-497-5p、GPLD1的相對表達(dá)量。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃,8 min;95 ℃,30 min;59 ℃,30 s;72 ℃,30 s;72 ℃,5 min,41個循環(huán)。引物序列為(5′-3′):miR-497-5p:上游引物:CCTTCAGCAGCACACTGTGG下游引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT。GPLD1:上游引物:GGTGGGCTCCGAGCAT;下游引物:GCACCTTTGTAGGTGAGCAG。U6:上游引物:CTCGCTTCGGCAGCACA;下游引物:AACGCTTCACGAATTTGCGT。GAPDH:上游引物:TGACTTCAACAGCGACACCCA;下游引物:CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。

    1.2.5雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn) 使用生物信息在線預(yù)測網(wǎng)站Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn)預(yù)測miR-497-5p的靶基因,發(fā)現(xiàn)GPLD1與miR-497-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建含有GPLD1-WT(含GPLD1 3′UTR-WT)和GPLD1-MUT(含GPLD1 3′UTR-MUT)的psiCHECK2熒光報(bào)告載體,將其分別與miR-NC、miR-497-5p、anti-miR-NC、anti-miR-497-5p共轉(zhuǎn)染。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測上述細(xì)胞的熒光活性。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.1統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較使用單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1阿格列汀對高糖誘導(dǎo)MCFs纖維化的調(diào)控 與NG組相比,HG組MCFs中α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05);與HG組相比,阿格列汀中劑量組、阿格列汀高劑量組細(xì)胞中α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見表1,圖1。

    圖1 不同濃度阿格列汀處理的高糖誘導(dǎo)MCFs纖維化標(biāo)志的蛋白圖

    表1 不同濃度阿格列汀處理的高糖誘導(dǎo)MCFs纖維化標(biāo)志的表達(dá)

    2.2阿格列汀對高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞miR-497-5p表達(dá)的調(diào)控 與NG組相比,HG組MCFsmiR-497-5p表達(dá)顯著降低(P<0.05);與HG組相比,阿格列汀中劑量組、阿格列汀高劑量組miR-497-5p表達(dá)顯著升高(P<0.05),見表2。

    表2 阿格列汀調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的MCFs細(xì)胞中miR-497-5p表達(dá)

    2.3過表達(dá)miR-497-5p調(diào)控高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞纖維化 與mimics-NC組相比,miR-497-5p組細(xì)胞中miR-497-5p表達(dá)顯著升高,α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3,圖2。

    表3 過表達(dá)miR-497-5p的高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞的纖維化標(biāo)志的表達(dá)

    圖2 過表達(dá)miR-497-5p的高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞纖維化標(biāo)志蛋白圖

    2.4miR-497-5p靶向GPLD1 Starbase軟件(http://starbase.sysu.edu.cn)預(yù)測到miR-497-5p與GPLD1之間存在連續(xù)的7個互補(bǔ)的核苷酸序列,見圖3A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示,與mimics-NC組相比,miR-497-5p組GPLD1-WT細(xì)胞的熒光活性顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4;與mimics-NC組相比,miR-497-5p組細(xì)胞GPLD1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),與anti-NC組相比,anti-miR-497-5p組細(xì)胞GPLD1蛋白表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3B,表5。

    表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    圖3 miR-497-5p調(diào)控GPLD1

    表5 miR-497-5p負(fù)向調(diào)控GPLD1表達(dá)

    2.5敲減GPLD1調(diào)控高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞的纖維化 與si-NC組相比,si-GPLD1組細(xì)胞GPLD1表達(dá)顯著降低,α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6,圖4。

    圖4 敲減GPLD1的高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞的纖維化標(biāo)志的蛋白圖

    表6 敲減GPLD1的高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞的纖維化指標(biāo)

    2.6過表達(dá)GPLD1對阿格列汀、miR-497-5p抑制高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞纖維化的影響 與阿格列汀+mimics-NC組相比,阿格列汀+miR-497-5p組細(xì)胞miR-497-5p表達(dá)顯著升高,α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與阿格列汀+miR-497-5p+pcDNA組相比,阿格列汀+miR-497-5p+pcDNA-GPLD1組細(xì)胞中miR-497-5p表達(dá)顯著降低,α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表7,圖5。

