三葉青突變體的理化成分評(píng)價(jià)與分子鑒定

董云哲 金澤蘭 林宏峻 沈曉霞 高志偉 周志丹 王忠華,*

(1 浙江萬里學(xué)院生物技術(shù)研究所，浙江 寧波 315100；2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 311402；3 杭州中澤生物科技有限公司，浙江 杭州 310023)

三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)，又名蛇附子、金線吊葫蘆、石老鼠等，為葡萄科崖爬藤屬多年生常綠草質(zhì)蔓生藤本植物，廣泛分布于我國中部、東部、南部諸省[1-3]。三葉青自明代《本草綱目》首次記載[4]以來，被廣泛用于清熱、解毒、消炎、止痛、驚厥、肺炎、肝炎、腦膜炎、蛇蟲叮咬[5]等病癥；近年來，其在抗炎[6]、抗氧化[7]、抗癌[7-11]等方面的作用被不斷驗(yàn)證；三葉青中多糖[8,12]、黃酮[13]、酚酸[4]、礦物質(zhì)、氨基酸等藥理成分對(duì)細(xì)胞[8,10]、機(jī)體[14-15]的作用機(jī)制已被逐步闡明，尤其為癌癥治療提供了新的視野與研究方向[16-17]。然而，目前三葉青的種質(zhì)資源大部分來自野生或地方種，種質(zhì)資源匱乏問題已成為三葉青產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸之一。因此，近年來雜交、快繁、突變、轉(zhuǎn)錄代謝等多種種質(zhì)研究技術(shù)被不斷應(yīng)用到三葉青優(yōu)良種質(zhì)培育的研究中，且取得了一定進(jìn)展[18]。同時(shí)，杭州中澤生物科技有限公司、浙江大學(xué)等單位使用60Co-γ輻射育種技術(shù)，以新選育的三葉青新品種澤青1號(hào)為親本進(jìn)行誘變育種，獲得了一批突變體，為三葉青新品種選育提供了資源條件。

目前，前人關(guān)于三葉青分子鑒定或親緣遺傳的研究以不同品種三葉青居多[19-25]，在品種選育、遺傳、進(jìn)化的研究上具有一定限制性，使其研究范圍只能局限在生物分類學(xué)的種及以上層級(jí)中，對(duì)種內(nèi)優(yōu)良品種的選育貢獻(xiàn)度有限，對(duì)種內(nèi)品種選育、進(jìn)化分析參考價(jià)值同樣具有局限性。因此本試驗(yàn)所用的三葉青突變體為60Co-γ射線處理澤青1號(hào)得到，彌補(bǔ)了上述前人所選材料的不足，使得本研究兼具科研和商業(yè)價(jià)值。此外，多數(shù)前人研究中僅以總酮含量為不同品種三葉青的差異指標(biāo)，缺乏其他指標(biāo)的對(duì)比，其試驗(yàn)結(jié)果說服力有限。鑒于此，本試驗(yàn)以澤青1號(hào)突變體為研究對(duì)象，采用現(xiàn)代分析技術(shù)進(jìn)行多糖、總酮、礦物質(zhì)、氨基酸等多種藥效成分的檢測，以期明確這些突變體的育種利用價(jià)值，綜合篩選適宜商業(yè)種植的品系，為三葉青的多元化定向化育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

材料為三葉青澤青1號(hào)及其突變體101、102、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、120、123、124、125、126、127、130、131、132的葉片與成熟塊根，以及中澤、廣西、ZD-2的葉片與成熟塊根。葉片采集日期為2021年4月15日。其中突變體采用200 Gy的60Co-γ射線處理三年生的澤青1號(hào)種子培育而成，三葉青塊根在40℃下干燥后磨粉，過100目篩備用，葉片置于-80℃超低溫冰箱中備用。

ICAP6300電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀，美國Thermo；L8900全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本HITACH；Acquity/NamoUPLC/Synapt G2 MS/LC-MS液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Waters；Barnstead LabTower EDI 超純水儀，美國Thermo；ETHOS 1微波消解儀，意大利Milestone；SQP電子分析天平，型號(hào)BSA124 S，德國Sartorius。

