納米雄黃的制備及其在腫瘤治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀*

李麗莉，蘇 燕，馬 強,3,4

(1.包頭醫(yī)學(xué)院血液保護(hù)研究所，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院；3.南方科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院；4.南方科技大學(xué)醫(yī)院)

雄黃是一種硫化砷類礦物藥，具有悠久的用藥歷史，是中醫(yī)臨床常用藥物。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，雄黃主要用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療，但由于其水溶性差，生物利用度低，臨床使用劑量大，在一定程度上限制了雄黃在其他實體性腫瘤中的應(yīng)用。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米化雄黃(以下簡稱納米雄黃)有效提高了雄黃的水溶性及生物利用度。同時，其抗腫瘤藥效相比原藥進(jìn)一步增強，表現(xiàn)出更強更廣譜的抗腫瘤能力，有望在未來進(jìn)一步拓展適用范圍，在其他實體腫瘤治療中發(fā)揮更廣闊的作用。

1 雄黃在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

雄黃是中醫(yī)最早使用的礦物藥物之一，辛、性溫、有毒，歸肝、大腸經(jīng)，具有解毒殺蟲、燥濕祛痰、截瘧的功效，主要用于癰腫疔瘡、蟲蛇咬傷、蟲積腹痛、驚癇、瘧疾等證的治療[1]。我國最早的藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》對雄黃即有收載：“雄黃，主寒熱、鼠瘺惡瘡、疽痔死肌、殺精物、惡鬼、邪氣、百蟲毒，勝五兵。”其后的歷朝歷代本草對雄黃均有收載。雄黃藥效作用經(jīng)過數(shù)千年臨床應(yīng)用得到了充分肯定，迄今依然作為安宮牛黃丸、牛黃解毒片和六神丸等臨床常用成藥的主要組方藥物在中醫(yī)臨床中使用。在西方傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中也有雄黃作為藥物的使用記載，早在古希臘時代，希波克拉底便記載了雄黃具有治療潰瘍的藥效作用[2]。古羅馬時代著名醫(yī)學(xué)家蓋倫推薦使用硫化砷膏治療潰瘍[2]。文藝復(fù)興時期著名醫(yī)學(xué)家、煉金師帕拉塞爾蘇斯廣泛研究了砷類化合物的性質(zhì)和相互轉(zhuǎn)化，并嘗試使用雄黃治療癌癥[2]。

2 雄黃在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用及不足

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，雄黃主要用血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療。劉學(xué)永等[3]將43例中高危骨髓增生異常綜合征患者隨機分為治療組和對照組，治療組給予雄黃，對照組給予小劑量CAG方案化療，研究發(fā)現(xiàn)治療組總有效率(90.9 %)明顯高于對照組(71.5 %)。周慶兵等[4]通過病例資料分析發(fā)現(xiàn)，以青黃散加補脾益腎中藥為主的綜合治療方案對骨髓增生異常綜合征伴多系發(fā)育異常具有一定的臨床療效。目前，雄黃在我國已經(jīng)作為一線化療藥物應(yīng)用于急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的治療[5]。然而，由于雄黃晶格能較高、難溶于水而導(dǎo)致的生物利用度低下使其在臨床應(yīng)用中也面臨一些障礙和限制。

3 納米雄黃的制備及方法

雄黃是生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(Biopharmaceutics Classification System，BCS)Ⅱ類藥物。對于這類難溶性藥物，減小藥物粒徑至微米/納米級，是提高藥物溶解度和生物利用度的通行手段。當(dāng)難溶性藥物的粒徑減小至1 μm以下時，其溶解度會隨粒徑減小而不斷增加，特別是當(dāng)藥物粒徑減小到200 nm以下時，這種“增溶”作用更加明顯，其原理是通過降低藥物擴(kuò)散邊界層厚度以提高溶出速度[6]。當(dāng)前用于納米雄黃制備的方法主要有物理法和化學(xué)合成法兩大類。

