對(duì)高效液相色譜法檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)思考

馬 倩，胡自釗

（安康市質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西安康 725000）

高效液相色譜儀是一種高壓、高速、高效和高靈敏度的檢測(cè)儀器，尤其適合高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子質(zhì)量大的有機(jī)物的定量和定性分析，在醫(yī)藥、環(huán)保、生命科學(xué)和食品安全檢測(cè)中被廣泛運(yùn)用[1-3]。但在實(shí)際操作中，受目標(biāo)檢測(cè)物含量低和樣品成分復(fù)雜的影響，會(huì)出現(xiàn)漏檢、錯(cuò)檢、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等現(xiàn)象。本文通過剖析高效液相色譜法檢測(cè)經(jīng)常出現(xiàn)的問題，提出檢測(cè)分析的技術(shù)要點(diǎn)和控制措施，并對(duì)有問題的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，以提高高效液相色譜檢測(cè)技術(shù)水平，滿足食品安全監(jiān)管需要。

1 高效液相色譜法檢測(cè)過程中存在的問題

液相色譜檢測(cè)是以色譜峰的保留時(shí)間來進(jìn)行定性分析，同一物質(zhì)在同一色譜條件下應(yīng)有相同的保留時(shí)間。但在實(shí)際食品添加劑檢測(cè)中經(jīng)常會(huì)遇到復(fù)雜基質(zhì)樣品，由于雜質(zhì)成分與待測(cè)化合物性質(zhì)相似或接近，就可能在色譜行為上表現(xiàn)一致，即使完全按照檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作，也有各種因素干擾結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)于這些峰，僅靠保留時(shí)間定性，容易出現(xiàn)漏檢、錯(cuò)檢、數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確和檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等問題。①漏檢是不能檢出該檢的組分，特別是低含量和復(fù)雜的組分，如黃曲霉毒素，毒性大、含量低，容易漏檢。②錯(cuò)檢是對(duì)檢測(cè)結(jié)果的誤判，得出錯(cuò)誤結(jié)論，俗稱“假陽性”。③數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確是檢測(cè)數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離真值，甚至忽高忽低，不能真實(shí)反映出樣品內(nèi)組分情況。④檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)是在檢測(cè)樣品多、指標(biāo)多的情況下，從樣品進(jìn)入預(yù)處理到出具檢測(cè)報(bào)告的時(shí)間長(zhǎng)，甚至超過法定時(shí)限。因此，快速、準(zhǔn)確地應(yīng)用色譜分析來定性、定量目標(biāo)物是檢測(cè)機(jī)構(gòu)獲取準(zhǔn)確、可靠的分析數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。

2 高效液相色譜法檢測(cè)技術(shù)的質(zhì)量控制

2.1 樣品前處理

前處理包括取樣、制樣、提取和凈化。正確的樣品前處理是保障檢測(cè)數(shù)據(jù)科學(xué)、準(zhǔn)確的第一步。不正確、不規(guī)范的預(yù)處理可能導(dǎo)致譜圖產(chǎn)生雜峰、詭峰，影響目標(biāo)峰的分析。嚴(yán)格控制預(yù)處理過程，盡力減少雜峰，突出目標(biāo)物，避免在目標(biāo)物出峰位置有干擾峰，造成假陽性的錯(cuò)誤檢測(cè)結(jié)論[4-5]。

取樣要有代表性，嚴(yán)格按照規(guī)程進(jìn)行混勻、縮分。①根據(jù)樣品狀態(tài)來制樣。固體要將其粉碎后再混勻；液體樣品制備前要搖勻；結(jié)晶樣品溶解后攪拌均勻，如有結(jié)晶析出的蜂蜜樣品，需將樣品的瓶蓋旋緊后置于水浴（溫度不超過60 ℃）中溫?zé)?，待蜂蜜樣品全部溶化后攪勻、冷卻，再稱取樣品，從而保證樣品性質(zhì)的一致性。②根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的不同來制樣，如堅(jiān)果炒貨食品，檢測(cè)污染物時(shí)需去殼處理，檢測(cè)添加劑時(shí)則需帶殼處理。

2.2 選擇合適的檢測(cè)方法

樣品的特性千差萬別，選擇準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是保障結(jié)果準(zhǔn)確的必要手段，這就需要結(jié)合產(chǎn)品特性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求選擇合規(guī)、合理的檢測(cè)方法。此外，應(yīng)及時(shí)關(guān)注最新出臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)，若有變更，則需按照變更后的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行環(huán)境、人員、設(shè)備和方法的驗(yàn)證，確認(rèn)具備實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?，再按照變更的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 對(duì)儀器、試劑進(jìn)行有效控制

