不同植物提取物對(duì)黃酒中有害成分的抑制

王曉雨 田潤(rùn)剛,2 楊 國(guó) 韓雪源,2

(1.紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 紹興 312000；2. 紹興市黃酒質(zhì)量安全與清潔生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；紹興黃酒釀造技術(shù)傳承與創(chuàng)新平臺(tái)，浙江 紹興 312000)

引言

黃酒是中國(guó)傳統(tǒng)酒類飲品，在世界三大釀造酒中占有重要的一席.其釀酒技術(shù)獨(dú)樹(shù)一幟，是東方釀造界的典型代表.黃酒中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，享有“液體蛋糕”的美譽(yù)，并且具有一定的保健功能[1].黃酒中富含氨基酸、糖類、維生素以

及硒、鋅、鐵、銅等多種人體必需的微量元素.此外，黃酒中特有的酚類物質(zhì)、活性肽及功能性低聚糖等均有不同程度的保健作用，因此黃酒在很大程度上滿足了人們對(duì)酒精飲品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及養(yǎng)生保健方面的需求[2].

然而，黃酒中依然存在一些具有健康隱患的危險(xiǎn)物質(zhì).例如，高級(jí)醇是黃酒產(chǎn)生香氣物質(zhì)和適宜口感的主要成分，但過(guò)多的高級(jí)醇不僅影響黃酒的口感和品質(zhì)，而且對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生一定的毒害作用[3].此外，氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，簡(jiǎn)稱EC)是一種已知的致癌物和誘變劑.與其他釀造酒相比，黃酒中的EC含量相對(duì)較高[4-5].同時(shí)，在后期的成品黃酒中，尿素將與黃酒中的乙醇發(fā)生緩慢反應(yīng)產(chǎn)生EC，因此尿素也是黃酒安全生產(chǎn)的隱患和危險(xiǎn)物質(zhì)之一.甲醇既是酒的芳香成分，也是有害成分，具有較強(qiáng)毒性，而且容易在體內(nèi)大量積累，難以及時(shí)排出，對(duì)身體損害大，尤其是對(duì)人體血管、神經(jīng)系統(tǒng)的麻痹作用較大[6].

Zhou等[7]研究表明，竹葉提取物對(duì)黃酒釀造體系中EC含量具有抑制效果，并且推測(cè)竹葉酚類物質(zhì)在其中發(fā)揮重要作用.酚類物質(zhì)富含于覆盆子提取物、火棘提取物、竹葉提取物和沙棘提取物中，是提取物的主要成分.因此，本研究嘗試將以上四種植物提取物分別添加于黃酒釀造過(guò)程中，通過(guò)對(duì)釀得酒樣的EC含量、甲醇含量、尿素含量和高級(jí)醇含量以及植物提取物的總酚含量進(jìn)行比較分析，探索不同植物提取物的添加對(duì)黃酒中有害物質(zhì)含量的影響.

1 材料與方法

1.1 黃酒發(fā)酵

將1.5 kg熟糯米、1.25 L蒸餾水、1.5 g黃酒酵母、 225 g麥曲和0.25 g乳酸鏈球菌素加入5.0 L的發(fā)酵容器中，環(huán)境溫度為28 ℃，發(fā)酵4～5天.之后設(shè)置溫度為18 ℃，進(jìn)行后發(fā)酵.在發(fā)酵第三天分別加入濃度為500 mg/L的覆盆子提取物、500 mg/L火棘提取物、500 mg/L竹葉提取物和500 mg/L沙棘提取物.以未添加植物提取物的發(fā)酵組為對(duì)照組.發(fā)酵期間，每2天用Erma手持折射儀(SDR-500)測(cè)定白利糖度(°Brix).待后發(fā)酵完成后，將酒樣進(jìn)行壓榨、澄清.

1.2 酒精度測(cè)定

采用蒸餾法測(cè)定酒精含量[8].量取100 mL的酒液加入 Gibertini DEEPV(Super DEE，GIBERTINI，意大利)快速蒸餾儀器中，蒸餾后，使用Gibertini Densimat/Alcomat2(AlcoMat-2，GIBERTINI，意大利)酒精度測(cè)定儀，測(cè)定酒精含量.

