葉類(lèi)蔬菜中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌PCR快速檢測(cè)方法的建立

李曉然 張若鴻 王 純 尹樹(shù)仁 王曉芳 楊 洋,* 崔生輝 郭云昌

(1 河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北 秦皇島 066600；2 中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；3 國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 100022)

葉類(lèi)蔬菜富含膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)，有益于人體健康。然而，隨著葉類(lèi)蔬菜消費(fèi)量的增加，相關(guān)食源性致病菌引發(fā)的食源性疾病暴發(fā)也隨之增加，對(duì)公共健康造成了嚴(yán)重危害[1-2]。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)是一種常見(jiàn)的侵襲性食源性致病細(xì)菌。人體被該菌感染后易引發(fā)敗血癥和腦膜炎等侵襲性疾病，病死率較高(20%～30%)[3-4]。目前國(guó)外葉類(lèi)蔬菜中該菌引發(fā)的李斯特菌病暴發(fā)數(shù)量逐漸攀升，國(guó)內(nèi)也存在散發(fā)事件，且該趨勢(shì)仍在持續(xù)[5-6]，因此急需建立一種快速可靠的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)方法，以確保葉類(lèi)蔬菜的質(zhì)量安全，為公共衛(wèi)生安全提供保障。

傳統(tǒng)的基于細(xì)菌培養(yǎng)的檢測(cè)方法被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”，可靠準(zhǔn)確但耗時(shí)耗力(5～7 d)[7]。為克服傳統(tǒng)方法的局限性，目前已開(kāi)發(fā)多種食源性致病菌快速檢測(cè)方法，其中酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)技術(shù)雖操作簡(jiǎn)便，但需目標(biāo)菌與抗體進(jìn)行有效的物理接觸(靈敏度較低)，且易受免疫原性的干擾[8]。光學(xué)/電化學(xué)生物傳感器和基因芯片技術(shù)具有高通量?jī)?yōu)勢(shì)，但檢測(cè)成本昂貴，對(duì)設(shè)備和操作人員技能要求較高[9-10]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)雖已成為食源性致病菌檢測(cè)發(fā)展最成熟的技術(shù)[11]，但PCR方法通常需要樣品前增菌處理來(lái)抑制背景微生物生長(zhǎng)，也以提高檢測(cè)精確度。研究發(fā)現(xiàn)，葉類(lèi)蔬菜基質(zhì)中存在多個(gè)PCR反應(yīng)抑制因子，如多糖、酚類(lèi)化合物和葉綠素等[12-13]。β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CD)是由7個(gè)葡萄糖單體連接成的中空截短圓錐形結(jié)構(gòu)的葡萄糖低聚物，其分子內(nèi)部疏水，外部親水[14]。葉類(lèi)蔬菜表面的PCR抑制因子如蠟質(zhì)物(疏水性化合物)可被捕獲到其內(nèi)部，使存在于疏水性基質(zhì)中的細(xì)菌被分離到水相中[2]。活性炭是一種具有極強(qiáng)吸附能力、較大表面積的多孔物質(zhì)[12]。有研究表明，表面未包被的活性炭可吸附細(xì)菌細(xì)胞和PCR抑制因子，而牛乳蛋白包被的活性炭不會(huì)與細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合，并保留大部分吸附能力(吸附PCR抑制因子)[12]。此外，iap基因(編碼單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的侵襲性相關(guān)蛋白)在整個(gè)菌種中具有高度保守性，并且是PCR方法中常用目標(biāo)基因之一[15-16]。而一些研究人員提出的目標(biāo)基因在一些菌株中存在缺失/突變現(xiàn)象，如LIPI-1的prfA、mpl和LIPI-2的inlA[3,17]。因此，本研究利用β-CD和牛乳蛋白包被活性炭對(duì)樣品進(jìn)行前處理，以消除葉類(lèi)蔬菜中的PCR抑制因子，并使用基于iap基因的引物，旨在開(kāi)發(fā)一種快速、靈敏、無(wú)需前增菌的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌PCR檢測(cè)方法，為葉類(lèi)蔬菜的質(zhì)量安全提供有力保障，并為進(jìn)一步預(yù)防食源性李斯特氏菌病暴發(fā)、提升我國(guó)食源性疾病預(yù)警效率做出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