2.3.1 對(duì)儀器的控制

為了保證儀器設(shè)備的日常使用和維護(hù)，檢驗(yàn)室應(yīng)指定儀器的管理人員，并明確職責(zé)。儀器的操作者必須通過培訓(xùn)、考核后上崗，熟知儀器的工作性能、操作規(guī)程和安全指標(biāo)。檢測(cè)儀器必須進(jìn)行計(jì)量檢定，檢定合格后，方能進(jìn)行檢測(cè)工作。通常要求在兩次檢定周期內(nèi)至少開展1次期間核查，針對(duì)使用頻率較高的儀器，儀器使用人員應(yīng)增加核查頻次，監(jiān)測(cè)儀器的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，把控正常損耗對(duì)儀器檢測(cè)結(jié)果的影響。此外，做好儀器的日常維護(hù)，完成相關(guān)記錄。

2.3.2 對(duì)試劑的控制

實(shí)驗(yàn)室要有試劑管理規(guī)程，并按要求分類儲(chǔ)存，如避光、冷藏、有毒有害和易燃易爆等要有相應(yīng)的儲(chǔ)存地點(diǎn)，并明示標(biāo)簽。對(duì)于在使用或保管中的標(biāo)準(zhǔn)品需進(jìn)行期間核查，通過質(zhì)量控制保證標(biāo)準(zhǔn)品量值的準(zhǔn)確可靠以及可溯源性[6]。

2.4 優(yōu)化檢測(cè)環(huán)境

檢測(cè)環(huán)境條件對(duì)液相色譜檢測(cè)的準(zhǔn)確性有重要影響，如環(huán)境溫度的不穩(wěn)定會(huì)影響流動(dòng)相的黏度，導(dǎo)致保留時(shí)間發(fā)生變化，影響檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性[7-8]。因此，做好日常監(jiān)測(cè)和記錄，保證檢測(cè)環(huán)境符合檢測(cè)需求。同時(shí)，保持檢測(cè)環(huán)境的整潔，避免樣品間的交叉污染，有助于提高檢測(cè)效率。

2.5 提高檢測(cè)人員的操作水平

檢測(cè)員在檢測(cè)過程中應(yīng)嚴(yán)格按照法律法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程都要保持科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鲬B(tài)度，做到過程有記錄、結(jié)果可追溯。檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)制定人員培訓(xùn)計(jì)劃，持續(xù)有效的培訓(xùn)有助于提升檢測(cè)人員的檢測(cè)水平。此外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)多組織檢測(cè)員參加外部的能力驗(yàn)證和內(nèi)部的質(zhì)量控制考核，通過盲樣考核、比對(duì)實(shí)驗(yàn)、加標(biāo)回收和留樣復(fù)測(cè)等手段確保檢測(cè)員具備相應(yīng)的檢測(cè)能力。

2.6 檢測(cè)儀器的維護(hù)與保養(yǎng)

科學(xué)的維護(hù)和保養(yǎng)可延長(zhǎng)高效液相色譜儀的使用壽命、提高其運(yùn)行效率。①嚴(yán)格按照要求規(guī)范開關(guān)機(jī)，開機(jī)完畢后、開始檢測(cè)前要進(jìn)行全面檢查，保證設(shè)備處于良好狀態(tài)，不會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生不良影響。關(guān)機(jī)時(shí)切忌亂丟亂放，以免在下次使用時(shí)出現(xiàn)誤差，影響檢測(cè)結(jié)果。②注意維護(hù)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，不能僅在工作時(shí)保證適宜的溫度和濕度，即使不工作時(shí)也要關(guān)注實(shí)驗(yàn)室的溫度和濕度變化，以免造成設(shè)備故障或檢測(cè)數(shù)據(jù)不穩(wěn)定。

3 可疑結(jié)果的綜合分析

高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果往往會(huì)出現(xiàn)數(shù)值不準(zhǔn)確、錯(cuò)檢（假陽性）等情況，嚴(yán)格、規(guī)范地進(jìn)行預(yù)處理是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的基礎(chǔ)。遇到可疑樣品時(shí)，應(yīng)考慮制樣是否完備，標(biāo)準(zhǔn)是否正確執(zhí)行，前處理過程是否準(zhǔn)確，判定是否合理。排除這些因素后，進(jìn)行可疑樣品復(fù)測(cè)，可采取以下手段進(jìn)一步確認(rèn)。

