急性心肌梗死患者血漿microRNA與cTnI、H-FABP的相關(guān)性及其潛在診斷價(jià)值

于 葉 ，趙瑞平 ，李 萍

(1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭014060；2.包頭市中心醫(yī)院心內(nèi)科)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告顯示，心血管疾病是世界范圍內(nèi)死亡的主要原因。而急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)則是全球范圍內(nèi)發(fā)生的最嚴(yán)重心血管疾病之一。因此，早期和及時(shí)的診斷對控制AMI的發(fā)展和進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹委熞越档桶l(fā)病率和病死率至關(guān)重要?，F(xiàn)今，臨床上診斷AMI依據(jù)患者的癥狀、心電圖特征性改變以及生物標(biāo)志物水平。由于診斷依據(jù)的特異性具有一定的限制，因此不能有效充分地早期診斷AMI。所以，在時(shí)間窗內(nèi)尋找更敏感、更特異、更有針對性的診斷標(biāo)志物用于AMI的早期診斷迫在眉睫。

MicroRNAs(miRNAs)是存在于物種中具有高度保守性的小型非編碼 RNA(ncRNAs)，主要通過信使 RNA (mRNA)的翻譯抑制或降解來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[1]。因此，測定和比較正常及病理狀態(tài)下miRNAs的表達(dá)含量對疾病的研究有重要意義?，F(xiàn)今，已經(jīng)有研究證實(shí)了miRNAs在癌癥中具有雙重功能，特別是在乳腺癌中，miRNA主要作用是參與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，因?yàn)樗鼈儽徽J(rèn)為是腫瘤的抑制因子或是致癌基因；更重要的是，miRNAs可作為乳腺癌早期診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物，與此同時(shí)還可為乳腺癌護(hù)理治療靶點(diǎn)提供新的認(rèn)識[2]。也有研究表明miRNAs參與心血管疾病的病理生理過程[3]。例如miRNA-221-3p參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，與心血管疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)[4]。迄今為止，關(guān)于 miRNA在AMI中的研究報(bào)道了miRNA-208和miRNA-499在AMI后上調(diào)[5]，但miRNA-221-3p在AMI后變化規(guī)律尚沒有明確結(jié)論且相關(guān)的研究較少。因此，本研究采用高通量測序，主要目的是探討miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p和miRNA-221-3p三種miRNAs單獨(dú)及聯(lián)合在AMI中的潛在診斷價(jià)值，從而為AMI早期診斷提供新的潛在的生物標(biāo)志物，同時(shí)也能為AMI患者提供個(gè)性化的治療方案，降低急性心肌梗死的危險(xiǎn)性及病死率。

1 對象與方法

1.1對象 連續(xù)性收集選取2018年11月—2020年12月就診于內(nèi)蒙古包頭市中心醫(yī)院心內(nèi)科診斷為急性心肌梗死患者52例為AMI組，另選取非心源性胸痛患者24例為對照組。依據(jù)歐洲心臟病學(xué)會發(fā)布的第4版心肌梗死全球統(tǒng)一定義診斷AMI[6]。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)胸痛發(fā)作6 h內(nèi)入院；(2)胸骨后疼痛時(shí)間>30 min；(3)含服硝酸酯類藥物后胸痛癥狀持續(xù)不緩解；(4)心電圖特征性改變(典型的心肌缺血征象)；(5)心肌損傷標(biāo)志物升高。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)既往MI；(2)肺栓塞、主動(dòng)脈夾層等引起的胸痛；(3)先天性心臟病、心肌病、心臟瓣膜病、心源性休克；(4)近6個(gè)月有卒中史；(5)患有嚴(yán)重疾病(如惡性腫瘤)或內(nèi)分泌代謝紊亂、急性感染、血液系統(tǒng)疾?。?6)肝腎功能不全。本研究經(jīng)包頭市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者及其家屬知情同意。

1.2方法

1.2.1樣品制備 所有受試者于入院時(shí)于肘前靜脈抽取2份外周靜脈血(各5 mL)置于抗凝的EDTA真空管中。一份用于檢測心肌損傷標(biāo)志物：肌鈣蛋白I(cTnI)、心肌脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等；一份用于總RNA提取。

1.2.2心肌損傷標(biāo)志物檢測 室溫20～25 ℃下，將抽取的外周靜脈血經(jīng)過3 500 r/min離心10 min，取100 μL上層血漿與150 μL樣本稀釋液于2 mL EP管中充分混勻，取混合物100 μL加入檢測卡加樣孔。室溫放置15 min，將檢測卡放入上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀(北京熱景生物技術(shù)股份有限公司)中進(jìn)行測量。