    表7 過表達(dá)GPLD1調(diào)節(jié)阿格列汀、miR-497-5p處理的高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞纖維化標(biāo)志蛋白

    圖5 過表達(dá)GPLD1調(diào)節(jié)阿格列汀、miR-497-5p處理的高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞纖維化標(biāo)志蛋白的表達(dá)

    3 討 論

    DPP-4抑制劑也稱格列汀類藥物,已通過直接給藥或與其他降糖藥物聯(lián)合用藥的方式廣泛用于臨床治療2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)[8],但其在DCM中作用的分子機(jī)制仍不清楚。Soare等[9]報(bào)道,在系統(tǒng)性硬化癥患者的纖維化皮膚中,DPP-4的表達(dá)和DPP-4陽性成纖維細(xì)胞的數(shù)量以轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)依賴的方式增加,DPP-4的過度表達(dá)促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的激活,而DPP-4的藥物抑制或基因失活可通過干擾TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信號活性而減少成纖維細(xì)胞的增殖、遷移及膠原的分泌,揭示DPP-4抑制劑可發(fā)揮有效的抗纖維化作用。Ma等[10]在DCM的研究中報(bào)道,H9C2細(xì)胞的缺氧處理可誘導(dǎo)DPP-4的異常升高,而DPP-4抑制劑阿格列汀能夠明顯的抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和促炎因子白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)的分泌及氧化應(yīng)激反應(yīng),揭示阿格列汀具有降低血糖、保護(hù)心肌細(xì)胞的雙重功能。高糖環(huán)境下,心肌過度表達(dá)蛋白激酶C,鈣調(diào)節(jié)異常,最先出現(xiàn)左心室肥厚,舒縮功能障礙,導(dǎo)致心肌壞死和多發(fā)性纖維變性[11]。于是,推測阿格列汀能夠抑制DCM心肌纖維化。為了探究阿格列汀對DCM心肌纖維化的作用,本研究檢測了不同濃度阿格列汀處理的高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞的纖維化標(biāo)志基因α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),中高濃度的阿格列汀(0.10、0.20 μmol/L)能夠明顯的抑制高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞α-SMA、ColⅠ和ColⅢ蛋白表達(dá)的升高。此結(jié)果揭示了阿格列汀還具有抑制DCM心肌纖維化的功能,暗示阿格列汀的臨床治療價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),阿格列汀能夠明顯的升高miR-497-5p在高糖誘導(dǎo)的MCFs細(xì)胞中的表達(dá)水平,猜測miR-497-5p表達(dá)的升高可能與阿格列汀的抑制DCM心肌纖維化有關(guān)。

    miR-497-5p位于17號染色體,通過調(diào)節(jié)SMAD家族成員3、TGF-β1參與心肌纖維化過程[12-14]。Chen等[7]在DCM的研究中報(bào)道,miR-497-5p作為長非編碼RNA X-非活性特異轉(zhuǎn)錄物(X inactive specific transcription factor,XIST)的特異性結(jié)合因子調(diào)控糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)/晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)信號通路的活性進(jìn)而參與DCM的心臟損傷過程。近期,Wang等[15]在研究中報(bào)道,miR-497在糖尿病腎病組織、高糖誘導(dǎo)的人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞HK-2中的表達(dá)均顯著降低,并且高表達(dá)的硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin-interactingprotein,TXNIP)能夠結(jié)合miR-497,過表達(dá)miR-497可明顯的抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出、TXNIP/核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域,富含亮氨酸重復(fù)序列和含Pyrin結(jié)構(gòu)域3(Nucleotide-binding oligomerization domain, leucine-rich repeat and pyrin domain-containing 3,NLRP3)/含半胱氨酸的天冬氨酸 蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase1,caspase-1)激活以及IL-1β和IL-18分泌的升高,說明miR-497在糖尿病治療中發(fā)揮積極的有利功效。本研究結(jié)果顯示,miR-497-5p在高糖誘導(dǎo)的MCFs細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),并且過表達(dá)miR-497-5p能夠顯著的抑制高糖對MCFs細(xì)胞中α-SMA、ColⅠ和ColⅢ蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用。重要的是,研究還通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-497-5p能夠直接靶向負(fù)調(diào)控GPLD1的表達(dá)水平,這可能與miR-497-5p的抑制高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞的纖維化功能存在一定聯(lián)系。

