YAP1在稽留流產(chǎn)絨毛中的表達(dá)及對(duì)JAR細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

王華倩 余亞君 張 濤 潘海滔 何 堯

(1.紹興文理學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 紹興312000；2.紹興市婦幼保健院，浙江 紹興 312000)

稽留流產(chǎn)(Missed Abortion，MA)是指胚胎或胎兒死亡后未及時(shí)排出者[1].近年來，隨著三胎政策放開后高齡孕婦的增多，其發(fā)病率逐年上升[2]，給廣大育齡婦女及其家庭造成了很大的心理負(fù)擔(dān)[3].人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞分化障礙是導(dǎo)致多種妊娠并發(fā)癥的關(guān)鍵因素[4].

Hippo通路是指近年來研究較多的參與組織發(fā)育、干細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等的信號(hào)通路，其核心成分L 型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(L-Type Amino Acid Transporter，LAT)[5]、Yes相關(guān)蛋白(Yes-Associated Protein, YAP)[4]、TEA 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子 4(TEA Domain Transcription Factor 4，TEAD4)[6]等已經(jīng)被證實(shí)在胚胎植入中發(fā)揮重要作用.YAP1作為該通路下游主要的效應(yīng)分子，在Hippo信號(hào)通路中的某些分子出現(xiàn)突變時(shí),會(huì)處于超激活狀態(tài),促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移與侵襲[7].余超等[8]研究發(fā)現(xiàn)，YAP1的突變體與稽留流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系，敲除YAP1的卵母細(xì)胞雖然能夠正常成熟和受精，但胚胎發(fā)育遲緩，并在3～4天內(nèi)死亡，表明YAP1可能參與了早期胚胎的形成.

JAR細(xì)胞與其起源的滋養(yǎng)細(xì)胞保持著極為相似的生物學(xué)特性，如侵襲組織及血管，被很多學(xué)者用來研究滋養(yǎng)細(xì)胞功能相關(guān)的調(diào)控機(jī)制[9]，Biswarup等[10]研究發(fā)現(xiàn)YAP在人胚胎干細(xì)胞和JAR細(xì)胞均有強(qiáng)烈表達(dá).因此，本研究擬通過建立人胎盤絨毛癌JAR細(xì)胞模型，采用siRNA技術(shù)干擾下調(diào)模型中YAP1的表達(dá)，探討YAP1蛋白對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用及其與稽留流產(chǎn)發(fā)病的可能機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 對(duì)象

選擇2018年7月在紹興市婦幼保健院確診為稽留流產(chǎn)的患者4例為實(shí)驗(yàn)組(MT)，稽留流產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)以第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》為主，經(jīng)超聲檢查證實(shí)停育，孕周小于12周，平均年齡26歲，孕次1～3次.選擇同期自愿在該院行人工流產(chǎn)術(shù)的正常早孕婦女為對(duì)照組(MC).兩組孕婦的年齡、孕周、合并癥比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).本研究方案已獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均已簽署知情同意書.

1.2 主要試劑與儀器

JAR細(xì)胞株購自美國(guó)ATCC公司；siRNA購自銳博生物，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Matrigel購自美國(guó)BI公司，Lipo6000、FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑、BeyoFast SYBR Green qPCR Mix(2X，High ROX)、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、YAP1(AF1615)、PI3-k(AF1966)、Caspase-3(AF1213)、Caspase-9(AF1264)、Bax(AF0054)、MEK1/2(AF1057)、Akt1(AF0045)、IRS1(AF2587)、GAPDH小鼠單抗(AG019)、Tubulin抗體(AT819)均購于碧云天.二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國(guó)Thermo，實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀(RTCA)購自ACEA，PCR儀型號(hào)為珠海黑馬Hema9600.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Western Blot試驗(yàn)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證YAP1在稽留流產(chǎn)絨毛中的表達(dá)水平

將臨床收集到的兩組絨毛用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，冰上裂解30 min，4 ℃ 14 000 rpm高速離心4 min，上清液過膜，提取細(xì)胞裂解液.按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書步驟檢測(cè)YAP1蛋白濃度.取樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠配置、電泳、轉(zhuǎn)膜、剪膜，根據(jù)測(cè)定的蛋白分子量，分別孵育一抗，4 ℃過夜，12 h后TBST洗膜3次加入二抗，室溫孵育1 h，再洗滌，滴入ECL顯色液2 min后，采用軟件Sage Capture曝光顯影分析各條帶的灰度值.將提取的總RNA按FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑說明書進(jìn)項(xiàng)操作獲得cDNA，測(cè)定濃度后，根據(jù)BeyoFast SYBR Green qPCR Mix(2X，High ROX)說明，并以β-actin作為內(nèi)參基因檢測(cè)YAP1 mRNA的表達(dá).