1.2.3總RNA提取及高通量測序 室溫20～25 ℃下，經(jīng)過1 500 r/min離心10 min，提取1 000 μL上層血漿，置于1.5 mL RNA(RNase-free)離心管中提取RNA，在-80 ℃冰箱中包裝保存。通過Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測總RNA的濃度和純度，并采用Illumina公司的TruSeq Small RNA Sample prep Kit進(jìn)行小RNA文庫構(gòu)建。然后依次通過PCR擴(kuò)增富集文庫、凝膠電泳純化文庫、Agilent High Sensitivity DNA Kit對文庫質(zhì)檢、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對文庫定量，最后通過Illumina平臺上機(jī)測序。

2 結(jié)果

2.1兩組一般資料比較 共納入76例研究對象，AMI組52例，對照組24例，兩組在年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)、吸煙史、飲酒史、高血壓病史、糖尿病病史、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesferol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesferol，LDL-C)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AMI 組中的肌紅蛋白(myohemoglobin，MYO)、心肌肌鈣蛋白I(cardiac Troponin I，cTnI)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB)及心肌脂肪酸結(jié)合蛋白(cardiac fatty acid binding protein，H-FABP)水平均高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 研究人群的臨床特征比較

2.2三種miRNAs在兩組中表達(dá)水平比較 與對照組相比，AMI 組患者血漿miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p和miRNA-221-3p的表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 三種miRNAs在兩組中表達(dá)水平比較

2.3AMI 組中三種miRNAs表達(dá)水平與cTnI、H-FABP的相關(guān)性

2.3.1三種miRNAs與cTnI的相關(guān)性 AMI組中，血漿miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p和miRNA-221-3p與cTnI的相關(guān)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三者與cTnI水平均有一定程度的正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。見表3。

表3 AMI 組中三種miRNAs表達(dá)水平與cTnI的相關(guān)性

2.3.2三種miRNsA與H-FABP的相關(guān)性 AMI組中，血漿miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p和miRNA-221-3p與H-FABP的相關(guān)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三者與H-FABP水平均有一定程度的正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。見表4。

表4 AMI 組中三種miRNAs表達(dá)水平與H-FABP的相關(guān)性

2.4三種miRNAs對AMI早期診斷的潛在價(jià)值分析 血漿miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p和miRNA-221-3p及三者聯(lián)合對AMI診斷的ROC曲線結(jié)果顯示：miRNA-208a-3p (0.794，95 %CI: 0.695-0.893)、miRNA-499a-5p (0.772，95 %CI: 0.661-0.884)、miRNA-221-3p (0.806，95 %CI: 0.710-0.901)以及三者聯(lián)合(0.862，95 %CI: 0.780-0.944)，三者聯(lián)合診斷AMI的AUC均高于三種miRNAs單獨(dú)診斷AMI的AUC。結(jié)果提示，miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p和miRNA-221-3p三者具有一定早期診斷AMI的潛力，且聯(lián)合指標(biāo)早期診斷AMI的潛在價(jià)值更高。見表 5，圖 1～4。

表5 三種miRNAs單獨(dú)及聯(lián)合對AMI的診斷情況

圖1 hsa-miR-208a-3p對AMI診斷的ROC曲線分析

圖2 hsa-miR-499a-5p對AMI診斷的ROC曲線分析

圖3 hsa-miR-221-3p對AMI診斷的ROC曲線分析

圖4 三者聯(lián)合對AMI診斷的ROC曲線分析

3 討論

AMI是冠狀動(dòng)脈血管病變最嚴(yán)重的表現(xiàn)形式。在多數(shù)情況下，AMI是由于易損性動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂或冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮被侵蝕所致[7-8]。臨床上，肌鈣蛋白I(cTnI)、心肌脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)等一些來自循環(huán)系統(tǒng)的生物標(biāo)志物被廣泛應(yīng)用于AMI的臨床診斷。H-FABP主要存在于心臟，當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生缺血損傷時(shí)，H-FABP會迅速釋放到血液中，之后由腎臟排出[9]。因此，測定血清H-FABP的表達(dá)水平可在一定程度上反映心肌損傷情況。cTnI被認(rèn)為是診斷AMI的金標(biāo)準(zhǔn)[10]，但在許多非急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)患者中也可以釋放表示急性或慢性心肌損傷肌鈣蛋白，包括嚴(yán)重的心力衰竭或房顫[11]，甚至甲狀腺功能減退、敗血癥性休克、慢性腎衰竭等情況[12]。而H-FABP的特異性不如cTnI檢測高，因?yàn)樘禺愋杂幸欢ㄏ拗?，所以它們不能充分有效診斷AMI。