1.3 氨基甲酸乙酯含量測(cè)定

參考譚文淵等[9]，采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定黃酒中的氨基甲酸乙酯含量.并用不同濃度EC標(biāo)準(zhǔn)溶液制作峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步對(duì)酒樣中EC含量進(jìn)行相對(duì)定量.

詳細(xì)分析參數(shù)如下：流動(dòng)相， 乙腈：水=80∶20(體積比)； 流速0.8 mL/min； 檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm；柱溫20 ℃；進(jìn)樣量20 μL.用量筒準(zhǔn)確量取30 mL待測(cè)酒樣于球型滴液漏斗中，用3 mL正己烷溶液活化氨基柱，調(diào)節(jié)漏斗開(kāi)關(guān)，緩慢將30 mL酒樣通過(guò)活化好的氨基柱，再將5 mL甲醇/乙酸乙酯(2/3，體積比)溶液淋洗萃取柱后，用8 mL甲醇/乙酸乙酯(2/3，體積比)溶液洗脫萃取柱，將淋洗液和洗脫液合并裝入圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，用乙腈定容至2 mL，待HPLC分析.

1.4 高級(jí)醇含量測(cè)定

通過(guò)氣相色譜儀對(duì)酒樣中的高級(jí)醇含量進(jìn)行分析[10]，以各種高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)液為參照，通過(guò)制作峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步對(duì)酒樣中各高級(jí)醇含量進(jìn)行相對(duì)定量.詳細(xì)分析參數(shù)如下：色譜柱為DB-WAX毛細(xì)管柱(30.0 mm×0.25 mm ID，0.25 μm)；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：10∶1；線速度：24.9 cm/sec；色譜柱流量：0.94 mL/min；總流量13.4 mL/min；氣化室溫度：250 ℃；檢測(cè)器溫度：250 ℃.升溫過(guò)程：初始溫度50 ℃，恒溫1 min后以5 ℃/min升溫至90 ℃，再恒溫1 min后以15 ℃/min升溫至230 ℃，再恒溫3 min.

1.5 甲醇含量測(cè)定

采用品紅-亞硫酸法對(duì)酒樣中的甲醇含量進(jìn)行測(cè)定[11].

1.6 尿素含量測(cè)定

采用二乙酰一肟方法對(duì)酒樣中的尿素含量進(jìn)行測(cè)定[2].

1.7 植物提取物總酚含量測(cè)定

四種植物提取物過(guò)80目篩，分別稱取5.0 g于錐形瓶中，加入50 mL色譜級(jí)甲醇，放置于超聲提取器中提取45 min(40 ℃，350 W)，提取完成后，于4 ℃冷凍離心10 min(8 000 rpm)后取上清液，重復(fù)上述過(guò)程三次.合并提取液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，用甲醇定容至25 mL.于4 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意避光操作.

采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定植物提取物中總酚含量，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品.準(zhǔn)確吸取不同濃度沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液和多酚提取液各0.1 mL于具塞試管中，依次加入7.9 mL蒸餾水，0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，混勻后反應(yīng)5 min，加入20%(w/v)Na2CO3溶液1.5 mL，暗處反應(yīng)2 h后于765 nm處測(cè)定吸光值.總酚含量表示為mg GAE/ 100g dw (干重)[12].

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù).實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值加上或者減去標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示.采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行差異顯著性(Duncan檢驗(yàn))分析，在0.05水平上，用不同小寫字母表示差異顯著性.并采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，在0.05水平(雙尾)上，用“*”表示顯著性相關(guān).

2 結(jié)果

本研究中所釀造酒樣的乙醇含量(%(v/v))如下：對(duì)照組17.94±0.311%、覆盆子組16.25±1.103%、火棘組16.90±1.530%、竹葉組17.93±0.773%、沙棘組17.50±0.277%.覆盆子組和火棘組的酒精含量略低于其他三組.各組樣品均有較高的酒精含量，說(shuō)明試驗(yàn)具有較好發(fā)酵效率.