    GPLD1基因位于6號染色體上,由25個外顯子組成,曾被指定為胰腺型,是人類唯一的GPLD1基因,該基因失調(diào)與胰腺和胃部腫瘤惡化相關(guān)[16]。GPLD1與胰島之間的密切關(guān)系可能是DCM纖維化的原因之一。Qin等[17]報(bào)道,GPLD1在成人潛伏性自身免疫性糖尿病(latent autoimmune diabetes in adults,LADA)、1型糖尿病(type 1 diabetes,T1DM)患者血漿中的表達(dá)顯著高于正常人、T2DM患者,受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)分析揭示GPLD1可作為診斷LADA和T2DM的潛在候選血漿蛋白。Zhang等[18]發(fā)現(xiàn),高胰島素血癥、糖耐量減低和T2DM患者血清中脂肪組織胰島素抵抗相關(guān)的磷脂酰肌醇蛋白聚糖4(glypican,GPC4)含量明顯升高,而GPLD1是GPC4的關(guān)鍵因子,與GPC4的含量呈正相關(guān)。于是猜測,GPLD1可能也與DCM存在聯(lián)系,進(jìn)而接受阿格列汀、miR-497-5p的調(diào)控。本研究檢測了敲減GPLD1的高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞的纖維化指標(biāo)發(fā)現(xiàn),敲減GPLD1具有與過表達(dá)miR-497-5p相似的抑制α-SMA、ColⅠ和ColⅢ蛋白表達(dá)的作用。過表達(dá)GPLD1能夠明顯的削弱阿格列汀和過表達(dá)miR-497-5p對α-SMA、ColⅠ、ColⅢ蛋白表達(dá)的抑制作用,說明過表達(dá)GPLD1可逆轉(zhuǎn)阿格列汀或過表達(dá)miR-497-5p高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞纖維化的抑制作用。

    綜上所述,阿格列汀抑制高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的纖維化,產(chǎn)生這種作用的機(jī)制與促進(jìn)miR-497-5p進(jìn)而抑制GPLD1表達(dá)緊密相關(guān),為阿格列汀治療糖尿病心肌病提供支持。

