超高效液相色譜-三重四極桿質譜法同時測定 豆制品中12種堿性染料

林顯活，吳正雙，梁熾瓊，羅瑞漣

（佛山市食品藥品檢驗檢測中心，廣東佛山 528000）

近年來堿性染料被非法添加到食品中的事件已屢見不鮮，這些染料比食品添加劑中著色劑更容易染色，染色后顏色艷麗，不易褪色，且價格便宜，因此一些不法廠商將其違法使用在肉制品、豆制品、辣椒制品和火鍋底料等食品中。這些堿性染料含有大量苯環(huán)及其衍生物，具有強致癌及潛在致癌性，我國已嚴禁將這些染料用于食品加工生產。

目前檢測堿性染料的常用方法主要有高效液相色譜法[1-2]、高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜法[3-5]和高效液相色譜-飛行時間串聯(lián)質譜法[6-7]。由于食品種類繁多、基質復雜，高效液相色譜法容易出現(xiàn)干擾峰，化合物定性時可能會出現(xiàn)假陽性；高效液相色譜-飛行時間串聯(lián)質譜法具有高通量快速篩的優(yōu)勢，但定量方面準確性不高。目前相關的研究主要集中在調味品和肉制品，豆制品作為工業(yè)化程度低、保質期相對較短的食品，尤其紅豆腐乳及膨化豆制品更容易被非法添加這類物質。因此，建立一種能夠同時測定豆制品中多種堿性染料的高通量方法十分必要。本研究對豆制品樣品前處理方法、液相色譜條件和質譜條件進行了優(yōu)化，開發(fā)了一種同時測定12種堿性染料的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（Ultra High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆腐、豆干、腐竹、紅豆腐乳以及膨化豆制品，購自農貿市場和大型超市。

分散橙11、分散橙1、分散橙3、分散橙37、分散黃3、二甲基黃、二乙基黃、堿性橙22、堿性橙21、堿性嫩黃O、羅丹明B以及蘇丹橙G標準品（純度均≥90%），上海道垚測試技術有限公司；乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜純），上海安譜實驗科技服務有限公司；HLB固相萃取柱（3 mL，60 mg）；陽離子交換固相萃取小柱（MCX，3 mL，60 mg）；C18固相萃取小柱（3 mL，200 mg），美國Waters公司；QuEChERS凈化小管（填料為無水硫酸鎂、PSA和C18混合物），美國安捷倫。

1.2 儀器與設備

SCIEX 5500超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀，美國SCIEX公司；LabTech MV5氮吹儀，北京萊伯泰科公司；高速冷凍離心機，德國SIGMA。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱取12種標準品各1.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，均配制成100 μg/mL的單標儲備液，置于-18 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?，根?jù)需要用流動相逐級稀釋成合適濃度的混合標準工作溶液備用。

1.3.2 樣品提取

稱取試樣1～2 g（精確至0.01 g）至50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋1 min，超聲提取20 min (超聲過程中可不時振搖)，渦旋混勻，10000 r/min離心5 min，上清液轉入另一干凈的50 mL離心管中，重復提取一次，合并上清液，待凈化，必要時用乙腈飽和的正己烷除油。

1.3.3 凈化

依次用3 mL甲醇、3 mL水活化HLB固相萃取小柱，將上清液過柱，待其自然流盡后，依次用 2 mL水、2 mL甲醇+水（1+1）淋洗小柱并壓干，最后用6 mL甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，流速控制在1 mL/min。洗脫液在50 ℃水浴下氮氣吹干，準確加入1 mL甲醇+水（1+1）溶解殘渣，渦旋1 min，經 0.2 μm有機相濾膜過濾，供UPLC-MS/MS上機分析。

1.3.4 液相色譜條件

色譜柱：WatersAcquity UPLC BEH C18（50 mm× 2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：35 ℃；進樣體積：2 μL；流動相：0.1%的甲酸-水溶液（A）和乙腈（B）；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫，洗脫程序：0～1.0 min， 70%A；1.0～5.5 min，70%A～5%A；5.5～6.0 min， 5%A；6.0～6.1 min，5%A～70%A；6.1～7.0 min， 70%A。

1.3.5 質譜條件

電離方式：電噴霧正離子（ESI+）模式；掃描方式：多反應監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；離子化電壓：5500 V；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣（Curtain Gas）：35 psi；霧化氣（Gas1）：50 psi，輔助氣（Gas2）：55 psi。

1.3.6 標準曲線繪制

按照優(yōu)化后的儀器條件，用凈化后的空白基質溶液配制12種堿性染料混合系列標準溶液經自動進樣上機測定，以濃度（ng/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優(yōu)化

配制濃度均為100 ng/mL的12種堿性染料的混合標準溶液，采用注射泵直接進樣的方式，在正離子模式下先后找到各母離子和特征子離子，并對去簇電壓和碰撞電壓進行優(yōu)化，得到最佳質譜參數(shù)，見表1。

表1 12種堿性染料的多反應監(jiān)測（MRM）質譜參數(shù)