3.1物理法 物理法制備納米雄黃，制備工藝相對簡單，可連續(xù)、大規(guī)模生產(chǎn)納米雄黃。高能球磨法是常用的物理方法，該法利用球磨機的轉(zhuǎn)動或振動，可以使硬球與原料產(chǎn)生強烈的撞擊、研磨和攪拌作用，進(jìn)而把樣品粉碎為微米或納米級粉體。王曉波等[7]通過溫度可控惰性氣氛高能球磨法制備納米雄黃，通過調(diào)整球料比、球磨時間、球磨機轉(zhuǎn)速、球磨介質(zhì)比例、球磨溫度等因素制備出了粒徑小于100 nm的雄黃顆粒。氣流粉碎法是利用高速氣流或過熱蒸汽的能量使顆粒互相沖擊、碰撞和摩擦，從而使顆粒粉碎的粉體制備方法。謝長生等[8]利用氣流粉碎技術(shù)，制備得到粒徑在1～100 nm范圍的納米雄黃。詹秀琴等[9]通過氣流粉碎、細(xì)珠研磨和微射流法制備微米/納米雄黃，制備得到粒徑在280 nm的雄黃顆粒。但由于納米雄黃體積小，表面能大，因而極不穩(wěn)定，極易重新聚合成為較大的顆粒。詹秀琴等[9]考察了羥甲基纖維素(Caboxy Methyl Cellulose，CMC)、聚乙烯比咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)、微晶纖維素、卵磷脂、吐溫80和聚乙二醇對納米雄黃顆粒水分散狀態(tài)下穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)CMC和PVP可以有效穩(wěn)定水分散液中納米雄黃。

但是劇毒副產(chǎn)物As2O3累積嚴(yán)重是物理制備方法的共性缺點，還需進(jìn)一步優(yōu)化制備過程和工藝。Zhao等[10]為解決制備產(chǎn)品中As2O3累積，采用球磨后對產(chǎn)物再次水洗、酸洗或堿洗的方式處理納米雄黃，可以有效降低納米雄黃中As2O3的含量。

3.2化學(xué)合成法 寧凝等[11]使用溶劑接力法，以二硫化碳、1,2-丙二醇和丙酮按特定比例混合后，在索氏提取器中連續(xù)回流溶解雄黃，然后將粗產(chǎn)物中的二硫化碳和丙酮蒸發(fā)，減壓濃縮，得到平均粒徑159.0 nm的納米雄黃1,2-丙二醇混懸液。陳韻[12]利用雄黃不溶于水和稀酸，但溶于堿的性質(zhì)，將雄黃用飽和硫化鈉溶液溶解。作者考察了納米雄黃在不同分散介質(zhì)中的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)納米雄黃在0.1 %的PVP中會以約20 nm的顆粒形態(tài)存在；在0.5 %的淀粉溶液中會以約30 nm的顆粒形態(tài)存在；而在5～10 mol/L牛血清白蛋白中會以約10 nm的顆粒形態(tài)存在。王子妤等[13]采用薄膜分散-高壓均質(zhì)法制備納米雄黃脂質(zhì)體，制備得到的納米雄黃脂質(zhì)體藥物包封率高(82.78 %)、顆粒分散性良好、粒徑均勻(約100 nm)?；瘜W(xué)合成法在制備過程會有一定的溶劑殘留，制備過程還會有毒性物質(zhì)如H2S的生成釋放，同時由于實驗條件、步驟相對復(fù)雜，較難用于納米雄黃的規(guī)?；a(chǎn)。

4 納米雄黃在抗腫瘤研究中的應(yīng)用

4.1納米雄黃抗乳腺癌的作用研究 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。Xi等[14]在體外、體內(nèi)水平評價了納米雄黃抗乳腺癌的藥效作用。在體外，納米雄黃能抑制乳腺癌4T1細(xì)胞的遷移和侵襲相關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)和MMP-9的表達(dá)。納米雄黃治療乳腺癌模型小鼠32 d后，肺、肝轉(zhuǎn)移較對照組明顯減少，同時腫瘤組織中與侵襲性密切相關(guān)的MMP-2和MMP-9表達(dá)下調(diào)。李秀榮等[15]用不同濃度納米雄黃處理乳腺癌MCF-7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)納米雄黃可通過上調(diào)E-cad、下調(diào)HIF-1α，抑制Snail mRNA轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而發(fā)揮抗乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。

4.2納米雄黃抗白血病的作用研究 APL是急性髓系細(xì)胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)的M3亞型。Fang等[16]使用雄黃和(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin-gallate，EGCG)制備了平均粒徑為(200.30±1.23)nm的表沒食子兒茶素沒食子酸酯裝載的納米雄黃(Nano-realgar Encapsulated in EGCG，EGCG-RNPs)。EGCG-RNPs在體外可以顯著抑制APL細(xì)胞系HL-60細(xì)胞的生長。通過HL-60細(xì)胞的吸收和外排實驗證明，EGCG-RNPs增強雄黃其抗腫瘤作用機制可能與增加HL-60細(xì)胞對雄黃的攝取及延長雄黃在HL-60細(xì)胞中的滯留時間有關(guān)。