本研究所用菌株共計(jì)141株(表1)，來(lái)自美國(guó)模式菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。以無(wú)菌操作，用無(wú)菌棉簽從平板上取本研究所用菌株的新鮮純培養(yǎng)菌落，轉(zhuǎn)移到含腦心浸液(brain heart infusion，BHI)肉湯和20%甘油的冷凍儲(chǔ)藏管中，混勻，儲(chǔ)存在-80℃的冰箱中。

菌株培養(yǎng)：將李斯特氏菌菌株接種在BHI瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)(18 h，37℃)；微需氧條件(5%氧氣)下，將結(jié)腸彎曲菌和空腸彎曲菌菌株接種在Bolton肉湯中培養(yǎng)(24 h，42℃)；副溶血性弧菌菌株接種在含有3% NaCl的Luria-Bertani培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(18 h，37℃)；其他菌株接種到Luria-Bertani培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(18 h，37℃)。

1.2 主要試劑與儀器

BHI肉湯、BHI瓊脂、Bolton肉湯、李氏增菌肉湯(Listeriaenrichment broth，LB)、PALCAM培養(yǎng)基、科瑪嘉李斯特菌顯色培養(yǎng)基、TSA-YE培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化鑒定試劑盒，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Luria-Bertani培養(yǎng)基，上海君瑞生物技術(shù)有限公司；β-CD，河北科隆多生物科技有限公司；嬰幼兒脫脂乳粉，黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、乙酸、乙酸鈉，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白、鮭魚(yú)精DNA、10×PCR buffer、dNTPs mix(1 mmol·L-1)、基于iap基因和prfA基因的引物、TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)、TaqPCR Premix、100 bp DNA Ladder，寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖、0.5×三硼酸乙二胺四乙酸(Tris/Borate/EDTA，TBE)緩沖液，上海尚寶生物科技有限公司。

Bagmixer-400W均質(zhì)器，法國(guó)Interscience公司；HYC-326A醫(yī)用低溫冰箱，青島海爾特種電器有限公司；X3R高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；DF-101 S磁力攪拌器，青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；JUPT-III-10超純水發(fā)生器，廣州罡然機(jī)電設(shè)備有限公司；Personal Cycler PCR擴(kuò)增儀，德國(guó)Biometra公司；DYY-11電泳儀，北京市六一儀器廠；Biospectrum 310凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)UVP公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 人工污染葉類(lèi)蔬菜樣品 葉類(lèi)蔬菜(菠菜、生菜、油麥菜、油菜和大白菜)在被目標(biāo)菌人工污染前于2℃保存24 h。然后修剪蔬菜以去除老化、受損的葉子。按1.1節(jié)，BHI培養(yǎng)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌株ATCC 19111(18 h，37℃)，使用無(wú)菌生理鹽水將新鮮培養(yǎng)物10倍系列稀釋(100～108)。按《GB 4789.30-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn): 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》[18]中的平板計(jì)數(shù)法，對(duì)稀釋的菌懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，以獲取所需目標(biāo)菌濃度(100～105CFU·mL-1)的菌懸液。在生物安全柜中分別將不同濃度的菌懸液均勻地接種在菠菜葉的正面與背面，每面滴20滴，每滴10 μL(其他葉類(lèi)蔬菜的操作步驟相同)。接種完的菠菜鼓風(fēng)干燥30 min，使液滴蒸發(fā)/吸附到菠菜葉表面。然后將其放入無(wú)菌未封口的塑料袋中(允許氣體交換)，保存在冰箱中(4℃過(guò)夜)，確保目標(biāo)菌有效附著在樣品上。未接種目標(biāo)菌的菠菜作為陰性對(duì)照。第二天，按標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.30-2016[18]對(duì)樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，以確定目標(biāo)菌濃度。將75 mL無(wú)菌生理鹽水倒入有25 g菠菜葉(100～104CFU·25g-1)的均質(zhì)袋中，230 r·min-1均質(zhì)2 min。均質(zhì)后樣品用于靈敏度測(cè)試的樣品前處理。