試劑為：牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、考馬斯亮藍(lán)G250、無水乙醇(分析純)、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸(分析純)、礦物質(zhì)元素混標(biāo)溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心)、硝酸(優(yōu)級(jí)純)、甲醇(色譜純)、氨水(色譜純)、乙腈(色譜純)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總物質(zhì)含量測定 建立總糖(可溶多糖)、總酮、總皂苷、總蛋白(可溶蛋白質(zhì))、總酚的五因素(溶劑濃度、料液比、超聲功率、溫度、時(shí)間)五水平正交體系共25組，以澤青1號(hào)干粉為材料篩選最優(yōu)試驗(yàn)方案：稱取1.0 g澤青1號(hào)干燥粉末，按照正交表試驗(yàn)組依次控制條件進(jìn)行。超聲結(jié)束，冷卻至室溫，用該試驗(yàn)組濃度乙醇溶劑補(bǔ)足失重，4℃靜置過夜，3次重復(fù)。

1.2.2 礦物質(zhì)含量測定 混標(biāo)溶液Al、As、Ba、Cr、Cu、Fe、Mg、Mn、Pb、Zn，5%硝酸(優(yōu)級(jí)純)梯度稀釋，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，建立線性回歸方程。精密稱取0.300 0 g藥材粉末于聚四氟乙烯消解罐中，加入優(yōu)級(jí)純濃硝酸5 mL、雙氧水3 mL，裝入微波消解儀中進(jìn)行消解，10 min升溫至180℃，全程40 min，冷卻至室溫后取出，5%硝酸定容至10 mL，4℃保存，3次重復(fù)。樣本定容液置于電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀上機(jī)測定，具體步驟參考儀器說明書。

1.2.3 游離氨基酸含量測定 選定澤青1號(hào)、101、103、107、109、112、113、114、126、中澤、廣西共11個(gè)株系突變體，3次重復(fù)。稱取1 g樣品，用50 mL 0.04 mol·L-1鹽酸(優(yōu)級(jí)純)浸提30 min；搖勻后過濾，吸取濾清液2 mL于離心試管中，加入8%磺基水楊酸2 mL，混勻，靜置15 min；10 000 r·min-1離心10 min；取上清液，過0.22 μm膜后全自動(dòng)氨基酸分析儀上機(jī)，輸出圖譜換算單位含量分析，具體步驟參考儀器說明書。

1.2.4 DNA條形碼分析 使用DP360多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取突變體葉片DNA，使用E035 2×Fast Pfu Master Mix(上海近岸蛋白質(zhì)科技有限公司)按說明書添加DNA與引物ITS4(5′-T C C T C C G C T T A T T G A T A T GC-3′)反應(yīng)體系(50 μL)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳(電泳條件：135V/135 mA/35 min)，分離特異性條帶并割膠回收送至杭州擎科生物公司測序；通過Sequencing Analysis 5.2分析峰圖數(shù)據(jù)，并使用DNAMAN、MEGA-X MEGA7.0等進(jìn)行多序列比對(duì)、突變位點(diǎn)篩選、同源性分析、BLAST比對(duì)、特異引物與探針設(shè)計(jì)等操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交體系分析

三葉青超聲提取正交體系中25組方案各組總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚的單位含量分布(圖1)和濃度分布(圖2)顯示，第1、第8、第15、第17及第24組提取效果較好，最優(yōu)提取方案為：取1.0 g樣品粉末置于50 mL離心管，向離心管中加入25 ml 50%乙醇，將離心管置于超聲設(shè)備中；超聲設(shè)備控溫60℃，以功率400 W對(duì)樣品溶液持續(xù)超聲處理25 min。正交體系中25組方案的總物質(zhì)單位含量(圖1)顯示，25組含量折線之間縱向增幅不同、不相交且整體趨勢相同，表明總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚五類總物質(zhì)間具有一定相關(guān)性。