3.1 調(diào)整色譜條件

有的樣品比較復(fù)雜，會(huì)出現(xiàn)雜質(zhì)峰，干擾結(jié)果判定，可通過調(diào)整流動(dòng)相比例，消除雜質(zhì)峰的影響，準(zhǔn)確地進(jìn)行定性分析。例如，在檢測(cè)肉制品中的防腐劑時(shí)，按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016）的要求，流動(dòng)相為甲醇+乙酸銨，比例為5∶95，曾出現(xiàn)雜質(zhì)峰影響苯甲酸的定性，將流動(dòng)相甲醇+乙酸銨的比例調(diào)整為10∶90，雜質(zhì)峰偏離苯甲酸出峰位置，有效避免了苯甲酸的錯(cuò)檢。

3.2 加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

在樣品前處理時(shí)添加標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)比保留時(shí)間、色譜峰、色譜峰面積的變化，對(duì)可疑檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行有效分辨。例如，在豆干樣品初測(cè)時(shí)檢出苯甲酸，根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》 （GB 2760—2014），豆干中不允許添加苯甲酸，因此需進(jìn)行樣品復(fù)測(cè)。通過重新制備樣，加標(biāo)復(fù)測(cè)后，苯甲酸標(biāo)液峰和干擾峰分離，判定初測(cè)為假陽性。

3.3 使用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)

通過保留時(shí)間和光譜信息圖進(jìn)行綜合定性。當(dāng)保留時(shí)間附近有可疑色譜峰出現(xiàn)時(shí)，比較標(biāo)準(zhǔn)溶液光譜圖與樣品處理液光譜圖的重合性，能夠進(jìn)一步確證可疑色譜峰是否是目標(biāo)待測(cè)物。例如，按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016）中的第一法——液相色譜法，采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)樣品中的苯甲酸進(jìn)行測(cè)定，分別采集色譜圖和光譜圖，將樣品處理液與標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖進(jìn)行比較，以保留時(shí)間定性，若有檢出，則結(jié)合樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液光譜圖，從峰起點(diǎn)、峰頂點(diǎn)和峰落點(diǎn)再次確認(rèn)。若樣品光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)溶液的光譜圖完全不重合，可確證樣品的檢出結(jié)果為假陽性；若光譜圖完全重合，可確證樣品為陽性檢出。因此，結(jié)合保留時(shí)間和光譜圖進(jìn)行綜合分析判定，可有效保證樣品檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

3.4 液質(zhì)聯(lián)用

由于受價(jià)格和耗材的限制，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜設(shè)備沒有得到廣泛應(yīng)用，但它的優(yōu)勢(shì)非常突出。它既能利用高效液相色譜對(duì)復(fù)雜化合物的分離能力，又綜合了高分辨率質(zhì)譜對(duì)化合物的準(zhǔn)確定性和定量，能夠同時(shí)測(cè)定多種化合物，且分析結(jié)果的靈敏性和準(zhǔn)確性都能得到保障。童蘭艷等[9]采用高效液相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定食品中的9種甜味劑（甜蜜素、安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、阿力甜、三氯蔗糖、甜菊糖苷、愛德萬甜和紐甜），與國家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法相比，分離效果好、靈敏度高，明顯提高了檢測(cè)效率。

4 結(jié)語

食品檢測(cè)面臨著新要求、新挑戰(zhàn)、新形勢(shì)，高效液相色譜技術(shù)憑借其準(zhǔn)確性高、靈敏度好、分辨率高的優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)獸藥殘留、食品添加劑、非法添加物、霉菌毒素、氨基酸和糖類檢測(cè)中，但因其操作要求高，未能廣泛普及，如很多市、縣檢測(cè)機(jī)構(gòu)的高效液相色譜儀被閑置，沒能發(fā)揮出其應(yīng)有的作用。

隨著科學(xué)技術(shù)水平的提高，不管是國家檢測(cè)機(jī)構(gòu)還是第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)，都在不斷完善儀器檢測(cè)管理制度。在實(shí)際操作中正確運(yùn)用高效液相色譜法的技術(shù)要點(diǎn)，使儀器的功能和特點(diǎn)最大限度地被發(fā)揮和利用，才能提高高效液相色譜技術(shù)的使用率和準(zhǔn)確率，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，更好地監(jiān)管食品安全，真正做到讓老百姓吃得放心。