1.3.2 牛乳蛋白包被活性炭的制備 取嬰幼兒脫脂乳粉(24.00、12.00、6.00、3.00、1.50、0.75、0.38 g)分別倒入盛有25 mL超純水的400 mL燒杯中，磁力攪拌器中速攪拌至乳粉完全溶解(約2 min)。向每個(gè)燒杯中倒入50 mL 95%乙醇，中速磁力攪拌(2 min)以沉淀牛乳蛋白。將沉淀的每個(gè)牛乳蛋白轉(zhuǎn)移至250 mL離心瓶中，室溫(20～25℃)下離心(5 000 r·min-1)5 min。離心所得沉淀重懸于150 mL超純水中，用0.1 mol·L-1氫氧化鈉(sodium hydroxide，NaOH)調(diào)節(jié)pH值至9.0。

用篩子過(guò)篩活性炭(0.85～2.0 mm顆粒)。超純水洗滌200 g活性炭3次，以除去雜質(zhì)，并于55℃條件下干燥。分別將之前制備好的不同濃度牛乳蛋白液倒入燒杯，然后將44 g干燥的活性炭倒入其中。將燒杯置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，37℃、150 r·min-1振蕩2 h。傾倒上清液，用超純水輕輕漂洗底層活性炭3次，以除去未結(jié)合的牛乳蛋白。將燒杯置于55℃培養(yǎng)箱中，直至牛乳蛋白包被活性炭完全干燥，以備用。

1.3.3 β-CD溶液處理樣品 將8 g β-CD倒入有100 mL去離子水的500 mL無(wú)菌燒瓶中，攪拌加熱直至β-CD完全溶解。使用前，將制備好的8% β-CD溶液冷卻至55℃。為去除樣品中的疏水性化合物(葉類(lèi)蔬菜表面蠟質(zhì)物)，將8% β-CD溶液(100 mL)倒入各種樣品(菠菜、生菜、油麥菜、油菜和大白菜)勻漿中，并使β-CD的最終濃度為5 g·100 mL-1。均質(zhì)勻漿(230 r·min-1，2 min，37℃)，隨后將其轉(zhuǎn)至250 mL離心瓶中，1 000 r·min-1離心5 min，以沉積大顆粒蔬菜組織和大多數(shù)β-CD復(fù)合物。所得上清液于10 000 r·min-1條件下離心10 min，所得沉淀重懸于30 mL 0.01 mol·L-1乙酸生理鹽水緩沖液(0.85%氯化鈉、乙酸、乙酸鈉，pH值 5.0)中，用于牛乳蛋白包被活性炭處理。

1.3.4 牛乳蛋白包被活性炭處理樣品 取1.3.2節(jié)制備好的4.6 g牛乳蛋白包被活性炭倒入燒杯中，用20 mL無(wú)菌生理鹽水清洗兩次，將其與之前β-CD溶液處理過(guò)的30 mL樣品勻漿混合?；旌衔镌谑覝叵?，160 r·min-1振蕩15 min。將0.2 g無(wú)菌玻璃棉填入到50 mL無(wú)菌塑料注射器底部，上述混合物轉(zhuǎn)至注射器內(nèi)，用乙酸生理鹽水緩沖液清洗，直至無(wú)菌離心管中收集到30 mL洗脫液。洗脫液于10 000 r·min-1條件下離心10 min，以沉淀細(xì)菌細(xì)胞，棄上清液保留沉淀，用于模板DNA制備。

1.3.5 模板DNA制備 將含細(xì)菌細(xì)胞的沉淀物重懸于總混合體系0.5 mL的離心管中，該混合體系包含50 μL(5 mg·mL-1)牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、50 μL(0.05 mg·mL-1)鮭魚(yú)精脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)和300 μL超純水。將離心管沸水浴10 min，以裂解細(xì)菌細(xì)胞。裂解液在冰上冷卻至室溫，離心(12 000 r·min-1，5 min)。上清液小心轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌離心管中，加入等體積冷卻的無(wú)水乙醇以沉淀DNA，離心(12 000 r·min-1，15 min)。棄上清液，然后加100 μL無(wú)菌去離子水溶解沉淀的DNA。DNA樣品分裝，每份10 μL，用于PCR檢測(cè)。