2.2 總物質(zhì)相關(guān)性分析

以正交體系所得最優(yōu)提取方案提取26份三葉青樣本的總物質(zhì)，以澤青1號(hào)的總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚的單位含量為對(duì)照，計(jì)算各突變體總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚的含量，通過含量差異以Kendalls、Pearson、Spearman函數(shù)計(jì)算總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚之間的相關(guān)系數(shù)(圖3)，結(jié)果表明，在26份樣本中，總糖、總酮、總皂苷三者之間具有極顯著相關(guān)性，總糖、總酮、總皂苷三者與總酚之間具有顯著相關(guān)性，總蛋白與其他總物質(zhì)相關(guān)性普遍較低。

2.3 總物質(zhì)含量差異

以澤青1號(hào)的總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚單位含量百分制差異(表1)為對(duì)照，輔以傅里葉紅外變換光譜(圖4)初步篩選出125、126、127、130、131、132共6個(gè)具有含量優(yōu)勢、潛在定向育種價(jià)值的突變體。

注：G1：總糖；G2：總酮；G3：總皂苷；G4：總蛋白；G5：總酚。下同。Note：G1: Total polysaccharides. G2: Total ketones. G3: Total saponins. G4: Total protein. G5: Total phenols. The same as following.圖1 三葉青超聲提取正交體系25組方案各組總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚的單位含量分布Fig.1 Unit content distribution of total polysaccharides,total ketones,total saponins,total proteins,and total phenols in 25 groups of orthogonal ultrasound extraction system of T.hemsleyanum

圖2 三葉青超聲提取正交體系中總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚的濃度嶺圖分布Fig.2 Concentration ridge map distribution of total polysaccharides,total ketones,total saponins,total proteins,and total phenols in orthogonal ultrasound extraction system of T.hemsleyanum

圖3 三葉青中總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚之間的Kendalls、Pearson、Spearman相關(guān)系數(shù)Fig.3 Kendalls,Pearson and Spearman correlation coefficients of total polysaccharides,total ketones,total saponins,total proteins and total phenols in T.hemsleyanum

2.4 礦物質(zhì)含量分析

2.4.1 礦物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)限量分析 26份三葉青樣本礦物質(zhì)元素單位含量(圖5)顯示，在突變體113、123、124和131中未檢出As元素，其他元素在26份樣本中均有檢出，且含量不同。

急性闌尾炎是一種常見的外科疾病。該疾病的特征是轉(zhuǎn)移性右下象限疼痛。這種疾病在年輕人中很常見[1-3]。前一天,臨床上急性闌尾炎主要是手術(shù)切除[4],如果延誤診斷和治療,可能會(huì)引起嚴(yán)重并發(fā)癥。早期癥狀高熱,嘔吐等癥狀嚴(yán)重者將導(dǎo)致穿孔,使患者的健康受到嚴(yán)重影響[5]。因此,在診所采取合理有效的治療和護(hù)理干預(yù)是非常重要的。本研究的目的是調(diào)查中醫(yī)和西醫(yī)護(hù)理干預(yù)對(duì)急性闌尾炎的臨床療效及其對(duì)急性闌尾炎患者生活質(zhì)量的影響,為臨床治療提供指導(dǎo)。

礦物質(zhì)單位含量基礎(chǔ)指標(biāo)顯示，最大單位含量Al(1 285.689 mg·kg-1)、Fe(323.711 mg·kg-1)、Mg(2 297.569 mg·kg-1)、Zn(156.906 mg·kg-1)均在100.000 mg·kg-1以上；最大單位含量As(1.861 mg·kg-1)、 Ba(81.070 mg·kg-1)、Cr(7.201 mg·kg-1)、 Cu(12.451 mg·kg-1)、Mn(97.527 mg·kg-1)、 Pb(1.967 mg·kg-1)均在100.000 mg·kg-1以下。參照《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[26]，重金屬及有害元素Cu、As和Pb在標(biāo)準(zhǔn)限量范圍內(nèi)(Cu≤20.0 mg·kg-1、 As≤2.0 mg·kg-1、Pb≤5.0 mg·kg-1)，均符合要求。