2.1 不同植物提取物對(duì)EC含量的影響

通過(guò)不同濃度EC標(biāo)準(zhǔn)液的HPLC分析如圖1(a)所示，得到峰面積與濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=38 971x-6 550，R2=0.999 4)，進(jìn)一步結(jié)合樣品液相色譜EC峰面積(圖1(b)),計(jì)算得到各組酒樣中EC含量(表1).結(jié)果顯示，覆盆子組的EC含量(21.942±6.895 μg/L)最低，而竹葉組的EC含量顯著高于其他組.

(a)EC標(biāo)準(zhǔn)液液相色譜圖

表1 酒樣中EC、甲醇、尿素含量

2.2 不同植物提取物對(duì)甲醇含量的影響

對(duì)黃酒而言，釀酒原料中含有的果膠質(zhì)是甲醇生成的基礎(chǔ)，它主要集中在原料的表皮，例如米麥的表面.由表1可知，對(duì)照組甲醇含量(0.537±0.252 mg/L)最高， 而覆盆子組的甲醇含量(0.289±0.088 mg/L)最低，顯著低于對(duì)照組.

2.3 不同植物提取物對(duì)尿素含量的影響

如表1所示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組尿素含量均有所降低，并且覆盆子組、火棘組、竹葉組酒樣中尿素含量顯著低于對(duì)照組，其中覆盆子組尿素含量最低(21.183±2.365 mg/L).

2.4 不同植物提取物對(duì)高級(jí)醇含量的影響

黃酒中高級(jí)醇含量過(guò)高會(huì)破壞其風(fēng)味的協(xié)調(diào)性，甚至?xí)?duì)人體造成危害.在本研究中，通過(guò)氣相色譜法對(duì)黃酒中的高級(jí)醇進(jìn)行分析，由圖2可得各高級(jí)醇出峰時(shí)間，順序依次為：正丙醇5.208 min、異丁醇6.307 min、正丁醇7.648 min、異戊醇8.947 min、正戊醇10.020 min、苯甲醇18.045 min、苯乙醇18.343 min.與對(duì)照組相比，所有試驗(yàn)組中異丁醇、苯乙醇含量均有所降低，其中火棘組異丁醇含量顯著低于其他組.火棘組和沙棘組酒樣中除正戊醇外，其他高級(jí)醇含量均低于對(duì)照組，且火棘組中異戊醇含量最低.同時(shí)，火棘組的高級(jí)醇總含量最低(表2).

圖2 高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)液氣相色譜圖

表2 酒樣中的高級(jí)醇含量

2.5 相關(guān)性分析

對(duì)植物提取物的總酚含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表3所示， 其中竹葉提取物的總酚含量最高(0.410±0.013 mg GAE /100 g)，其次是覆盆子提取物(0.265±0.011 mg GAE /100 g).對(duì)植物提取物總酚含量與酒樣有害物質(zhì)含量進(jìn)行相關(guān)性分析，Pearson相關(guān)性分析顯示，植物提取物的總酚含量與酒樣尿素含量呈顯著負(fù)相關(guān)性，酒精含量與EC含量呈顯著正相關(guān)性(圖3).

圖3 植物提取物總酚含量與酒樣中有害物質(zhì)含量的相關(guān)性分析

表3 植物提取物的總酚含量

3 討論

黃酒的釀造過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生或引入一些不利于人體健康的物質(zhì), 如EC、 高級(jí)醇、 甲醇、 尿素等，這些有害物質(zhì)在一定程度上影響了黃酒的品質(zhì)，制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展[13].研究顯示，酚類物質(zhì)的添加有助于降低黃酒中有害物質(zhì)含量[4,14-15].植物提取物中富含大量酚類物質(zhì)，是一種高效的天然抗氧化劑，能有效預(yù)防高血脂、高血糖、心腦血管疾病、腫瘤等慢性疾病，廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[16-17].因此，本研究在前人研究基礎(chǔ)上，嘗試在黃酒發(fā)酵過(guò)程中分別添加覆盆子提取物、火棘提取物、竹葉提取物和沙棘提取物，探索其對(duì)黃酒有害成分含量的抑制.結(jié)果表明，植物提取物對(duì)黃酒部分有害成分的產(chǎn)生具有一定抑制效果，并根據(jù)相關(guān)性分析推測(cè)植物提取物中的酚類物質(zhì)可能起到重要作用.