1.3.6 PCR反應(yīng)體系的建立 本方法使用的基于目標(biāo)菌iap基因的特異性引物(序列01：5′-A C A A G C T G C A C C T G T T G C AG-3′，02：5′-T G A C A G C G T G T G T A G T A G CA-3′)，由寶生物工程(大連)有限公司合成，目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物為131 bp。已發(fā)表的基于目標(biāo)菌prfA基因的引物(01：5′-C C C A A G T A G C A G G A C A T G C T AA-3′，02：5′-G G T A T C A C A A A G C T C A C G AG-3′)作為對(duì)照[19]。

基于iap基因引物的50 μL PCR反應(yīng)體系包含：10×PCR buffer 5 μL、1 mmol·L-1脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs)mix 4 μL、40 μmol·L-1正反向引物各0.5 μL、5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.25 μL、模板DNA 1 μL、無(wú)菌超純水38.75 μL?；趐rfA基因引物的50 μL PCR反應(yīng)體系包含：TaqPCR Premix 25 μL、20 μmol·L-1正反向引物各1 μL、模板DNA 1 μL、超純水22 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)30次(基于prfA基因的引物循環(huán)25次)；72℃終延伸7 min(基于prfA基因的引物終延伸6 min)。凝膠電泳前，將樣品于4℃保存。所有PCR試驗(yàn)都有無(wú)菌超純水代替模板DNA的陰性對(duì)照。目標(biāo)菌菌株ATCC 19111的純培養(yǎng)物菌懸液(1 μL，104CFU·mL-1)作為陽(yáng)性對(duì)照。所得PCR產(chǎn)物在0.5×TBE緩沖液體系中的2%瓊脂糖凝膠上，恒壓100 V電泳1 h，然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.3.7 引物特異性測(cè)試 141株細(xì)菌菌株包括78株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、29株其他李斯特氏菌、34株非李斯特氏菌(其他常見(jiàn)致病菌)。菌株按1.1節(jié)進(jìn)行培養(yǎng)，所得新鮮培養(yǎng)物按1.3.5節(jié)方法制備模板DNA。然后分別用包含iap和prfA引物的PCR反應(yīng)體系(1.3.6)對(duì)模板DNA進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)檢驗(yàn)引物在這些菌株中辨別目標(biāo)菌與非目標(biāo)菌的能力，從而驗(yàn)證特異性。

1.3.8 方法靈敏度測(cè)試 為確定本方法在人工染菌葉類(lèi)蔬菜中的靈敏度，將目標(biāo)菌株ATCC 19111的10倍系列稀釋液人工污染每25 g菠菜葉，以獲取所需目標(biāo)菌濃度的菠菜葉樣品(100～104CFU·25g-1)，其他葉類(lèi)蔬菜按1.3.1進(jìn)行相同的操作。所得樣品均質(zhì)液按本方法進(jìn)行樣品前處理，按1.3.5制備模板DNA，每1 μL模板DNA懸液用于PCR。隨后PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，以確定檢測(cè)限。每個(gè)包含獨(dú)立制備樣品(染菌濃度100～104CFU·25 g-1的每種葉類(lèi)蔬菜)的試驗(yàn)重復(fù)10次。

1.3.9 方法實(shí)用性測(cè)試 為評(píng)估本方法的實(shí)用性，對(duì)蔬菜種植基地采集的2 500份葉類(lèi)蔬菜樣品(新鮮菠菜、生菜、油麥菜、油菜和大白菜各500份)中的目標(biāo)菌進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.30-2016[18]做檢測(cè)對(duì)比。