2.4.2 礦物質(zhì)含量差異 各突變體目標(biāo)元素含量差異(圖5、6)表明，澤青1號(hào)對(duì)目標(biāo)元素的貯存能力普遍高于大部分突變體，但部分突變體中As、Ba、Cu、Mg、Mn、Pb、Zn等元素的含量高于澤青1號(hào)，而在Cr、Fe、Al的指標(biāo)中以澤青1號(hào)最高。以上述指標(biāo)篩選出103、107、112、113等4個(gè)部分元素含量高于澤青1號(hào)的突變體(圖9)。

突變體103、107中As含量高于澤青1號(hào)(1.501 5 mg·kg-1>1.115 7 mg·kg-1、 1.860 5>1.115 7 mg·kg-1)，107中Cu含量亦高于澤青1號(hào)(12.451 2 mg·kg-1> 7.703 7 mg·kg-1)，但均未超出限量；107、112中Mg含量高于澤青1號(hào)(2 242.025 4 mg·kg-1>2 125.264 5 mg·kg-1、 2 297.569 2 mg·kg-1>2 125.264 5 mg·kg-1)，112、113中Mn含量高于澤青1號(hào)(227.630 8 mg·kg-1>217.765 8 mg·kg-1、253.747 7 mg·kg-1>217.765 8 mg·kg-1)；此外，Cr、Fe、Al含量則均以澤青1號(hào)為最高(7.201 0、323.711 3、1 285.689 1 mg·kg-1)。

表1 26個(gè)三葉青樣本總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚的單位含量百分制差異Table 1 The percentage difference of total polysaccharides,total ketones,total saponins,total proteins and total phenols in 26 samples of T.hemsleyanum /%

圖4 澤青1號(hào)及其突變體的傅里葉紅外變換光譜圖Fig.4 Fourier transform spectra of 11 samples from Zeqing 1 and its mutants

注：編號(hào)100為澤青1號(hào)。Note：Number 100 indicate Zeqing 1.圖5 26個(gè)三葉青樣本的礦物質(zhì)元素單位含量分布Fig.5 Mineral element unit content distribution of 26 samples from T.hemsleyanum

2.4.3 礦物質(zhì)相關(guān)性分析 對(duì)Al、As、Ba、Cr、Cu、Fe、Mg、Mn、Pb、Zn共10項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明(圖8)，目標(biāo)元素間具有普遍的顯著相關(guān)性，集中在Al、Fe、Mg、Zn、Mn 5個(gè)元素中；Fe與Mn具有相近的分布特征，Al、Mg、Zn則分布特征相差較大，反映了突變對(duì)部分礦物質(zhì)代謝通路影響的相似程度，與其正態(tài)分布基本符合(圖9)。

圖6 26份三葉青樣本在各元素中的百分制權(quán)重Fig.6 The percentage proportion of 26 samples of T.hemsleyanum in each mineral element

2.4.4 礦物質(zhì)主成分分析 載荷系數(shù)表明，所有研究項(xiàng)對(duì)應(yīng)的共同度值均高于0.4，表明研究項(xiàng)和主成分之間有著較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，主成分可以有效地從Al、As、Ba、Cr、Cu、Fe、Mg、Mn、Pb、Zn提取出信息?？芍鲜鲈鼐哂辛己玫妮d荷性，可作為三葉青各突變體株系的特征性成分(圖10)。

2.5 游離氨基酸含量分析

2.5.1 游離氨基酸含量差異 結(jié)果表明，Cys、Leu在11突變株系中均未檢出；Asp、Thr、Glu、Gly、Ala、Val、Phe、Lys、His、Arg 10種游離氨基酸在11株系中均有檢出；Ser只在101株系中檢出；Met在101、114、126 3個(gè)株系中未檢出，其他株系均有檢出；Tyr只在109株系樣品中檢出，其他株系均未檢出。107、109、112、113突變株系的特征性氨基酸和總氨基酸量均高于澤青1號(hào)(圖11)。有研究表明，總氨基酸能明顯降低肝臟丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)活性、肝臟指數(shù)和丙二醛含量，提高活菌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性，對(duì)肝臟損傷具有良好的保護(hù)作用[27-28]；總氨基酸作用于肝癌細(xì)胞HepG2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上具有良好效果[22]。因此篩選出107、109、112、113四個(gè)具有成分育種潛力的突變體。