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

采用RPMI1640培養(yǎng)基(含10% FBS)，在37 ℃ 5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)JAR細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，添加含0.25%EDTA的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代.以2×105個(gè)/孔的密度將第三代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于培養(yǎng)板上，隨機(jī)分為空白組(NC)、試劑對(duì)照組(Li)和轉(zhuǎn)染siRNA-YAP1組(siRNA-YAP1)，根據(jù)Lipo6000說明書操作，將轉(zhuǎn)染試劑加入細(xì)胞中，在37 ℃ 5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h更換完全培養(yǎng)基.轉(zhuǎn)染后采用qRT-PCR與Western Blot檢測(cè)JAR細(xì)胞中YAP1 mRNA與蛋白表達(dá)變化.

1.3.3 在細(xì)胞水平驗(yàn)證YAP1下調(diào)表達(dá)對(duì)JAR細(xì)胞特性的影響

收集轉(zhuǎn)染后的JAR細(xì)胞，消化離心后配置成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后配置成細(xì)胞數(shù)目為1×104個(gè)/100μL的細(xì)胞懸液，室溫放置30 min后，在37 ℃ 5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，使用RTCA檢測(cè)細(xì)胞增殖能力變化.裝配CIM板，同上述方法進(jìn)行細(xì)胞懸液的細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞懸液配置，然后在測(cè)好基線的CIM 板的上室孔中加入100 μL混合均勻的無血清細(xì)胞懸液，置于RTCA檢測(cè).采用預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel進(jìn)行細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)，用倒吸法加入20 μL Matrigel包被CIM-Plate上室，置于培養(yǎng)箱中約4 h包被至其凝固，后續(xù)與遷移實(shí)驗(yàn)操作一致，檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力.

1.3.4 凋亡及胚胎植入相關(guān)重要信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)方法同上，分別以Tubulin、GAPDH為內(nèi)參，采用Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白BAX、caspase-3、caspase-9和胚胎植入相關(guān)重要信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白IRS、PI3-k、Akt1、MEK1/2蛋白的表達(dá)情況.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Rrism 6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均以(ˉx±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.所有數(shù)據(jù)以三次重復(fù)的平均值±SEM表示.

2 結(jié)果

2.1 YAP1在稽留流產(chǎn)和正常早孕人流絨毛組織中的表達(dá)

qRT-PCR和Western Blot結(jié)果均顯示，與正常組織對(duì)照相比，稽留流產(chǎn)絨毛組織樣本中YAP1在基因水平和蛋白水平的表達(dá)均明顯上調(diào)，如圖1，故選擇下調(diào)YAP1表達(dá)的人JAR細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究.

(a)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；(b、c)：Western Blot 檢測(cè)；MC：正常對(duì)照組，MT：稽留流產(chǎn)組；P<0.05

2.2 轉(zhuǎn)染siRNA-YAP1后JAR細(xì)胞活性比較

與NC組和Li組相比，轉(zhuǎn)染后的JAR細(xì)胞中YAP1的表達(dá)水平顯著低于NC組和Li組，如圖2所示，表明YAP1的siRNA在JAR細(xì)胞系中成功敲減了靶蛋白YAP1，可以進(jìn)行敲低后的JAR細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的后續(xù)分析.

圖2 YAP1-si-RNA可明顯抑制JAR細(xì)胞中YAP1 的表達(dá)

2.3 下調(diào)YAP1表達(dá)抑制JAR細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，與NC組和Li組相比，si-YAP1組的增殖、遷移和侵襲能力都明顯受到了抑制，如圖3所示.

(a)YAP1調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 下調(diào)YAP1表達(dá)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白及胚胎植入相關(guān)重要信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的影響

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，YAP1的表達(dá)下調(diào)后，caspase-3和9未見明顯變化，但BAX蛋白表達(dá)上調(diào)，BAX上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生，見圖4.胚胎植入相關(guān)重要信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白中除MEK1/2未見明顯變化，其余IRS1、PI3K和Akt均表達(dá)異常，IRS1上調(diào)表達(dá)，PI3K和Akt下調(diào)表達(dá)，見圖5.這表明YAP1可能通過調(diào)控凋亡及胚胎植入相關(guān)重要信號(hào)通路影響JAR細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲.