EC，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為可能令人類患癌的物質(zhì)，其產(chǎn)生途徑主要是氨甲?；衔?乙醇途徑，比如尿素-乙醇反應(yīng)、瓜氨酸-乙醇反應(yīng)、氨甲酰磷酸-乙醇反應(yīng).本研究表明，添加覆盆子提取物降低了黃酒中的EC含量.這與Zhou等[7]的研究結(jié)果相類似，竹葉提取物的添加降低了酒體中EC含量.周萬(wàn)怡[18]研究顯示，添加沒(méi)食子酸和原兒茶酸能顯著抑制單酵母發(fā)酵黃酒中EC的形成，而添加竹葉提取物可以抑制傳統(tǒng)黃酒釀造體系中EC的形成.本研究中，竹葉提取物總酚含量最高，高于覆盆子提取物，然而覆盆子組的EC含量低于竹葉組.韓煜[19]研究表明覆盆子中所含多酚成分主要為沒(méi)食子酸.因此，推測(cè)由于竹葉和覆盆子提取物中單體酚類如GC、PC等含量不同而導(dǎo)致上述EC含量和酚類總含量趨勢(shì)的不一致.相關(guān)性分析顯示，植物提取物的總酚含量與酒樣尿素含量呈顯著負(fù)相關(guān)性.尿素是發(fā)酵酒類飲料中最主要的EC前體物，黃酒中EC有90%來(lái)源于尿素與乙醇反應(yīng)[18].據(jù)此推測(cè)植物總酚含量應(yīng)與EC含量也呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，然而本研究中的相關(guān)性分析并未得到此結(jié)果，因此植物總酚含量與黃酒中EC含量的相關(guān)性有待進(jìn)一步探究.

黃酒中高含量的高級(jí)醇類是引起上頭的主要因素，且黃酒中高級(jí)醇含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他釀造酒[20].但是高級(jí)醇也是黃酒的主要風(fēng)味物質(zhì)，是釀造過(guò)程中不可避免的副產(chǎn)物.有研究表明，采用低產(chǎn)高級(jí)醇的酵母進(jìn)行發(fā)酵，能夠降低高級(jí)醇含量[21-22].也有研究顯示，添加谷氨酸會(huì)顯著影響發(fā)酵果汁的發(fā)酵過(guò)程，對(duì)荔枝酒中高級(jí)醇生成量有明顯的抑制作用[23].在本研究中，添加火棘提取物和沙棘提取物使酒樣中的大部分高級(jí)醇含量有所降低.

黃酒是富含營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的低度飲料酒，符合現(xiàn)代人由高度酒向低度、營(yíng)養(yǎng)型酒轉(zhuǎn)化的消費(fèi)趨勢(shì).因此，對(duì)黃酒中具有安全風(fēng)險(xiǎn)的物質(zhì)進(jìn)行研究并降低其含量，對(duì)提升黃酒的品質(zhì)具有重要意義.

4 結(jié)論

本研究通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中分別添加覆盆子、火棘、竹葉和沙棘植物提取物，探究植物提取物對(duì)黃酒中有害成分含量的影響.以添加的不同植物提取物作為影響因素，以酒樣中EC含量、甲醇含量、尿素含量和高級(jí)醇含量為測(cè)量指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn).結(jié)果表明添加覆盆子提取物對(duì)酒樣中EC、甲醇和尿素含量具有顯著抑制作用；其次，火棘提取物和沙棘提取物的添加對(duì)酒樣中高級(jí)醇的含量具有較好的降低效果.關(guān)于以上植物提取物的添加對(duì)黃酒中有害物質(zhì)含量影響的原理，有待于進(jìn)一步研究.