2.5.2 游離氨基酸相關(guān)性 Asp、Thr、Glu、Gly、Ala、Val、Phe、Lys、His、Arg、Ser、Met、Ile、Tyr 14項(xiàng)相關(guān)性分析(圖12)，結(jié)合各游離氨基酸的正態(tài)檢驗(yàn)(表2)分布結(jié)果表明，各突變體中各元素間沒有顯著的相關(guān)性，但Asp、Glu、Val、Phe等少數(shù)幾個(gè)元素在部分突變體中具有相似的含量分布特征，反映了突變對(duì)部分氨基酸代謝通路影響的相似程度。

圖7 澤青1號(hào)及其突變體103、107、112、113的礦物質(zhì)含量差異Fig.7 Differences of the mineral content of Zeqing 1 and its mutants 103,107,112,113

圖8 三葉青礦物質(zhì)間相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between the minerals in T. hemsleyanum

表2 澤青1號(hào)及其突變體的游離氨基酸正態(tài)性檢驗(yàn)分析Table 2 Analysis of the normality test of free amino acids of Zeqing 1 and its mutants

圖9 26份三葉青樣本在10個(gè)特征元素中的正態(tài)分布Fig.9 The normal distribution of 26 samples of T.hemsleyanum in 10 characteristic mineral elements

圖10 26份三葉青樣本的礦物質(zhì)二維、三維主成分分布Fig.10 The two-dimensional and three-dimensional distribution of principal component of mineral elements in 26 samples of T.hemsleyanum

2.6 DNA條形碼分析

2.6.1 DNA提取和ITS引物擴(kuò)增 擴(kuò)增結(jié)果(圖13)顯示，突變體123未檢出條帶，其余突變體膠圖中1 000、750、500 bp位點(diǎn)附近均產(chǎn)生清晰、明亮、特征性一致的條帶分布；而后對(duì)突變體123共進(jìn)行7次重復(fù)試驗(yàn)后均未檢出條帶。結(jié)果表明，澤青1號(hào)突變?yōu)?23株系過程中與ITS引物結(jié)合位點(diǎn)處發(fā)生突變，導(dǎo)致引物無法結(jié)合而未擴(kuò)增出條帶，但其余株系未出現(xiàn)此類突變，可擴(kuò)增出特征性一致的條帶。

2.6.2 突變體與近緣崖爬藤屬植物序列分析 使用 MEGA-X 對(duì)三葉青突變體ITS4引物擴(kuò)增帶進(jìn)行序列比對(duì)，并與符淵淼[18]公布的三葉青近緣種屬植物的ITS4擴(kuò)增條帶序列進(jìn)行差異分析(圖14)，結(jié)果顯示，澤青1號(hào)突變類群與近緣種屬序列間具有豐富的變異位點(diǎn)，且澤青1號(hào)突變類群間具有較高的同源性，澤青1號(hào)突變類群與其近緣種可直觀地區(qū)分開。

使用MEGA7.0以Neighbor-Joining構(gòu)建突變類群與近緣種屬序列的起源進(jìn)化樹Original Tree(圖15)與自舉共識(shí)樹(Bootstrap Consensus Tree)，進(jìn)化樹均顯示可將近緣種屬聚為一類與突變類群顯著區(qū)分；DNAMAN所構(gòu)建的Original Tree與MEGA7.0所構(gòu)建的Original Tree(圖15)結(jié)果相似，且顯示澤青1號(hào)突變類群與其近緣種屬序列組僅有49%的同源性，而突變體間同源性多近似為100%，均表明可以顯著區(qū)分澤青1號(hào)突變類群與其近緣種。

總體結(jié)果表明，所選引物ITS4可以良好地區(qū)分澤青1號(hào)及其突變體與其部分近緣種屬物種，初步認(rèn)為ITS4具有作為澤青1號(hào)突變類群與近緣種屬區(qū)分條形碼的潛力。