    猜你喜歡
    阿格列汀高糖
    窮小子競標(biāo)
    阿格戒酒
    葛根素對高糖誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:04
    丹紅注射液對高糖引起腹膜間皮細(xì)胞損傷的作用
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:18:21
    西格列汀對肥胖合并脂肪肝大鼠的干預(yù)療效
    HPLC法測定維格列汀片中主藥的含量
    實(shí)習(xí)偵探
    百變的老鼠阿格
    肥胖2型糖尿病采用西格列汀聯(lián)合二甲雙胍治療的臨床價(jià)值探析
    維格列汀聯(lián)合二甲雙胍治療肥胖型2型糖尿病160例療效探討
    av片东京热男人的天堂| 国产一区在线观看成人免费| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 啪啪无遮挡十八禁网站| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产精品永久免费网站| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产午夜福利久久久久久| 国产高清激情床上av| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲人成电影免费在线| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美一级毛片孕妇| 欧美成人免费av一区二区三区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久久久精品国产欧美久久久| 在线看三级毛片| 久久香蕉激情| 国产成人av教育| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久人妻av系列| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 精品人妻1区二区| 国产午夜精品久久久久久| 国模一区二区三区四区视频 | e午夜精品久久久久久久| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 日本成人三级电影网站| 一进一出好大好爽视频| 最近最新免费中文字幕在线| 国产高清videossex| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 99国产极品粉嫩在线观看| av有码第一页| aaaaa片日本免费| 一级毛片高清免费大全| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲国产欧美人成| 久久久久性生活片| 特级一级黄色大片| 婷婷六月久久综合丁香| 十八禁人妻一区二区| 国产久久久一区二区三区| 深夜精品福利| 夜夜爽天天搞| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲一区二区三区不卡视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久草成人影院| 国产午夜精品论理片| ponron亚洲| 长腿黑丝高跟| 美女 人体艺术 gogo| 看片在线看免费视频| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 精品熟女少妇八av免费久了| 9191精品国产免费久久| 午夜福利在线在线| 一个人免费在线观看电影 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产不卡一卡二| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲美女视频黄频| 欧美午夜高清在线| 国产91精品成人一区二区三区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲国产看品久久| 在线免费观看的www视频| 黄色视频不卡| 51午夜福利影视在线观看| 十八禁人妻一区二区| e午夜精品久久久久久久| 久久久久精品国产欧美久久久| 怎么达到女性高潮| 香蕉久久夜色| 午夜两性在线视频| 亚洲精品在线观看二区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 淫秽高清视频在线观看| 1024视频免费在线观看| 久99久视频精品免费| 中文在线观看免费www的网站 | 一个人免费在线观看电影 | 一本久久中文字幕| 精品欧美国产一区二区三| 久久这里只有精品19| 成人亚洲精品av一区二区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 黄色毛片三级朝国网站| 午夜激情av网站| 999久久久国产精品视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲国产欧美人成| 国产成人精品久久二区二区91| 精品欧美国产一区二区三| 人妻久久中文字幕网| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 香蕉久久夜色| 999精品在线视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 中文字幕熟女人妻在线| 久久久久九九精品影院| 真人做人爱边吃奶动态| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美成人性av电影在线观看| 久久人妻av系列| 午夜视频精品福利| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产片内射在线| 欧美日韩黄片免| 亚洲精品粉嫩美女一区| 婷婷丁香在线五月| 国产一区二区三区视频了| 九色成人免费人妻av| 亚洲人成电影免费在线| 国产精品国产高清国产av| 两个人免费观看高清视频| 禁无遮挡网站| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 香蕉国产在线看| 久久 成人 亚洲| 久久人人精品亚洲av| 大型av网站在线播放| 色尼玛亚洲综合影院| 国产一区二区三区视频了| 久久久久久大精品| 级片在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| cao死你这个sao货| 亚洲第一电影网av| 久久精品国产综合久久久| 成年版毛片免费区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 亚洲 国产 在线| 精品人妻1区二区| 丰满人妻一区二区三区视频av | 校园春色视频在线观看| 精品高清国产在线一区| 老汉色∧v一级毛片| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产伦人伦偷精品视频| 在线观看日韩欧美| 成人18禁在线播放| 欧美日本视频| 日韩欧美 国产精品| 在线观看一区二区三区| 国产精品av久久久久免费| 日本一区二区免费在线视频| 国产人伦9x9x在线观看| 无限看片的www在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲精品在线观看二区| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲国产欧美一区二区综合| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 国产免费av片在线观看野外av| 精品国产乱码久久久久久男人| 成人手机av| 欧美日韩一级在线毛片| 精品午夜福利视频在线观看一区| 真人做人爱边吃奶动态| 久热爱精品视频在线9| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 免费在线观看黄色视频的| 高清在线国产一区| 99国产精品一区二区三区| 男女午夜视频在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 免费看十八禁软件| 欧美成人免费av一区二区三区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 一区二区三区高清视频在线| 精品乱码久久久久久99久播| 老鸭窝网址在线观看| 性欧美人与动物交配| 手机成人av网站| 亚洲男人天堂网一区| 久久这里只有精品19| 