理想的AMI生物標(biāo)志物應(yīng)容易獲取、并且具有高度的可預(yù)測性及可靠性，檢測方法應(yīng)快速、靈敏、準(zhǔn)確。樣本必須采用最小的侵入性方法獲取且容易獲取，例如血漿、血清和尿液，而且在血液循環(huán)中生物標(biāo)志物要具有相對較長的半衰期，以此來確保檢測的可預(yù)測性。miRNAs具有組織或細(xì)胞特異性，在體內(nèi)可以調(diào)節(jié)多種生理和病理過程，且miRNAs已經(jīng)被認(rèn)為是某些疾病的生物標(biāo)志物，例如腫瘤患者血液循環(huán)中的miRNA可用于診斷和預(yù)后[2]，因?yàn)樗鼈冊谘汉推渌w液中是穩(wěn)定的。如今在分子和遺傳水平尋找新的潛在的生物標(biāo)志物仍在研究中。高通量測序技術(shù)作為一種能夠檢測整個(gè)轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平的研究方法，將基因組學(xué)研究帶入了一個(gè)新的時(shí)代。

本文選取了miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p和 miRNA-221-3p三種miRNAs進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMI組人群的血漿中這三種miRNAs的表達(dá)水平明顯高于對照組，且與cTnI 和H-FABP水平均有一定程度的正相關(guān)關(guān)系；三者單獨(dú)及聯(lián)合診斷AMI的AUC較高，同既往的研究基本一致。表明了在AMI 發(fā)生后，三者在循環(huán)血液中的表達(dá)量增加，在心肌組織缺血損傷后很早就釋放到血液循環(huán)中。近年來，越來越多的研究表明血漿miRNAs 在 AMI 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。一項(xiàng)文獻(xiàn)報(bào)道了AMI患者的心肌組織中表達(dá)miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-208 和 miR-499，并且AMI患者的血漿中這些miRNA的表達(dá)水平明顯升高，從而顯示出這些 miRNAs 有可能成為診斷AMI新的潛在的新生物標(biāo)志物[5]。也有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA-208和miRNA-499在AMI患者血漿中的表達(dá)水平升高，且具有較高的敏感性和特異性;二者均可作為診斷心肌梗死的生物標(biāo)志物[13]。另一項(xiàng)研究表明AMI患者的血漿miRNA-499表達(dá)水平在入院后顯著高于不穩(wěn)定型心絞痛患者和健康對照人群，這項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明了miRNA-499可能是診斷AMI有價(jià)值的生物標(biāo)志物。此外，也有文獻(xiàn)報(bào)道AMI患者中血漿miR-221-3p 的表達(dá)水平增加，且與肌鈣蛋白及左心室收縮功能呈顯著相關(guān)性，因此具有早期預(yù)測AMI的潛力,可能是早期診斷AMI的有效生物標(biāo)志物[14]。本研究結(jié)果表明，AMI組中血漿miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p、miRNA-221-3p表達(dá)水平較對照組明顯升高，且三種miRNAs與cTnI、H-FABP呈一定正相關(guān)；在早期診斷AMI時(shí)，三者單獨(dú)早期診斷AMI的AUC分別為0.794、0.772、0.806，三者聯(lián)合早期診斷AMI的AUC為0.862，進(jìn)一步證實(shí)了血漿miRNA-208a-3p、miRNA-499a-5p、miRNA-221-3p可作為早期診斷急性心肌梗死的潛在生物標(biāo)志物,且聯(lián)合指標(biāo)的潛在診斷價(jià)值更高。

本研究仍有一定的局限性，一是樣本的數(shù)量相對較少而且具有一定的地域性，缺乏對總體的代表性；其次，miRNAs隨著心肌梗死的發(fā)生及進(jìn)展呈動(dòng)態(tài)變化，應(yīng)在不同的時(shí)間段檢測miRNAs的表達(dá)水平，在后續(xù)的研究中應(yīng)盡可能連續(xù)、動(dòng)態(tài)地檢測miRNAs的表達(dá)水平。