圖11 澤青1號(hào)及其突變體107、109、112、113的游離氨基酸含量差異Fig.11 Differences in free amino acid contents of Zeqing 1 and its mutants 107,109,112 and 113

2.6.3 突變體間序列分析 使用DNAMAN對(duì)多變體序列比對(duì)，從中提取一段包含豐富變異位點(diǎn)序列片段，該序列長度為160 bp[包含空位(gaps)]，該組片段多序列比對(duì)后顯示：在提取序列一致性95.33%的基礎(chǔ)上，以澤青1號(hào)為參照共產(chǎn)生244個(gè)突變位點(diǎn)，包括置換、缺失和插入3種突變類型，占總突變體提取序列的6.35%，可以對(duì)澤青1號(hào)單個(gè)突變體進(jìn)行區(qū)分。在此基礎(chǔ)上可以設(shè)計(jì)探針或特征引物，直接從PCR擴(kuò)增條帶泳圖進(jìn)行不同突變體的判斷，這種方法可為后期突變株系的追蹤和應(yīng)用提供有效的幫助。此外，該段序列的同源性分析顯示同源性在93%～99%之間，具有高度相似性。

圖12 三葉青游離氨基酸間相關(guān)性分析Fig.12 Correlation analysis between the free amino acid in T.hemsleyanum

2.6.4 遺傳距離分析 使用MEGAX進(jìn)行遺傳距離分析，澤青1號(hào)突變類群及其近緣種屬的成對(duì)遺傳距離(Pairwise Distance)結(jié)果顯示，澤青1號(hào)突變類群各突變體間距離在0～0.167之間，近緣種屬各突變體間距離在0.108～1.279之間，而澤青1號(hào)突變類群突變體與近緣種屬突變體間距離則在0.474～1.587之間，表明澤青1號(hào)突變類群與近緣種屬間具有明顯差異，這種差異在DNA片段各處均有延伸，這種差異也是ITS4作為條形碼的基礎(chǔ)。

此外，MEGAX的遺傳距離分析顯示，澤青1號(hào)突變類群及其近緣種屬的總平均遺傳距離(Overall Mean Distance)為0.54；突變類群與近緣種屬的種內(nèi)平均遺傳遺傳距離(Within Mean Group Distance)分別為0.044、0.144，組間平均遺傳距離(Between Group Mean Distance)為0.993，組間平均凈遺傳距離(Net Between Group Mean Distance)為0.899，這與Pairwise Distance所得結(jié)論相同。

使用MGEAX對(duì)參照DNAMAN多序列比對(duì)所獲得的保守且變異位點(diǎn)特異、相對(duì)豐富的160 bp(部分突變體序列包含gaps)序列片段進(jìn)行遺傳距離分析，結(jié)果顯示，澤青1號(hào)突變類群各突變體間距離Pairwise Distance在0.006 40～0.116 96之間，Overall Mean Distance為0.059 99，Within Mean Group Distance為0.060 70，說明澤青1號(hào)突變類群間在具有高度保守、高度同源性的前提下依舊可以產(chǎn)生相對(duì)豐富的變異位點(diǎn)，由ITS4所建立的條形碼兼具種屬鑒別和種間分子鑒定的功能。

2.6.5 突變類群的BLAST比對(duì) 以2.6.3提取的澤青1號(hào)160 bp序列進(jìn)行BLAST比對(duì)(程序參數(shù)：discontiguous megablast)篩選出前100組來源石斛、擬南芥、棉花、蓮藕、荔枝、馬鈴薯、可可豆、杜鵑等多種植物的相似序列，序列相似度最高為89.89%。

圖13 三葉青樣本的DNA引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.13 Results of DNA of primer amplificationof samples of T.hemsleyanum

圖14 26份三葉青樣本與近緣種的多序列比對(duì)Fig.14 Multiple sequence alignment of between 26 samples and its closely related species of T.hemsleyanum