国产精品98久久久久久宅男小说| or卡值多少钱| 午夜久久久久精精品| 999久久久国产精品视频| 国产成人精品久久二区二区91| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产真实乱freesex| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 成人三级做爰电影| 黄色 视频免费看| 亚洲av第一区精品v没综合| 男女那种视频在线观看| 国产一区二区在线观看日韩 | 婷婷六月久久综合丁香| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 婷婷精品国产亚洲av| 久久精品影院6| 特大巨黑吊av在线直播| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 免费看美女性在线毛片视频| 久9热在线精品视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 一级a爱片免费观看的视频| 国产一区二区激情短视频| 两个人视频免费观看高清| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲成av人片在线播放无| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲七黄色美女视频| 国内精品久久久久精免费| 久久久国产欧美日韩av| av福利片在线| 亚洲电影在线观看av| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 正在播放国产对白刺激| 国产在线观看jvid| 无人区码免费观看不卡| 三级国产精品欧美在线观看 | 免费在线观看黄色视频的| 精品福利观看| 日本免费a在线| 免费观看精品视频网站| 丰满的人妻完整版| 校园春色视频在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 青草久久国产| 麻豆成人av在线观看| 99国产综合亚洲精品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 午夜福利18| 好男人在线观看高清免费视频| 欧美性长视频在线观看| 久久久久久大精品| 啦啦啦观看免费观看视频高清| av国产免费在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产精品电影一区二区三区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 成人国语在线视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲人成电影免费在线| 国产一区二区三区视频了| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产一区二区激情短视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲成人精品中文字幕电影| 精品一区二区三区四区五区乱码| 午夜视频精品福利| 香蕉国产在线看| 成年版毛片免费区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 免费一级毛片在线播放高清视频| 免费在线观看完整版高清| 特大巨黑吊av在线直播| 最好的美女福利视频网| 亚洲成人久久爱视频| 欧美成人午夜精品| 最近最新免费中文字幕在线| 曰老女人黄片| 性色av乱码一区二区三区2| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产乱人伦免费视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 日日爽夜夜爽网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美中文日本在线观看视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产精品 国内视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲成人中文字幕在线播放| 两个人视频免费观看高清| 色尼玛亚洲综合影院| 老司机深夜福利视频在线观看| 999精品在线视频| 日韩欧美三级三区| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 成人国语在线视频| 麻豆成人av在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲专区字幕在线| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产精品 国内视频| 无限看片的www在线观看| 99久久精品热视频| 91国产中文字幕| 91九色精品人成在线观看| 欧美在线黄色| 一边摸一边抽搐一进一小说| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 色综合亚洲欧美另类图片| tocl精华| 特级一级黄色大片| 久久亚洲精品不卡| 免费看十八禁软件| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲 国产 在线| 亚洲七黄色美女视频| 观看免费一级毛片| 大型黄色视频在线免费观看| 91av网站免费观看| 欧美中文综合在线视频| 亚洲中文字幕日韩| 久久久久久国产a免费观看| 国产亚洲欧美98| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 真人做人爱边吃奶动态| avwww免费| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 最新在线观看一区二区三区| 神马国产精品三级电影在线观看 | 中文字幕人成人乱码亚洲影| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲乱码一区二区免费版| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美成狂野欧美在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲精品色激情综合| 国产成人aa在线观看| 日本成人三级电影网站| 亚洲九九香蕉| 国内精品久久久久精免费| av国产免费在线观看| 国产av又大| 又黄又爽又免费观看的视频| 波多野结衣高清作品| 桃色一区二区三区在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 嫩草影院精品99| xxx96com| av欧美777| 亚洲五月婷婷丁香| 国产在线精品亚洲第一网站| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲中文av在线| 一级毛片女人18水好多| 日韩精品青青久久久久久| 99国产综合亚洲精品| 成人三级做爰电影| 婷婷精品国产亚洲av| 在线免费观看的www视频| 日韩有码中文字幕| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲,欧美精品.| x7x7x7水蜜桃| 亚洲专区国产一区二区| 91av网站免费观看| 日本三级黄在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 成熟少妇高潮喷水视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲人成77777在线视频| 国产高清videossex| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 91老司机精品| av国产免费在线观看| 国产区一区二久久| 亚洲全国av大片| 久久午夜亚洲精品久久| 精品不卡国产一区二区三区| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 性色av乱码一区二区三区2| 国产在线精品亚洲第一网站| 男女午夜视频在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 午夜亚洲福利在线播放| 国产69精品久久久久777片 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 老司机在亚洲福利影院| 午夜福利免费观看在线| www.www免费av| 