圖4 下調(diào)YAP1表達(dá)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響

圖5 下調(diào)YAP1表達(dá)對(duì)胚胎植入相關(guān)重要信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的影響

3 討論

稽留流產(chǎn)的病因錯(cuò)綜復(fù)雜，目前認(rèn)為主要與母體、胎盤、胎兒和遺傳因素相關(guān)[11]，其中，滋養(yǎng)細(xì)胞功能受損導(dǎo)致的胎盤發(fā)育和功能不良發(fā)揮重要作用[12].細(xì)胞凋亡是機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、由基因編碼的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程[13]，幾乎發(fā)生在所有的血管內(nèi)壁細(xì)胞.絨毛組織血管腔的形成和穩(wěn)定需要適度的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，當(dāng)細(xì)胞“增殖-凋亡”的動(dòng)態(tài)平衡被打破時(shí)，會(huì)引起胎盤發(fā)育不良和母胎循環(huán)障礙，從而影響妊娠結(jié)局.

YAP1是一種抗凋亡蛋白，在子癇前期的胎盤中低表達(dá)，參與滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和凋亡[14].穿梭于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間，在缺氧等不利條件下，會(huì)被上游磷酸化，阻滯于細(xì)胞質(zhì)中，抑制增殖相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄[15].有研究[16]指出，YAP磷酸化就像胎盤發(fā)育的“剎車”，會(huì)隨著孕周的增加而升高，但過高的磷酸化水平會(huì)限制YAP向細(xì)胞核的移動(dòng)，影響下游基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙，從而引起胎兒生長(zhǎng)受限等病理妊娠.但是，目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)YAP1表達(dá)對(duì)凋亡、及滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制與稽留流產(chǎn)發(fā)病相關(guān)性的研究報(bào)道較少.

Wang等研究[16]指出，YAP蛋白異常表達(dá)會(huì)削弱滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力，影響胎盤功能從而引起胎兒生長(zhǎng).Liu等[17]通過檢測(cè)重度子癇前期胎盤中YAP1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)明顯減少，且過表達(dá)YAP1會(huì)明顯增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，證明Hippo-YAP1信號(hào)通路可能在重度子癇前期中通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和增殖能力發(fā)揮致病作用.有研究[18,19]指出，YAP和PI3K通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)在滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與凋亡中相互影響、共同調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響妊娠早期的胚胎植入過程.王細(xì)先等[20]研究發(fā)現(xiàn)，BAX表達(dá)水平高易引發(fā)妊娠胎盤組織的異常凋亡, 導(dǎo)致絨毛功能障礙和蛻膜變性壞死，參與稽留流產(chǎn)的發(fā)生.

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，YAP1下調(diào)表達(dá)顯著抑制了JAR細(xì)胞的增殖、體外遷移和侵襲能力，結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致.同時(shí)，檢測(cè)到Y(jié)AP1下調(diào)表達(dá)的JAR細(xì)胞中促凋亡蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，胚胎植入相關(guān)重要信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)下調(diào)，這與本文前期實(shí)驗(yàn)中YAP1下調(diào)表達(dá)后JAR細(xì)胞的生物學(xué)行為受到顯著抑制具有一致性與延續(xù)性.

但在臨床樣本中卻檢測(cè)到稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中YAP1蛋白和YAP1-mRNA的表達(dá)水平明顯高于正常早孕.通過查看其他學(xué)者的研究[16]，了解到過高的磷酸化水平會(huì)限制YAP1向細(xì)胞核的移動(dòng)，影響下游基因的轉(zhuǎn)錄，也會(huì)導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙，引起胎兒生長(zhǎng)受限等病理妊娠的發(fā)生.

綜上所述，本研究從細(xì)胞水平闡明YAP1參與稽留流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制的一個(gè)可能的分子機(jī)制，即YAP1蛋白異常表達(dá)，無論是異常上調(diào)，還是異常下調(diào)，都會(huì)導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡失調(diào)，損害該細(xì)胞侵襲與遷移能力，影響子宮螺旋動(dòng)脈的重塑和胚胎植入，參與稽留流產(chǎn)發(fā)生.

但是，稽留流產(chǎn)發(fā)病的具體機(jī)制是復(fù)雜的，還需要進(jìn)一步的研究.本研究未進(jìn)行過表達(dá)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在后續(xù)研究中有必要補(bǔ)充豐富.隨著越來越多學(xué)者對(duì)胎盤中相關(guān)蛋白不斷的深入研究，稽留流產(chǎn)相關(guān)發(fā)病機(jī)制也會(huì)越來越明朗，這將為臨床工作的早期診斷和預(yù)防提供新的理論依據(jù).