圖15 基于26份三葉青樣本與23個(gè)近緣種的ITS序列構(gòu)建同源樹Fig.15 The Original Tree based on ITS sequences of 26 samples and its 23 closely related species of T.hemsleyanum

此外，通過DNAMAN對(duì)ITS4所擴(kuò)增片段的測序結(jié)果進(jìn)行多序列比對(duì)，將澤青1號(hào)的保守序列全部提取，得到一段517 bp突變豐富的片段并進(jìn)行BLAST比對(duì)，篩選出前100組來源可可豆、甜瓜、羅漢果、番茄、野黃花、毛竹、茉莉花等多種植物、藻類的相似序列，序列相似度最高為74.48%；同時(shí)，對(duì)所提取的517 bp片段進(jìn)行二次提取，分別得到500、400、300、200、100 bp片段，并進(jìn)行BLAST比對(duì)，所得最高序列相似度依次為74.48%、74.48%、74.48%、73.27%、72.92%。結(jié)果表明，在避免目標(biāo)序列長度過短和保證目標(biāo)序列具有一定保守性的前提下，從三葉青中所提取的目標(biāo)序列與BLAST檢索序列的序列相似度穩(wěn)定在70%～80%之間，說明在三葉青中僅需要一段具有一定保守性的小片段即可實(shí)現(xiàn)種屬鑒別和種間分子鑒定；同時(shí)，提取序列的檢索量與相似度和提取序列的長度與保守程度相關(guān)，提取序列長度與檢索序列物種多樣性一定程度上成反比，應(yīng)盡可能包含高度保守和相對(duì)保守區(qū)，同時(shí)保證序列長度。

2.6.6 突變類群的DNA條形碼構(gòu)建 對(duì)澤青1號(hào)及其突變體序列進(jìn)行DNAMAN多序列比對(duì)，結(jié)果顯示突變位點(diǎn)較為平均地分布于各突變體中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)幾段極度保守、穩(wěn)定的不連續(xù)片段，僅少數(shù)位點(diǎn)產(chǎn)生突變(圖13)，以此獲得一段擬DNA條形碼的序列：5′-T G G G G A A A T G C T C A A A A A T A C C A T A T C C C C T A C C T C A A A C T C T A G G T C C C T A C G G G G A T T G C C C G A T T A A C T T T T G T G T C G G G C T T G G G A A A T T T T C G G A C T A T C C C T T A T A A C T T T G A T C T T A T C A C A A G G C A C T T G A A C A A T T T C C G G A C C T A C T A A T T T C C T T T C C C C T A C C T C G C C C C A A C A G A C T G A A G T T C A A C A T T T C C G T C C A T A A A G A G C C T C A T A A G G G G C C A T A C C A A T A C T G G T C T G A T A A C T G T T A T T G T A T G C A A A C T C C A T C A G G G A T A G A T G G G C G T C C C A G C T C C C T C T A A A C T C C A T A A C A C A T G C C CT-3′使用該序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果與2.6.5的比對(duì)結(jié)果相似，序列相似度均在80%以下，最終認(rèn)為該段序列可以作為三葉青澤青1號(hào)及其突變體類群的DNA條形碼序列。

3 討論

60Co輻射誘變技術(shù)是當(dāng)前植物種質(zhì)資源開發(fā)的重要手段，如目前已對(duì)朝天椒[29]、小麥[30]、水稻[31]等多種作物進(jìn)行了相關(guān)研究。本試驗(yàn)所用的三葉青突變體是采用200 Gy60Co-γ射線處理三葉青高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品種澤青1號(hào)所得。因此在材料選擇上具有科研和商業(yè)雙向價(jià)值，一方面篩選出的優(yōu)良突變體可直接應(yīng)用于商業(yè)種植，另一方面澤青1號(hào)及其突變體是研究種質(zhì)進(jìn)化與分子標(biāo)記技術(shù)的適宜樣本，是進(jìn)行分子改良的基礎(chǔ)材料。前人關(guān)于三葉青理化性質(zhì)的研究多僅以總黃酮含量為不同品種三葉青的差異指標(biāo)[32-34]，缺乏其他總物質(zhì)含量的對(duì)比。本試驗(yàn)使用中高濃度的有機(jī)乙醇溶劑進(jìn)行五類不同極性的組分提取，構(gòu)建五因素五水平正交試驗(yàn)驗(yàn)證該方法實(shí)用性，篩選優(yōu)化體系；此外，本研究創(chuàng)新性地使用50%乙醇溶劑超聲一體化提取總糖、總酮、總皂苷、總蛋白質(zhì)、總酚五類不同極性的物質(zhì)，完成多類物質(zhì)總含量測定與相關(guān)性分析，能夠在極大程度上節(jié)省人力物力，縮短操作流程，提高原材料利用率，為植物組分提取類研究提供有效的參考基礎(chǔ)。