1.3.10 方法所用主要試劑的測(cè)試 為確定本方法所用主要試劑的穩(wěn)定性(保質(zhì)期)，對(duì)本方法的靈敏度和實(shí)用性進(jìn)行評(píng)估。試劑[0.1 mol·L-1NaOH、0.01 mol·L-1乙酸生理鹽水緩沖液、8% β-CD溶液、牛乳蛋白包被活性炭、BSA(5 mg·mL-1)、鮭魚(yú)精DNA(0.05 mg·mL-1)、40 μmol·L-1正向引物和反向引物(基于iap基因)、TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)]在測(cè)試前均置于-20℃冰箱。分別用保存了3、6、12個(gè)月的試劑，按本方法對(duì)人工染菌葉類(lèi)蔬菜樣品(菠菜、生菜、油麥菜、油菜和大白菜)進(jìn)行檢測(cè)，以確定本方法的靈敏度。不同人工染菌濃度(100～104CFU·25g-1)的每種蔬菜樣品試驗(yàn)重復(fù)5次。為評(píng)估本方法的實(shí)用性，分別按本方法(分別使用保存了3、6、12個(gè)月的試劑)和標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.30-2016[18]對(duì)蔬菜種植基地采集的樣品(5種葉類(lèi)蔬菜，各300份)進(jìn)行目標(biāo)菌檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 本方法的特異性

由表1可知，基于prfA基因的引物對(duì)6株目標(biāo)菌株(NCT 0890、ATCC 7645、ATCC BAA-348、ATCC 51781、ATCC BAA-2657和ATCC 19115 D-5)的檢測(cè)出現(xiàn)了假陰性結(jié)果、對(duì)2株非目標(biāo)菌菌株(伊氏李斯特氏菌ATCC 700402、伊氏李斯特氏菌BAA-753)的檢測(cè)出現(xiàn)了假陽(yáng)性結(jié)果。相比之下，本方法使用的基于iap基因的引物能夠正確識(shí)別所有菌株，未出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，并且在這些菌種中未檢測(cè)到非特異性擴(kuò)增子。因此本方法的iap引物序列對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)具有良好的特異性，PCR檢測(cè)的特異性為100%。

表1(續(xù))

2.2 本方法的靈敏度

根據(jù)試驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果，1.5 g乳粉所得牛乳蛋白包被44 g活性炭(表面包被的牛乳蛋白最多為0.45±0.08 g)處理樣品的效果最好。由圖1可知，當(dāng)樣品人工染菌濃度為101CFU·25g-1時(shí)，可見(jiàn)清晰條帶(陽(yáng)性結(jié)果)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為131 bp，與預(yù)期結(jié)果相同。由表2可知，用本方法可檢測(cè)到101CFU·25g-1樣品中的目標(biāo)菌，且在染菌濃度高于101CFU·25g-1的樣品中也獲得了相同的陽(yáng)性結(jié)果。因此，本檢測(cè)方法的檢測(cè)限為101CFU·25g-1。

注：泳道1：100 bp DNA Ladder；泳道2：使用單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ATCC 19111的 PCR陽(yáng)性對(duì)照；泳道3：不含目標(biāo)DNA的PCR陰性對(duì)照；泳道4～15：從人工染菌樣品(101 CFU·25g-1)中擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物；泳道4～6：菠菜樣品；泳道7～8：生菜樣品；泳道9～10：油菜樣品； 泳道11～12：大白菜樣品；泳道13～15：油麥菜樣品。Note: Lane 1: 100 bp DNA Ladder. Lane 2: A PCR positive control that used L. monocytogenes ATCC 19111. Lane 3: A PCR negative control without target DNA. Lanes 4～15: PCR products amplified from 101 CFU·25g-1 of artificially contaminated samples. Lanes 4～6: Spinach samples. Lanes 7～8: Lettuce samples. Lanes 9～10: Cole samples. Lanes 11～12: Cabbage samples. Lanes 13～15: Lactuca sativa L. samples.圖1 人工染菌樣品(101 CFU·25g-1)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification products of artificially contaminated samples (101 CFU·25g-1)

表2 用于檢測(cè)人工染菌葉類(lèi)蔬菜中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的所建立方法的靈敏度Table 2 The sensitivity of developed method used for the detection of L. monocytogenes in artificially contaminated leafy greens

2.3 本方法的實(shí)用性

由表3可知，本方法和國(guó)標(biāo)法(GB 4789.30-2016)[18]中菠菜、生菜、油菜的檢出率均分別為5%、3%、1%，其他葉類(lèi)蔬菜中未檢測(cè)到目標(biāo)菌；菠菜、生菜、油菜中活菌檢測(cè)率為100%，而其他種葉類(lèi)蔬菜均為0%；兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率為100%；與GB 4789.30-2016檢測(cè)時(shí)間(6 d)相比，本快速檢測(cè)方法僅用時(shí)4 h。綜上，本方法能夠準(zhǔn)確地從葉類(lèi)蔬菜中檢測(cè)出目標(biāo)菌(未出現(xiàn)假陽(yáng)性/假陰性結(jié)果)，可作為檢測(cè)葉類(lèi)蔬菜中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染的快速可靠方法。