成人精品一区二区免费| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产免费av片在线观看野外av| 一级作爱视频免费观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 天堂动漫精品| 人妻久久中文字幕网| 久久婷婷成人综合色麻豆| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 在线播放国产精品三级| 亚洲成人免费电影在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品久久久久久久电影 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 日韩欧美免费精品| 欧美一级a爱片免费观看看 | 一进一出抽搐动态| 成人国产综合亚洲| 亚洲精品美女久久av网站| 中文在线观看免费www的网站 | 免费在线观看成人毛片| 日本免费一区二区三区高清不卡| tocl精华| 国产精品亚洲一级av第二区| videosex国产| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 美女大奶头视频| 久久久久性生活片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 精品高清国产在线一区| 他把我摸到了高潮在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 日韩欧美精品v在线| 很黄的视频免费| 亚洲国产高清在线一区二区三| 欧美成人性av电影在线观看| 看片在线看免费视频| 国产成年人精品一区二区| 日韩欧美国产在线观看| 午夜福利欧美成人| 国产69精品久久久久777片 | 午夜a级毛片| 精品午夜福利视频在线观看一区| 99国产极品粉嫩在线观看| 99久久国产精品久久久| 国产精品久久久久久久电影 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 男插女下体视频免费在线播放| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品九九99| 欧美丝袜亚洲另类 | 青草久久国产| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲无线在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 黄片小视频在线播放| 久久午夜综合久久蜜桃| av欧美777| 成人三级做爰电影| 国产av一区二区精品久久| 又爽又黄无遮挡网站| 日韩免费av在线播放| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久香蕉精品热| 18禁美女被吸乳视频| 日韩欧美国产在线观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲一区高清亚洲精品| 2021天堂中文幕一二区在线观| 给我免费播放毛片高清在线观看| 不卡一级毛片| 国产成人影院久久av| 欧美不卡视频在线免费观看 | 人人妻人人看人人澡| 亚洲激情在线av| 精品午夜福利视频在线观看一区| 精品人妻1区二区| 黄色片一级片一级黄色片| 欧美日韩黄片免| 给我免费播放毛片高清在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久亚洲真实| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 黄频高清免费视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 91大片在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久性视频一级片| av天堂在线播放| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产免费男女视频| 成人手机av| 午夜影院日韩av| 天堂影院成人在线观看| 九九热线精品视视频播放| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 成人手机av| 亚洲美女黄片视频| 久久热在线av| 91av网站免费观看| 日本黄色视频三级网站网址| 最新在线观看一区二区三区| 美女黄网站色视频| 国产午夜精品论理片| 99riav亚洲国产免费| 久久久久亚洲av毛片大全| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品日韩av在线免费观看| 99国产精品一区二区三区| 亚洲成av人片免费观看| 美女大奶头视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美黄色淫秽网站| 88av欧美| 亚洲专区字幕在线| 香蕉国产在线看| 美女大奶头视频| 久久久精品大字幕| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲精品中文字幕在线视频| 女人被狂操c到高潮| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 一夜夜www| 久久久久久免费高清国产稀缺| 女人被狂操c到高潮| 国产成年人精品一区二区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| tocl精华| 国产又色又爽无遮挡免费看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 岛国在线免费视频观看| 少妇粗大呻吟视频| 国产精品久久电影中文字幕| videosex国产| 小说图片视频综合网站| 桃色一区二区三区在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av | 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲精品av麻豆狂野| 天天添夜夜摸| 精品国产乱码久久久久久男人| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲人成77777在线视频| 91在线观看av| 亚洲七黄色美女视频| 国产乱人伦免费视频| 男插女下体视频免费在线播放| 男人舔女人的私密视频| 精品久久蜜臀av无| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 制服丝袜大香蕉在线| 在线观看免费视频日本深夜| av福利片在线| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 制服人妻中文乱码| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲精品久久国产高清桃花| ponron亚洲| 精品久久蜜臀av无| 在线免费观看的www视频| 亚洲国产欧美网| 亚洲av熟女| 欧美三级亚洲精品| 久久久久性生活片| 国产精品av视频在线免费观看| 窝窝影院91人妻| 极品教师在线免费播放| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久九九热精品免费| av中文乱码字幕在线| www.熟女人妻精品国产| 日韩三级视频一区二区三区| 色综合婷婷激情| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲国产高清在线一区二区三| 三级毛片av免费| 亚洲欧美日韩无卡精品| 法律面前人人平等表现在哪些方面| www.999成人在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 麻豆av在线久日| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产精品亚洲一级av第二区| 1024手机看黄色片| 亚洲成人久久性| 99久久国产精品久久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产高清视频在线观看网站| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产麻豆成人av免费视频| 美女免费视频网站| 日韩欧美国产在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久久久久九九精品二区国产 | 一个人免费在线观看的高清视频|