圖16 26份三葉青樣本中一段ITS序列保守序列的位點(diǎn)突變結(jié)果Fig.16 Results of site mutation in a ITS sequence conserved in 26 samples of Tetrastigma hemsleyanum

尹明華等[19]利用簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeat,SSR)熒光標(biāo)記分析了64個(gè)三葉青種質(zhì)樣本的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，結(jié)果表明，遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.115 4～0.954 5、遺傳距離變化范圍為 0.000 0～3.218 1,遠(yuǎn)高于本研究中突變體類群遺傳距離(Pairwise Distance在0.006 40～0.116 96之間，Overall Mean Distance為0.059 99，Within Mean Group Distance為0.060 70)，但與突變類群突變體與近緣種屬突變體間距離(0.474～1.587)存在交集，說明尹明華等[19]所用64個(gè)種質(zhì)樣本間的親緣關(guān)系、種間距離差異較大，所有樣本處于種間水平，且部分樣本可能處于屬間水平；而突變體類群間分析種內(nèi)水平研究。根據(jù)以上研究推測，三葉青所在的崖爬藤屬植物的種間界限遺傳距離在0.116 96～0.474 00以上、3.218 10以下范圍內(nèi)。此外尹明華等[20-22]又分別使用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、微衛(wèi)星分子標(biāo)記(inter-simple sequence repeat，ISSR)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)對(duì)上述64個(gè)三葉青種質(zhì)樣本的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析，所得結(jié)論與上述研究結(jié)果相符，表明SSR、RAPD、ISSR、SRAP四種分子標(biāo)記方式適用于種屬水平的分子鑒定，不適用于種內(nèi)水平。

DNAMAN多序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究的突變位點(diǎn)分布并不均勻。結(jié)果顯示TTT、AAA小片段序列極度保守，基本不發(fā)生突變，同時(shí)CCCC、GGGG小片段序列同樣非常保守，不易突變。推測是由于相同堿基之間由于鍵能、鍵角等物理性質(zhì)極為接近或相同，因此更易形成相對(duì)穩(wěn)固的化學(xué)鍵，對(duì)外界誘導(dǎo)突變的抗性增加[35-36]。

由于本研究的對(duì)比序列較短，導(dǎo)致無法使用MEGA-X構(gòu)建N-J(K-2)同源樹，因此在后續(xù)研究中有必要提取分子量較大的序列進(jìn)行分析，以放大同源性差異方便比對(duì)。本研究還發(fā)現(xiàn)，DNAMAN所得Bootstrap Consensus Tree結(jié)果受程序模式、序列長短和運(yùn)算次數(shù)的影響，導(dǎo)致有時(shí)Bootstrap Consensus Tree運(yùn)算沒有正向的參考價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究以正交方法構(gòu)建并優(yōu)化了三葉青總糖、總酮、總皂苷、總酚、總蛋白5種總物質(zhì)一體化提取測定的有機(jī)溶劑超聲提取體系，并結(jié)合礦物質(zhì)、游離氨基酸兩指標(biāo)篩選出103、107、109、112、113、125、126、127、130、131、132具有潛在定向育種價(jià)值的突變體；另外研究表明三葉青突變體中的總糖、總酮、總皂苷三者單位含量與總酚之間呈顯著相關(guān)，Al、Fe、Mg、Zn、Mn 5個(gè)元素間也呈顯著相關(guān)。