表3 本方法和常規(guī)培養(yǎng)方法對(duì)實(shí)際葉類(lèi)蔬菜中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)Table 3 The detection of L. monocytogenes in natural leafy greens using the developed method and conventional culture method

2.4 本方法所用主要試劑的穩(wěn)定性

分別用-20℃保存了3、6、12個(gè)月的試劑，按本方法檢測(cè)染菌濃度101CFU·25g-1以下的葉類(lèi)蔬菜樣品后，均未檢出目標(biāo)菌；而分別用-20℃保存了3、6、12個(gè)月的試劑，按本方法檢測(cè)染菌濃度101CFU·25g-1及以上的樣品后，均檢出目標(biāo)菌，表明本方法的檢測(cè)限仍為10 CFU·25g-1。

在試劑不同保存條件下，本試驗(yàn)建立的快速檢測(cè)方法和國(guó)標(biāo)法對(duì)實(shí)際葉類(lèi)蔬菜樣品的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，使用保存了3、6、12個(gè)月的試劑，兩種方法的目標(biāo)菌檢出率、活體菌檢測(cè)率均一致(符合率100%)，表明本方法所用主要試劑在規(guī)定保存條件、保存時(shí)間內(nèi)使用，靈敏度和實(shí)用性穩(wěn)定；試劑可在-20℃保存至少12個(gè)月后正常使用，在冷凍條件下具有良好的穩(wěn)定性。

表4 本方法的試劑穩(wěn)定性測(cè)試(實(shí)用性)Table 4 Reagent stability assay of the developed method (application)

3 討論

食源性致病菌檢測(cè)是評(píng)估葉類(lèi)蔬菜微生物質(zhì)量安全的重要舉措之一，可為消費(fèi)者健康提供切實(shí)保障。其中PCR已成功用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)，是一種高效便利的分子方法[11]。然而，因樣品中存在許多PCR抑制因子，會(huì)抑制目標(biāo)DNA的特異性擴(kuò)增并降低檢測(cè)靈敏度[12,15]。因此，本研究基于β-CD和牛乳蛋白包被活性炭的樣品前處理(可消除PCR抑制因子)，建立無(wú)需前增菌的PCR快速檢測(cè)方法具有重要意義。

綜合比較前人的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)方法研究[15-16]，本方法中PCR的目標(biāo)基因iap在目標(biāo)菌種中具有高度保守性。而一些研究人員提出的目標(biāo)基因(prfA、mpl、hlyA、inlA)在該菌一些菌株中存在缺失/突變現(xiàn)象，并且一些親緣較近的非李斯特氏菌(金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌等)中存在李斯特氏菌毒力基因同源物，可能會(huì)導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果[3,17]。此外，特異性測(cè)試需要充足數(shù)量的菌株來(lái)支撐，且應(yīng)包含目標(biāo)菌與其他相關(guān)菌種。盡管目前許多PCR方法中使用的引物特異性為100%，但其中一些研究?jī)H用有限數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)菌株(4～33株)進(jìn)行測(cè)試[13,20-21]。相比之下，本方法的iap引物序列測(cè)試的菌株多達(dá)141株(78株目標(biāo)菌、63株非目標(biāo)菌)，特異性結(jié)果更準(zhǔn)確、更有說(shuō)服力。