慢性髓細(xì)胞性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是22號染色體長臂上的Bcr基因易位到9號染色體長臂，與Abl基因融合形成Bcr-Abl融合基因。Bcr-Abl融合基因表達(dá)的BCR-ABL蛋白具有高酪氨酸激酶活性，進(jìn)而導(dǎo)致了下游信號通路的改變，使細(xì)胞分化和凋亡受阻，從而引起CML發(fā)生[17]。研究表明，納米雄黃可以通過誘導(dǎo)BCR-ABL蛋白泛素化降解抑制CML細(xì)胞增殖達(dá)到治療CML的目的。Shi等[18]發(fā)現(xiàn)，納米雄黃除可有效誘導(dǎo)BCR-ABL蛋白降解外，還具有抑制PI3K/Akt/mTOR通路，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而抑制CML細(xì)胞增殖，并促進(jìn)CML細(xì)胞分化的作用。這其中小窩蛋白1(caveolin-1，Cav-1)可能介導(dǎo)了納米雄黃內(nèi)吞及誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡和自噬的作用。研究表明，過表達(dá)Cav-1的細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)明顯提高，同時細(xì)胞對納米雄黃的敏感性也顯著增強。

4.3納米雄黃抗肺癌的作用研究 Tian等[19]發(fā)現(xiàn)，納米雄黃對肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞具有顯著的生長抑制作用，并且具有時間-劑量效應(yīng)。王巍煒等[20]的研究表明，納米雄黃可以有效誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，同時抑制其轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白整合素β1(integrin β1)和上皮鈣黏素(cadherin)的表達(dá)。王勝玫等[21]以聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP) K30為載體，通過生物模板法制備雄黃納米粒，可抑制 A549細(xì)胞的增殖，通過降低細(xì)胞內(nèi)固有的凋亡抑制蛋白IAP家族成員survivin的表達(dá)，有效誘導(dǎo)肺癌A549 細(xì)胞凋亡。李慧杰等[22]研究表明，納米雄黃可抑制肺癌干細(xì)胞代謝重編程關(guān)鍵因子 HIF-1α mRNA 表達(dá)，并下調(diào) C-myc mRNA，上調(diào) p53 mRNA 表達(dá)，抑制相關(guān)蛋白 PI3K、Akt、mTOR、GLUT1、PDK1、PFK、PKM、PDH、LDH的表達(dá)，且具有劑量依賴效應(yīng)。Yang等[23]也發(fā)現(xiàn)，納米雄黃可抑制肺癌干細(xì)胞活力，促進(jìn)糖代謝，并以時間和劑量依賴的方式抑制代謝重編程相關(guān)蛋白表達(dá)，其機制可能是下調(diào)HIF-1α和PI3K/Akt/mTOR通路的表達(dá)。

4.4納米雄黃抗卵巢癌的作用研究 馬淑云等[24]在卵巢癌細(xì)胞系COC1細(xì)胞上評價了納米雄黃對卵巢癌的藥效作用，發(fā)現(xiàn)納米雄黃主要通過抑制Bcl-2蛋白表達(dá)、上調(diào)Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗卵巢癌作用。秦艷等[25]使用SKOV3細(xì)胞驗證了納米雄黃抗卵巢癌的藥效作用，作用機制也主要與降低Bcl-2/Bax比值，誘發(fā)細(xì)胞凋亡相關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)，納米雄黃主要是抑制了卵巢癌細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)、上調(diào)Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)發(fā)揮誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的藥效作用。

綜上所述，納米雄黃在臨床及基礎(chǔ)研究中已展示出對某些類型的腫瘤具有一定的療效。同時，由于與現(xiàn)行化療藥物沒有交叉耐藥，可與其他諸如細(xì)胞毒性化療藥、靶向藥物或免疫類藥物聯(lián)合使用，在提高療效的同時，可以延緩或抑制腫瘤耐藥的發(fā)生。但目前對納米雄黃的抗腫瘤作用機制和毒性評價仍不完善，需要繼續(xù)深入研究，為進(jìn)一步開發(fā)以納米雄黃為基礎(chǔ)的抗腫瘤藥物奠定理論和實驗基礎(chǔ)。