2.2 液相條件的優(yōu)化

質譜電離方式為電噴霧正離子掃描（ESI+），流動相中添加帶正電荷的離子如H+或NH4+等能夠促進化合物的電離，進而增強靈敏度，故本文分別比較了甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈 -5 mmol/L甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸）流動相體系對12種堿性染料的分離效果和響應值的影響。結果表明，流動相體系中含有甲酸銨時，雖然部分化合物的響應值有明顯增強，但大部分化合物的響應值下降明顯，分離效果較差，且部分化合物的峰形也較差，見圖1（a）。甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水分別為流動相時，乙腈的洗脫效果和峰形優(yōu)于甲醇，目標物的響應值也較高，見圖1（b）。

圖1 不同流動相對12種堿性染料的多反應監(jiān)測（MRM）色譜圖的影響圖

2.3 提取溶劑的選擇

12種堿性染料的極性差別較大，但都能溶于水、甲醇、乙腈和乙醇等常用溶劑，選擇一種合適的提取溶劑尤為重要。有標準和文獻顯示，羅丹明B用乙酸乙酯-環(huán)己烷或正己烷提取，經凝膠滲透色譜系統(tǒng)凈化，實驗浪費大量有機試劑，且檢出限高，不能滿足快速省時和高靈敏度的要求[8]；正己烷和丙酮對堿性染料的提取效率較差，回收率在40%以下。因此本實驗采用水、甲醇、乙醇和乙腈作為提取溶劑，并比較了其提取效果，發(fā)現(xiàn)水的提取效果最差，尤其是對含油多的樣品；甲醇和乙醇在提取出目標物質的同時也提取出更多的極性雜質和色素，不利于下一步的凈化，也容易導致回收率下降；采用乙腈提取，凈化后的樣液較為干凈，12種堿性染料的回收率也高。故本實驗采用乙腈為提取溶劑。

2.4 凈化條件的選擇

豆制品如豆腐、油豆腐、腐竹、豆皮、豆干和腐乳等一般含有大量的脂肪、色素、蛋白質等大分子物質及其他雜質，經提取后，這些物質會隨著目標物一并提取出來，對色譜柱、質譜儀離子源及四極桿質譜污染較大，因此很有必要對樣品提取液進行凈化。

如圖2所示，強陽離子交換柱和C18固相萃取柱都有一定的凈化效果，MCX固相萃取柱對少油型的火鍋底料凈化效果優(yōu)于C18固相萃取柱；但對多油型的豆制品，C18固相萃取柱的凈化效果優(yōu)于MCX柱。HLB固相萃取柱的填料為N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物，是反相和陽離子交換的復合模式，對絕大部分樣品的凈化效果均比較好。商品化的QuEChERS凈化小管使用方便，但是回收率比較低，凈化效果不太理想。故本實驗選用HLB固相萃取柱凈化樣品。

圖2 固相萃取柱對12種堿性染料凈化效率的影響

2.5 基質效應的影響

本實驗采用腐竹、豆干、油豆腐實際空白樣品，用凈化后的樣品溶液配制一定濃度的系列標準溶液，上機測試，繪制標準曲線得到斜率k1；然后用溶劑配制相同濃度的系列標準溶液上機測試，繪制標準曲線得到斜率k2，計算k1/k2的比值f，以反映凈化前后基體對目標物的影響，比值f大于1為基質增強效應，小于1則為基質抑制效應。結果表明，經過萃取柱凈化后，可顯著降低多數(shù)染料的基體抑制 效應。

2.6 方法學驗證

2.6.1 線性范圍和檢出限

12種堿性染料的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)和檢出限見表2。本實驗以空白樣品添加低濃度標準溶液，使各化合物濃度水平均為0.2～0.5 μg/kg，按照1.3中的方法均平行測定10次，分別計算出10次測定結果的標準偏差，以標準偏差的3倍作檢出限(置信水平P=95%)，得到各化合物的檢出限。然后，按照1.3中的方法驗證，結果顯示，添加對應檢出限濃度的樣品，在UPLC-MS/MS上仍然有明顯響應，且信噪比（S/N）均大于3。

表2 12種堿性染料的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)和檢出限

2.6.2 回收率和精密度

按照實驗測定步驟，采用腐竹、紅豆腐乳兩種具有代表性的豆制品作為研究對象，在空白樣品中分別添加高（10 μg/kg）、中（5 μg/kg）、低（1 μg/kg）3個濃度進行加標回收實驗，每個濃度平行測定6次，考察方法精密度。結果表明，在不同加標濃度條件下，不同的樣品中，兩種化合物的加標回收率為74.6%～93.5%，精密度（RSD）為4.9%～9.5%，能夠滿足日常檢測工作的需要。

3 結論

本實驗以豆制品類食品為研究對象，優(yōu)化了前處理方法和液相色譜及質譜條件，考察了基質效應。采用乙腈提取樣品，HLB固相萃取柱凈化，UPLC-MS/MS法定性和定量。結果表明，該方法前處理過程簡便、穩(wěn)定可靠，回收率為74.6% ～93.5%，精密度（RSD）為4.9%～9.5%；檢出限低，為0.1～0.5 μg/kg。 該方法適用于不同類別的豆制品的檢測，可同時定性和定量測定其中的12種堿性染料，能夠滿足檢驗檢測機構的日常檢測工作要求，為豆制品的安全監(jiān)測提供了有效的技術手段。