因葉類(lèi)蔬菜基質(zhì)中存在多種會(huì)影響樣品中目標(biāo)菌回收并降低靈敏度的物質(zhì)[12]，提高檢測(cè)方法的靈敏度是艱巨的挑戰(zhàn)之一。本方法樣品前處理中用到的牛乳蛋白包被活性炭可吸附葉類(lèi)蔬菜中的葉綠素、酚類(lèi)化合物、多糖等PCR抑制因子；而β-CD可捕獲蔬菜表面蠟質(zhì)物(疏水化合物)，使葉表面的細(xì)菌細(xì)胞易被分離到水相中，以便目標(biāo)菌回收。本方法可實(shí)現(xiàn)濃度低至10 CFU·25g-1的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌超靈敏檢測(cè)，且檢測(cè)時(shí)間縮至4 h(無(wú)需前增菌)。與其他基于各種樣品前處理的PCR方法相比，本方法檢測(cè)限具有明顯優(yōu)勢(shì)。如用于克服PCR抑制的前增菌步驟雖盡可能避免了假陰性結(jié)果，但耗時(shí)較長(zhǎng)(12～18 h)，且由于葉類(lèi)蔬菜中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的含量通常較低，有時(shí)增菌后也未能檢出該菌[13,22]。近年來(lái)，過(guò)濾和免疫磁性分離(immunomagnetic separation，IMS)常用于PCR方法中的前處理，可濃縮樣品中的目標(biāo)菌到可檢測(cè)濃度[23-24]。值得一提的是，死菌中的DNA在細(xì)胞活力喪失后的多天內(nèi)仍可作為PCR模板，可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，而本方法還不能區(qū)分死菌和活菌[25]。前人研究表明，基于過(guò)濾的方法可實(shí)現(xiàn)活菌的特異性檢測(cè)。如Murakami[26]利用過(guò)濾前處理，8 h內(nèi)在生菜中檢測(cè)到1 CFU·g-1的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，比本研究的檢測(cè)限低2.5倍；Garrido-Maestu等[21]在24 h內(nèi)從雞肉樣品中獲得了與本研究相近的檢測(cè)限(9.5 CFU·25g-1)。但仍存在樣品基質(zhì)顆粒堵塞過(guò)濾器，影響目標(biāo)菌分離的缺陷，且仍需幾個(gè)小時(shí)的前增菌[5]。此外，一些基于IMS的PCR方法研究報(bào)道了相似的檢測(cè)限[20,24]。然而，IMS存在抗體交叉反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，所制備的用于捕獲目標(biāo)菌的單克隆/多克隆抗體可能會(huì)與親緣關(guān)系較近的非目標(biāo)菌結(jié)合[27]。

本研究使用開(kāi)發(fā)的檢測(cè)方法，對(duì)基地采集的 2 500 份葉類(lèi)蔬菜樣品進(jìn)行了測(cè)試，其中菠菜的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染率最高(5%)，其次是生菜(3%)和油菜(1%)。菠菜、生菜的污染率較高可能是因?yàn)橛糜谧魑锷a(chǎn)的土壤常用動(dòng)物糞便(肥料)進(jìn)行改良，其中潛在含有致病菌，且靠近被污染土壤表面的菠菜和生菜葉表面積較大[2,28]。還有研究表明，灌溉水和雨水的水滴也會(huì)將土壤顆粒帶到葉面上，導(dǎo)致污染[29]。此外，該菌的病死率較高(20%～30%)，而某些易被該菌污染的葉類(lèi)蔬菜(生菜、大白菜)卻常被生食，這顯然是李斯特菌病的潛在傳播途徑之一，應(yīng)引起消費(fèi)者和相關(guān)監(jiān)管部門(mén)的關(guān)注[30]。總體上，本研究建立的快速、靈敏、特異的檢測(cè)方法有助于更好地了解掌握葉類(lèi)蔬菜中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的流行情況且無(wú)需前增菌，省時(shí)省力，能提供更多可重復(fù)性結(jié)果，有助于預(yù)防和降低單核細(xì)胞增生李斯特氏菌對(duì)公眾健康造成的危害。

4 結(jié)論

本研究將β-CD和牛乳蛋白包被活性炭用于PCR樣品前處理，無(wú)需前增菌，可在4 h內(nèi)快速、靈敏、特異地檢測(cè)葉類(lèi)蔬菜中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。該方法操作簡(jiǎn)便，能克服葉類(lèi)蔬菜復(fù)雜基質(zhì)的干擾，可作為分析實(shí)驗(yàn)室的一個(gè)實(shí)用可靠的診斷工具。也可為葉類(lèi)蔬菜的質(zhì)量安全，消費(fèi)者的健康提供切實(shí)保障，同時(shí)為食源性單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。